Yöntem makalesi

Nöromusküler hastalığın fare modellerinin davranışsal phenotyping için düşük maliyetli yürüyüş analizi

DOI:

10.3791/59878

⸱

18 Temmuz 2019

 ,  ,  , 
1Department of Neurology, Duke University School of Medicine, 2Duke Center for Neurodegeneration & Neurotherapeutics, Duke University School of Medicine, 3Biomedical Sciences Graduate Program, University of California San Diego, 4Department of Neurobiology, Duke University School of Medicine, 5Department of Cell Biology, Duke University School of Medicine

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ayak izi analizi farelerde hareket anomalilerini ölçerek araştırmacılar için dijıtleştirilmiş yürüyüş analiz programlarına düşük maliyetli bir alternatiftir. Hız, basitlik ve uzunlamasına potansiyel nedeniyle, fare modellerinin davranışsal fenotiplemeyi için idealdir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvan lokomotif ölçümü, belirli bir hastalığın, yaralanmanın veya ilaç modelinin fenotipini tanımlamak için kullanılan ortak bir davranış aracıdır. Burada gösterilen yürüme analizinin düşük maliyetli yöntemi, duvar modellerinde yürüyüş anomalilerinin basit ama etkili bir ölçüsüdür. Ayak izleri toksik olmayan yıkanabilir boya ile bir fare ayakları boyama ve konu kağıt bir levha üzerinde bir tünelden yürümek izin tarafından analiz edilir. Test tünelinin tasarımı, doğal fare davranışından ve küçük karanlık yerlerin yakınlık avantajlarından yararlanır. Adım uzunluğu, adım genişliği, ve Toe Spread her fare kolayca bir cetvel ve bir kalem kullanılarak ölçülür. Bu iyi kurulmuş ve güvenilir bir yöntemdir ve dijital sistemlere benzer çeşitli ölçümler üretir. Bu yaklaşım, fenotip sunumunda erken dönemde yapılan değişiklikleri algılamak için yeterli hassastır ve non-invaziv yaklaşımı nedeniyle, yaşam açıklığı veya fenotipik sunum arasında grupların test edilmesini sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lokomotasyon karmaşık nörolojik ve kas-iskelet koordinasyonunu gerektirir, ve motor yollarının tek bir yönü içinde açıkları gözlemlenebilir yürüyüş anomalileri üretebilir1,2. Yürüyüş analizi, belirli bir hastalığın, yaralanmanın veya ilacın bir hayvanın hareketini3' ün nasıl etkilediği konusunda ölçülebilir davranış verileri sağladığı için, fare modellerini test ederek araştırmacılar için kritik bir araçtır. Ancak, sayısallaştırılmış yürüyüş analizi bir koşu bandı, bir kamera satın almak ve ilgili yazılım, hangi yasak araştırmacılar için pahalı olabilir gerektirir. Yürüme Analizi genellikle motor fonksiyonunda uzunlamasına değişiklikleri izlemek için zaman zaman kullanılır, dolayısıyla spor4kullanıldığında harcamalar haklı zor olabilir. Dijitalleştirilmiş analizler basit ayak izi analizinden daha ayrıntılı yürüyüş ölçümleri sağlayabilse de, bu daha karmaşık önlemler her zaman gerekli veya davranışsal fenotip5karakterizasyonu için uygun değildir.

Burada düşük maliyetli manuel ayak izi analizi yöntemi, sayısallaştırılmış yürüme Analizi programları6,7hızlı ve hassas bir alternatif olarak sunuyoruz. El ayak izi analizi, murine hastalığı modellerinin çok sayıda önemli yürüyüş farklılıkları algılamak için gösterildi4,7,8,9,10,11 ,12,13,14,15,16,17, ve en az bir durumda, bu düşük maliyetli Yöntem yürüyüş değişiklikleri tespit ortak dijıtleştirilmiş yürüme analizi programı tarafından algılanmadı12. Malzemelerin toplam maliyeti nominal, ve kolayca diğer kemirgen araştırma modelleri adapte edilebilir.

Veri çizilebilir birçok farklı yürüyüş ölçümleri olsa da, biz tarif yöntemi üç özel ölçümleri odaklanır: adım uzunluğu, adım genişliği (aka "parça genişliği"), ve Toe Spread. Değerlendirilecek parametreler modeli model temelinde belirlenmelidir dikkat etmek önemlidir. Bu yürüyüş analizi yöntemi, bilişsel işlevi ölçmek için tasarlanmamıştır ve yürüyüş16' nın kompleks biyomekanik ölçümleri gerektiren çalışmalar için önerilmez.

Motor nöron dejenerasyonu ve kas atrofisi ile karakterize nöromüsküler bir hastalık olan X-bağlantılı spinal ve bulbar kas atrofisi (SBMA) modelleme öncesi ve sonrası semptomatik farelerden oluşan bir kohort yoluyla davranış verilerini sunuyoruz. Bu fareler, diğer hastalığa özgü fenotiplerin başlangıcına denk gelen yürüme içinde Progressive açıkları geliştirir. Bu, bu yöntemin geçerliliğini ve özgüllüğünü gösterir ve etkilenen ve etkilenmeyen hayvanlar arasında güvenilir bir şekilde ayrımcılık yapılacağını doğrular.

Bu çalışmada deneysel fareler, C57BL/6 arka planda (nexpt= 12) 2,5 (önceden semptomatik) ve 9 aylık (sonrası SEMPTOMATIK) Bac fxAR121 transjenik fareler idi. Bu model bizim laboratuvarımızda oluşturulan ve tamamen SBMA9güçlü bir fare modeli olarak karakterize edilmiştir. Transgenik olmayan Littermates kontrol olarak kullanıldı (nCTRL= 8). SBMA, sadece erkeklerde tam olarak ortaya çıkmış seks sınırlı bir hastalıktır, bu nedenle erkek fareler bu çalışma için özel olarak kullanılmıştır. Planlama aşamalarında, araştırmacılar dikkate Grup boyutları ve kompozisyon18belirlemek için biyolojik bir değişken olarak cinsel sağlık 's hususlar Ulusal Enstitüleri almak gerekir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fareler ile yapılan tüm testler Duke Üniversitesi Kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi (ıANUC) tarafından incelendi ve onaylanmıştır. Test ve skorlama sorumluluğundan sorumlu personel, tüm kohort için yürüyüş analizi ve bildiri skorları tamamlanıncaya kadar hayvan genotipi veya deneysel durumda kör edilmelidir.

1. test malzemesi hazırlama

  1. 0,375 inç kalınlığında 3 ön kesme şeffaf akrilik panelden inşa edilmiş bir tünel ile test yapın. Özellikle akrilik bağlar ve kurutulmuş kokular yaymaz bir dolgu panelleri ile birlikte paneller yapıştırarak tünel birleştirin.
    1. Standart C57BL/6 fareler için, aşağıdaki tünel ölçümlerini kullanın: 2,5, geniş, 3 in. yüksek ve 13 in. uzunluğunda. Fareler, tünelden rahatça yürüyebilir ve yürüyüşün ölçülmesi için yeterli basamak (> 4) alabilir.
  2. Önceden kesilmiş gri akrilik paneller 0,375 inç kalınlığında, tünel üzerinde kullanılan aynı sızdırmazlık maddesi ile birlikte yapıştırılmış ile hedef odası inşa. Odanın iç ölçümleri 4 in. genişliğinde, 4 in. uzunluğunda ve 3 in. boyunda. Bu odanın açılışında tünelin açılması ile eşleşir (2,5. Wide x 3,0 içinde. Tall). Fareler doğal olarak karanlık alanları iyi aydınlatılmış alanlara tercih ettiği için opak ve koyu renkte olan malzemeyi kullanın.
  3. Kalın ve pürüzsüz adımları izlemek için kağıt kullanın (suluboya kağıt iyi çalışır). Kesim bireysel kağıt şeritler biraz daha geniş ve genişlik ve Tünel uzunluğu daha uzun olacak. Burada açıklanan tünel boyutlarını kullanırsanız, 3,5 ' ye kadar uzun süre 15 ' e kadar kağıt kesebilir.
  4. Toksik olmayan yıkanabilir su bazlı boya iki zıt renk (örneğin, yeşil ve mor) kullanın. Arka ekstremite için bir renk atayın, ikinci bir forelimbs için. Fareler test ettikten sonra ayaklarından kalan boya yalayacak, bu yüzden seçilen boya tamamen non-toksik olmalıdır.
  5. İki yuvarlak varil boya fırçaları, her boya rengi için bir tane kullanın (~ 0,5 cm çap, konik/sivri fırça ucu).
  6. Milimetre olarak işaretler içeren bir cetvel ve 0,1 mm 'ye kadar ölçümlere sahip bir Kaliper seçin. kalem Puanlama kağıtları üzerine yazmak için tavsiye edilir.
  7. Opsiyonel: yüksek anksiyete veya düşük motivasyonlu hayvanlar için hedef odasında davranışsal bir teşvik sağlar. Bu sterilize Ayçiçeği tohumları küçük miktarlarda içerebilir (ev kafesi yerleştirilir 2 habituation izin test önce gün). Test gününde, fare durdurmak olmadan yürüymek için teşvik etmek için gol odasının içine ayçiçeği tohumu yerleştirin.

2. veri toplama

  1. Eğer test ayrı bir odada gerçekleştiriliyorsa, fareleri 30 dakika boyunca yeni odaya atın ve sonra davranışsal testleri başlatın. Ayrıca, fareler doğal olarak gece olduğu için, tüm fareler tam uyanık ve uyarı test etmeden önce en az 5 dakika için emin olun.
  2. Tüneli kağıdın üzerine getirerek ve kağıdı fare KIMLIĞI ve test tarihi ile işaretleyerek test kurulumunu hazırlayın. Her iki açık uçları bağlayan, tünel sonunda hedef odası konumlandırın. Gerekirse motivasyon için tünel (hedef odası içinde) sonunda ayçiçeği tohumu ekleyin.
  3. Onun kafes test edilecek fareyi çıkarın ve sıkıca onun scruff tarafından kavrama, arka ekstremite hareketini stabilize etmek için kuyruk kavrama emin olun.
  4. Tüm ayak parmaklarının tüm alt ve ayak merkezi tamamen boya kaplıdır böylece forepaws boya. Onun arka pençeleri üzerinde boya zıt bir renk ile tekrarlayın. Fare, veri toplama müdahale olabilir lekeleri önlemek için temiz nemli bir bez ile vücudun diğer bölgelerinde alır herhangi bir boya silin.
    Not: fare işleme hayvan stres en aza indirmek için deneyimli araştırmacılar tarafından gerçekleştirilmesi gerekir.
  5. Tünel başlangıcında fareyi yerleştirin ve hedef odasına tüm yol yürümek için izin ve sonra fareyi almak, yavaşça bir su nemlendirilmiş bez ile ayaklarını silin ve ev kafesi geri dönün.
  6. Skorlama yapmadan önce ayak izleri ile kağıdın tamamen kurumasına izin verin. Her hayvan arasında etanol veya eşdeğer bir temizlik çözeltisi ile test alanı ve tünel silin.

3. puanlama kriterleri

  1. Puanlama için net, lekesiz ayak izleri ile sürekli olarak aralıklı adımları kullanın. Şekil 1B , puan alınabilir bir ayak izi dizisinin iyi bir örneğidir. Yeterli Puanlama verisi oluşturmak için her ayaktan en az 2 ardışık adım olmalıdır, ancak ayak başına 4-6 adım önerilir. İlk ve son ayak izlerini kağıda dahil etmeyin, çünkü fare yürüyüş hızını değiştirdiğinden normal yürüyüşü temsil etme olasılığı düşüktür.
  2. Bu yöntem kullanılarak analiz edilebilir yürüyüş üç farklı önlemler olarak adım uzunluğu, adım genişliği ve Toe Spread kullanın.
    Not: Stride uzunluğu ve genişliği, ön efoot bölgenin boya içinde iyi tanımlanmış olduğu net sıralı baskılar gerektirir. Toe Spread Puanlama için sıralı baskılar gerektirmez, tek bir ayak üzerinde ilk ve son ayak sadece net baskılar. Ancak, belirli bir ayak izi adım uzunluğu veya genişliği ölçümleri dahil değilse, bu Toe Spread için puan olamaz. Her üç önlem santimetrelik olarak değerlendirilir.
    1. Aynı ayak tarafından oluşturulan iki sıralı ayak izleri arasındaki uzaklık (örn. bir adım) (Şekil 1A, 1B) gibi adım uzunluğunu tanımlayın.
      1. Bir kalem ile, her iki forelimb ayak izi (yukarıda atanan renk ile tanımlanır) ön ayak bölgesi etrafında bir 2-4 mm daire çizin ve bir cetvel kullanarak aralarında bir çizgi çizin.
      2. Her dairenin ortasından iki baskı arasındaki mesafeyi (yani her bir ayak pedi Merkezi) right-Fore 1 (RF1) veya sol-Fore 1 (LF1) olarak kaydedin.
      3. Puan alınabilir tüm adımlar için yineleyin (RF2, LF2, RF3, LF3 vb.).
      4. Sağ ve sol arka ekstremite ayak izleri için tekrarlayın.
      5. Her ekstremite için tüm bireysel kaydedilmiş adımlarda ortalama. İstatistiksel analizler için bireysel kohort üyeleri birlikte ortalamas edilebilir.
    2. Sol ve sağ ön ayakları veya arka ekstremite arasındaki uzaklık ölçüsü olarak adım genişliğini tanımlayın (Şekil 1A, 1B).
      1. Bu mesafeyi değerlendirmek için, bir arka-ekstremite Circled önefoot bölgesinden bir çizgi çizin ve ölçmek, kontralateral arka ekstremite üzerinde adım uzunluğu için çizgi ile dik kesişen.
      2. Bu, puanlanmış olabilir tüm arka ekstremite baskılar için tekrarlayın ve sonra ölçümleri ortalama. Adım genişliği için hesaplama yöntemi ön ve arka-ekstremite için aynıdır.
    3. Tek bir ön veya arka ekstremite ayak izi ilk ve son ayak arasındaki mesafe olarak Toe Spread tanımlayın (Şekil 1a, 1B).
      1. İlk ayak baskı ucu ve son parmak baskı ucu arasındaki mesafeyi ölçmek için kaliperleri kullanın.
      2. Puanlandırılabilir ve ölçümleri ortalama tüm arka ekstremite baskılar için tekrarlayın. Toe Spread için hesaplama yöntemi ön ve arka-ekstremite için aynıdır.
  3. Kağıt puan alınamıyor, tekrar denemeden önce hayvanın 10 dakika dinlenmesine izin verin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yeterli sayıda hayvan ile, bu prosedür, zaman içinde aynı gerilme içinde fare genotipleri arasında yürüyüş farklılıkları tespit yeteneğine sahiptir. Şekil 1B , düşük motor nöronları ve iskelet kaslarını etkileyen bir nörodejeneratif bozukluk olan X bağlantılı omurilik ve bulbar kas atrofisi (SBMA) fare modelini kullanarak laboratuvarımızda toplanan ayak izi görüntülerinin temsili izlerini gösterir. Daha önce erkek Bac fxAR121 transgenik fareler önemli kilo kaybı, kavrama mukavemeti bozuklukl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yukarıda açıklanan düşük maliyetli yürüyüş analizi yöntemini kullanarak, SBMA BAC fxAR121 fare modelinde Post-semptomatik yaşlarda yürüyüş disfonksiyon çeşitli parametrelerin başarılı bir şekilde tanımlanmasını göstermektedir. Adım uzunlukları azalma fare modelleri ve insan hastaları önceki SBMA çalışmaları ile tutarlı9. Ayrıca ilk kez, transgenik olmayan litre kontrollerine kıyasla semptomatik SBMA farelerinde arka ekstremite ayak yayında önemli farklar olduğunu gösteriyoruz. İlginçtir, arka ayak...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, hayvan tanımlama Yardımı için A.M. 'e teşekkür etmek istiyor. Bu çalışma ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01 7 RF1 AG057264 için A.R.L.S. ve C.J.C. ve R01 NS100023 A. R. L. S) ve kas distrofi Derneği (A.R.L.S. için temel araştırma Grant, C.J.C. geliştirme Grant) tarafından destekleniyordu.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Kalipern/an/a0,1 mm'ye kadar işaretlere sahip olmalıdır
Craft GlueE6000n/a
Ayak İzi Boyası (Tempera Boya)Artmindn/atoksik olmamalıdır
Yuvarlak Namlulu Boya FırçalarıSymply Simmonsn/a0,5 cm çap
Cetveln/an/amilimetreye
kadar işaretlere sahip olmalıdırPuanlama Kağıdı (Suluboya Pedleri)Cansonn/aboyutuna göre kesim
Tünel ve Kale OdasıInterstate Plasticsn/aboyutuna göre kesim

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Clarke, K. A., Still, J. Development and consistency of gait in the mouse. Physiology & Behavior. 73 (1-2), 159-164 (2001).
  2. Mendes, C. S., et al. Quantification of gait parameters in freely walking rodents. BMC Biology. 13, 50(2015).
  3. Carter, R. J., Morton, J., Dunnett, S. B. Motor coordination and balance in rodents. Current Protocols in Neuroscience. , Chapter 8 Unit 8 (2001).
  4. Tillerson, J. L., Caudle, W. M., Reveron, M. E., Miller, G. W. Exercise induces behavioral recovery and attenuates neurochemical deficits in rodent models of Parkinson's disease. Neuroscience. 119 (3), 899-911 (2003).
  5. Pallier, P. N., Drew, C. J., Morton, A. J. The detection and measurement of locomotor deficits in a transgenic mouse model of Huntington's disease are task- and protocol-dependent: influence of non-motor factors on locomotor function. Brain Research Bulletin. 78 (6), 347-355 (2009).
  6. Sugimoto, H., Kawakami, K. Low-cost Protocol of Footprint Analysis and Hanging Box Test for Mice Applied the Chronic Restraint Stress. Journal of Visualized Experiments. (143), (2019).
  7. Carter, R. J., et al. Characterization of progressive motor deficits in mice transgenic for the human Huntington's disease mutation. Journal of Neuroscience. 19 (8), 3248-3257 (1999).
  8. Barlow, C., et al. Atm-deficient mice: a paradigm of ataxia telangiectasia. Cell. 86 (1), 159-171 (1996).
  9. Cortes, C. J., et al. Muscle expression of mutant androgen receptor accounts for systemic and motor neuron disease phenotypes in spinal and bulbar muscular atrophy. Neuron. 82 (2), 295-307 (2014).
  10. D'Hooge, R., et al. Neuromotor alterations and cerebellar deficits in aged arylsulfatase A-deficient transgenic mice. Neuroscience Letters. 273 (2), 93-96 (1999).
  11. Fernagut, P. O., Diguet, E., Labattu, B., Tison, F. A simple method to measure stride length as an index of nigrostriatal dysfunction in mice. Journal of Neuroscience Methods. 113 (2), 123-130 (2002).
  12. Guillot, T. S., Asress, S. A., Richardson, J. R., Glass, J. D., Miller, G. W. Treadmill gait analysis does not detect motor deficits in animal models of Parkinson's disease or amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Motor Behavior. 40 (6), 568-577 (2008).
  13. Harper, S. Q., et al. RNA interference improves motor and neuropathological abnormalities in a Huntington's disease mouse model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (16), 5820-5825 (2005).
  14. Lin, C. H., et al. Neurological abnormalities in a knock-in mouse model of Huntington's disease. Human Molecular Genetics. 10 (2), 137-144 (2001).
  15. Sopher, B. L., et al. Androgen receptor YAC transgenic mice recapitulate SBMA motor neuronopathy and implicate VEGF164 in the motor neuron degeneration. Neuron. 41 (5), 687-699 (2004).
  16. Tillerson, J. L., Caudle, W. M., Reveron, M. E., Miller, G. W. Detection of behavioral impairments correlated to neurochemical deficits in mice treated with moderate doses of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine. Experimental Neurology. 178 (1), 80-90 (2002).
  17. Wheeler, V. C., et al. Early phenotypes that presage late-onset neurodegenerative disease allow testing of modifiers in Hdh CAG knock-in mice. Human Molecular Genetics. 11 (6), 633-640 (2002).
  18. Clayton, J. A., Collins, F. S. Policy: NIH to balance sex in cell and animal studies. Nature. 509 (7500), 282-283 (2014).
  19. Maricelli, J. W., Lu, Q. L., Lin, D. C., Rodgers, B. D. Trendelenburg-Like Gait, Instability and Altered Step Patterns in a Mouse Model for Limb Girdle Muscular Dystrophy 2i. PLoS One. 11 (9), e0161984(2016).
  20. Castelhano-Carlos, M. J., Sousa, N., Ohl, F., Baumans, V. Identification methods in newborn C57BL/6 mice: a developmental and behavioural evaluation. Lab Animals. 44 (2), 88-103 (2010).
  21. Lakes, E. H., Allen, K. D. Gait analysis methods for rodent models of arthritic disorders: reviews and recommendations. Osteoarthritis Cartilage. 24 (11), 1837-1849 (2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Ayak zi AnaliziAd m Uzunlu uAd m Geni li iParmak A klNon nvaziv Y ntemD k Maliyetli Teknik

İlgili makaleler