Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Canlı Hücrelerde Fura-2-Analog Ile Hücre İçi Ca2+ Ölçümü için Yeni Nikotinamid Adenin Dinükleotid Düzeltme Yöntemi

5.8K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/59881

⸱

20 Eylül 2019

 ,  ,  , 
1Department of Physiology, University of Ulsan College of Medicine/Asan Medical Center, 2Asan Medical Center, 3Asan Medical Institute of Convergence Science and Technology

Bu makalede

Özet

NADH ve fura-2 analoglarının uyarma ve emisyon dalga boylarının spektral örtüşmesi nedeniyle, canlı hücrelerdeki her iki kimyasaldan gelen sinyal paraziti [Ca2+]'ün kantitatif ölçümü sırasında kaçınılmazdır. Böylece, [Ca2+] ölçmek için NADH sinyal girişiminin yeni bir çevrimiçi düzeltme yöntemi geliştirilmiştir.

Özet

[Ca2+] kantitatif olarak ölçmek için, oranmetrik floroprobolan fura-2 analogları sıklıkla kullanılır. Ancak, boya kullanımı doğal olarak canlı hücrelerde otofloresan girişim nedeniyle sınırlıdır, özellikle nikotinamid adenin dinükleotid (NADH). Daha spesifik olarak, nadh çoğunluğu mitokondri olduğu için kantitatif fura-2 analogları kullanarak mitokondriyal [Ca2 +] ölçerken bu önemli bir engeldir. Floresan boya konsantrasyonu aynı ise, belirli bir uyarma yoğunluğu aynı emisyon yoğunluğu nu üretmelidir. Bu nedenle, iki farklı uyarma dalga boylarının emisyon yoğunluğu oranı sabit olmalıdır. Bu ilkeye dayanarak, [Ca2+] ölçmek için NADH sinyal girişiminin yeni bir çevrimiçi düzeltme yöntemi geliştirilmiş ve NADH ve fura-2'nin gerçek sinyal yoğunluğu elde edilmiştir. Ayrıca, [Ca2+] hesaplamak için yeni bir denklem izosbestik uyarma veya uyarma ile geliştirilmiştir 400 nm. Bu yöntemle mitokondriyal [Ca2+] değişiklikleri başarıyla ölçülebilir. Buna ek olarak, uyarma ve emisyon dalga boylarının farklı bir kümesi ile, NADH, [Ca2+], ve pH veya mitokondriyal membran potansiyeli(M)dahil olmak üzere birden fazla parametre aynı anda ölçülebilir. Mitokondriyal [Ca2+] vem veya pH fura-2-FF ve tetrametetirodanin etil ester (TMRE) veya karboksi-seminaphtorhofluor-1 (karboksi-SNARF-1) kullanılarak ölçüldü.

Giriş

Hücre içi Ca2+'nın önemli rolü yaygın olarak bilinmektedir1. [Ca2+] ölçülmesi hücresel fizyolojik fonksiyonların süreçlerini anlamak için gereklidir. Fura-2 analogları UV aralığında (<400 nm) heyecanlı oldukları ndan oldukça yararlıdır ve kantitatif ölçüm için oranmetrik yöntem uygulanabilir. Bu nedenle, pH, membran potansiyeli, vb gibi diğer fizyolojik parametreler, diğer floresan boyalar ile ölçülebilir. Mitokondriyal Ca2+ konsantrasyonu ([Ca2+]m) aralığı nın 0,08−20 μM2,3,4,5olduğu bildirildi. fura-2 analogları arasında fura-2-FF bu aralığı ölçmek için uygundur [Ca2+]. Ancak, canlı hücreler ne yazık ki metabolik süreçleri için NADH / NADPH içerir, ve NADH fura-2 analog ile örtüşen uyarma ve emisyon spektrumları nedeniyle sinyal girişim üretir. Bu girişim fura-2 analoglarının kullanımını büyük ölçüde sınırlar. Özellikle, analog mitokondriyal [Ca2 +] ölçmek için uygulanırsa, nadh en yüksek miktarda mitokondri olduğu için bu girişim en büyük engeldir. Bu durum, NADH değişikliklerinin mitokondriyal membran potansiyeli ile ilgili olması(M )veM m'nin değişmesi [Ca2+]m6,7,8 , 9- Ayrıca [Ca2+]m dinamiği nin incelenmesi için NADH, M m ve pH gibi diğer mitokondriyal parametrelerin durumunu bilmek esastır.

353 nm, 361 nm ve 400 nm'de uyarma ile 450 nm ve 500 nm'deki emisyonlar NADH ve fura-2-FF'den gelen sinyalleri içerir ve denklemler aşağıdaki gibidir. Burada, 353 nm ve 361 nm 450 nm ve 500 nm emisyonlar için fura-2-FF sozobestik noktaları, sırasıyla vardır.

F361.450 = F361.450,NADH + F361.450,Fura Denklemi 1
F353.500 = F353.500,NADH + F353.500,Fura Denklemi 2
F400.500 = F400.500,NADH + F400.500,Fura Denklemi 3

fx,y x-nm uyarma ile y-nm'de ölçülen emisyon yoğunluğu, Fx,y,NADH saf NADH bağımlı emisyon yoğunluğunu temsil eder ve Fx,y,Fura saf fura-2-FF bağımlı emisyon yoğunluğunu temsil eder. Floresan boya aynı konsantrasyon altında, belirli bir uyarma yoğunluğu aynı emisyon yoğunluğu üretmelidir. Bu nedenle, iki farklı uyarma dalga boylarının emisyon yoğunluğu oranı sabit olmalıdır. Ca2+ ve fura-2 NADH floresan özelliklerini etkilemedi; bu nedenle, 450 nm ve 500 nm NADH emisyon oranı herhangi bir uyarma dalga boyunda sabitti. Aynı kural, NADH veya [Ca2+] fura-2-FF'nin emisyon ve uyarma spektrumlarını etkilemediği varsayımına dayanarak fura-2-FF için de kullanılabilir. Ancak, Ca2+ fura-2-FF emisyonunun spektral kaymasına neden oldu. Bu nedenle, Ca2+etkisini ortadan kaldırmak için, Ca2+bağımsız olan isosbestik uyarma, kullanılması gerekir. Her emisyon dalga boyu (yani, 450 nm ve 500 nm) farklı bir izosbestik noktaya sahiptir ve deneysel kurulumumuzdan, 500 nm'de 353 nm ve 450 nm'de 361 nm seçilmiştir. Bunlardan, aşağıdaki denklemler geçerli10.

Rf = F361.450,Fura/F353.500,Fura Denklemi 4
RN1 = F400.500,NADH/F361.450,NADH Denklemi 5
RN2 = F353.500,NADH/F361.450,NADH Denklemi 6

Bu sabitlerde aşağıdaki denklemler (Denklem 1) (Denklem 2) ve (Denklem 3) geçerlidir.

F361.450 = F361.450,NADH + Rf × F353.500,Fura Denklemi 7
F353.450 = RN2 × F361.450,NADH + F353.500,Fura Denklemi 8
F400.500 = RN1 × F361.450,NADH + F400.500,Fura Denklemi 9

Bu denklemlerden, Rf,RN1ve RN2 biliniyorsa, NADH ve fura-2'nin saf sinyalleri aşağıdaki gibi elde edilebilir.

F361.450,NADH = (F361.450 - Rf × F353.500)/(1 − Rf × RN2) Denklemi 10
F353.500,Fura = (RN2 × F361.450 − F353.500)/(Rf × RN2 − 1) Denklemi 11
F400.500,Fura = F400.500 − RN1 × F361.450,NADH Denklemi 12
RFura = F353.500,Fura/F400.500,Fura Denklemi 13

Fura-2-FF'nin Ca2+bağlı formu 400 nm uyarma dalga boyunda neredeyse floresan değildi. Bu özelliğe dayanarak, aşağıdaki yeni kalibrasyon denklemi türetilebilir.

[Ca2+] = Kd ] (F400.500,max/F353.500,max) × (RFura − Rdk) Denklem 14

Kd bir ayrışma sabiti olduğu yerde, F400,500,max ve F353,500,max, 500 nm'de yayılan sinyallerin maksimum değerleridir ve sırasıyla 400 nm ve 353 nm'de uyarma ile Rmin Ca 2'deki minimum RFura'dır. +-serbest durum. İzosbestik uyarmalar kullanıldığından, denklem aşağıdaki gibi basitleştirilmiş olabilir.

[Ca2+] = Kd • (1 / Rdk) • (RFura − Rdk) Denklem i15

Bu nedenle, [Ca2+]'yi hesaplamak için yalnızca Kd ve Rmin değerleri gereklidir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm deneysel protokoller yerel kurumsal hayvan bakım ve kullanım komitesi tarafından onaylandı.

1. Çözüm hazırlama

  1. Tek taze izole kardiyak miyosithazırlayın 11.
    NOT: Her laboratuvarda farklı bir hücre depolama çözümü olabilir. Burada miyositler kültür ortamında (DMEM) depolanır.
  2. 100 mL Ca2+içermeyen çözelti hazırlayın (Tablo 1).
  3. 50 mL'lik bir kabın içinde 50 mL kültür ortamı hazırlayın. Aliquot 5 mL ve 37 °C'de bir su banyosuna koyun. Kalan çözeltiyi oda sıcaklığında saklayın.
  4. 50 mL Ca2+içermeyen çözeltiye 5 mg saponin ekleyerek saponin çözeltisinin 50 mL'sini hazırlayın.
    NOT: Saponin kardiyak miyositleri permeabilize etmek, sitosolik bölmeleri çıkarmak ve sadece mitokondriyal floresansı görselleştirmek için kullanılır.
  5. 16 μL 1 mM fura-2-FF-AM dimetil sülfoksit (DMSO) çözünmüş hazırlayın.
    NOT: DMSO'da çözünmüş fura-2-FF-AM'in 1 mM stok çözeltisini ve 2 mL'lik bir tüpte aliquot 16 μL'yi yapın. Kullanıma kadar -20 °C'de saklayın.
  6. 50 mL NADH içermeyen Ca2+-free çözelti(Tablo 1)ve 50 mL NADH içermeyen Ca2+-doymuş çözelti(Tablo 1)isosbestik noktalar ölçülecek. KOH ile pH'ı 7.0'a ayarlayın.
    NOT: NADH içermeyen Ca2+-free solution (Tablo 1) mitokondride NADH'yi en aza indirmek için herhangi bir mitokondriyal substrat olmadan 10 μM FCCP ve 100 μM ADP içerir.
  7. 50 mL Ca2+serbest çözelti, 50 mL malate çözeltisi, 50 mL pirüuvat çözeltisi, 50 mL malate-pirüuvat çözeltisi ve NADH düzeltme faktörü ölçümleri için kullanılacak 50 mL rotenon çözeltisi hazırlayın(Tablo 1).

2. Floroprob yükleme prosedürü mitokondri içine

  1. 1 mM fura-2-FF-AM'in 16 μL'sine 2 mL kültür ortamı ekleyerek boya yükleme çözeltisini hazırlayın.
    NOT: Floresan boya ışık altında kırılgandır. Çözeltiyi kullanmadan hemen önce hazırlayın. Floresan boya içeren çözeltiyi karanlık bir yerde saklayın. Fura-2-FF-AM'in son konsantrasyonu 8 μM'dir. Karboksi-SNARF-1 kullanıldıysa, boya yükleme çözeltisini 2 μM karboksi-SNARF-1-AM ile hazırlayın.
  2. İzole edilmiş hücrelerin 2 mL'sini alın ve 5 mL'lik bir test tüpüne dik bir pozisyonda yerleştirin.
  3. Miyositlerin dibe batması ve supernatant'ı çıkarması için 15 dk bekleyin.
    NOT: Supernatant hücre enkazı içerebilir. Hücre hasarını önlemek için tüpü santrifüj etmeyin.
  4. Boya yükleme çözeltisinin 2 mL'sini ekleyin.
  5. Boya yükleme çözeltisini 4 °C'de 60 dk boyunca hücrelerle kuluçkaya yatırın.
  6. Daha sonra test tüpünü 37 °C'lik bir su banyosuna 30 dk dik bir pozisyonda koyun.
  7. Supernatant çıkarın ve 37 °C önceden ısıtılmış kültür orta 4 mL ekleyin. Hücreleri 37 °C'lik bir su banyosunda 60 dakika kuluçkaya yatırın.
  8. Son olarak, supernatant çıkarın, oda sıcaklığında kültür orta 4 mL ekleyin ve oda sıcaklığında tüp tutun.

3. Multiparametrik ölçüm sisteminin tanıtılması

NOT: Şekil 1 tüm sistemin diyagramını gösterir.

  1. Bir uyarma ışık kaynağı için, 3 ms içinde ışığı değiştirebilirsiniz hızlı bir monochromator (polikrom II) kullanın.
  2. Sinyal yoğunluğunu artırmak için ters mikroskopa sahip bir yağ daldırma lensi (40x, NA 1.3) kullanın.
  3. Floresan sinyal paraziti olmadan nesne alanını izlemek için yakın kızılötesi filtre ve şarjla birleştirilmiş aygıt (CCD) kamera kullanın.
  4. Alanı almak için nesne alan görüntüsünü yakalayın.
  5. Arka planı azaltmak için hücreyi göstermek için monitör ekranındaki nesne alanını bir alan diyaframı ile ayarlayın.
  6. Foton sayma yöntemiyle emisyon dalga boylarını tespit etmek için her bant geçiş filtresine (450, 500, 590 ve 640 nm) sahip dört fotoçarpan tüpü kullanın. Bölmek ve emisyon ışığı yönlendirmek için uygun dikroik aynalar kullanın.
    NOT: Uyarma ışığı emisyon ışığına göre çok güçlüdür. Böylece, arka planı azaltmak için en yüksek engelleme özelliklerine sahip bant geçiş filtresini seçin. Foton sayma sistemi, PMT'ler, foton sayıcı üniteleri ve yüksek hızlı sayaçların bir kombinasyonunu içerir. Sistemi kontrol etmek ve verileri örneklemek için özel yapım bir sürüş yazılımı kullanılmıştır. Bu yöntemi diğer sistemlerle uygulamanın bir yolunu bulmak gereklidir.

4. Multiparametrik ölçüm sistemi ile NADH düzeltme yöntemleri

  1. Fura-2-FF'nin sitbestik noktalarının yerinde tanımlanması.
    NOT: Birçok rapor hücrelerde floresan özelliklerinin değiştiğini belirtmiştir. Bu nedenle, yerinde girişim düzeltmek için parametreleri elde etmek için tüm yordamları gerçekleştirin.
    1. Boya yüklü hücreyi mikroskoba monte edin ve hücreleri dibe batırmak için 3 dakika bekleyin.
      NOT: 40x objektif lens ile bir nesnel alan başına bir hücre etrafında görmek için hücre numaralarını ayarlayın.
    2. NADH içermeyen Ca2+içermeyen çözeltiyi 37 °C'de perfuse.
    3. Hücreyi hedefledikten sonra, bölüm 4.1'de gösterildiği gibi hücresiz arka planı ve hücre alanını ölçün. Hücre alanından hücre arka planını hesaplayın.
      NOT: Her deneyde her iki arka plan sinyalide de düzeltilmesi gerekir.
    4. Saponin çözeltisini 60 s'lik perfuse ve NADH içermeyen Ca2+-free çözümüne geri dönün.
    5. Fura-2-FF'nin yayılan sinyalleri aynı anda 350 nm'den 350 nm'ye, 0,1 nm adımla 365 nm'ye çıkararak ölçün.
    6. NADH içermeyen Ca2+doymuş çözeltiyi perfuse ve adım 4.2.5 tekrarlayın.
    7. Ca2+-doymuş çözeltideki sinyalleri Ca2+serbest koşullardaki sinyallerden çıkarın.
    8. 4.2.2'den 4.2.7'ye kadar olan işlemleri diğer tek kardiyak miyositlerle tekrarlayın.
      NOT: Sinyal yoğunluğu zayıflarsa, 4.2.1'den tekrarlayın. En az 5 farklı hücre için prosedürü tekrarlayın.
    9. Elde edilen tüm sinyallerden, her uyarmadaki emisyonun standart sapmalarını hesaplayın ve izosbestik nokta olarak minimum standart sapma (SD) değerini gösteren uyarma dalga boyu seçin.
      NOT: Temsili rakamlar Şekil 2'degösterilmiştir.
  2. Arka plan sinyal algılama ve hücre alanı ile düzeltme yöntemleri
    NOT: Arka planlar iki tür vardır. Biri hücrelerden, diğeri ise kapak kapağındaki yansımadan (hücresiz arka plan) gelir. Her iki arka planın da her denemede düzeltilmesi gerekir.
    1. Boyasız hücreleri banyoya mikroskoba monte edin ve hücreleri dibe batırmak için 3 dakika bekleyin. Yaklaşık 5 dakika boyunca NADH içermeyen Ca2+ücretsiz çözüme perfuse.
      NOT: Tüm çözelti perfüzyon hızı 37 °C'de 2-3 mL/dk'dır.
      NOT: 40x objektif lens ile bir nesnel alan başına bir hücre etrafında görmek için hücre numaralarını ayarlayın.
    2. Nesne alanını hedeflenen hücreyi kapsayacak şekilde ayarlayın.
    3. Hücreyi alanın dışına çıkardıktan sonra, hücresi olmayan pencerenin arka plan sinyallerini ölçün ve uzaklık olarak ayarlayın.
      NOT: Sinyal, foton sayma sisteminde tespit edilecek ışık sinyali anlamına gelir.
    4. Hücreyi ilk konuma döndürün ve hücre arka plan sinyallerini ve hücre alanını ölçün.
      NOT: Uyarma ışığı bandpass filtresi ile filtre edilse de, yine de oldukça büyük miktarda filtrelenmiş ışık içerir. Bu ışık hücrelere çarptığında dağılır ve foton sayma sistemi son derece hassas olduğu için önemli bir arka plan sinyaline neden olur. Düzeltilmesi gerekiyor.
      NOT: Hücre alanı yakalanan bir hücre görüntüsü ve kullanılabilir bir görüntüleme yazılımı ile hesaplanabilir. Hücre alanının birimi piksel sayısı da dahil olmak üzere herhangi bir birim olabilir. Sadece standardizasyon gereklidir.
    5. Hücre alanı ve hücre arka plan sinyalleri arasındaki ilişkiyi elde etmek için 10 kez 4.1.1'den 4.1.4'e kadar tekrarlayın.
      NOT: Daha sonra, hücre arka plan sinyalleri ilişkiden hücre alanından hesaplanabilir. Uyarma ampul yaşlanma haline yana, Bu prosedür, en azından, her ay tekrarlanması gerekir.
  3. R faktörlerinin ölçümü
    1. Bölüm 4.2'de elde edilen sinyallerden 4 denklemi ile Rf'yi hesaplayın.
    2. Boyaiçermeyen hücreleri mikroskoba monte edin ve Ca2+içermeyen çözeltiyi aşındırın.
    3. F361, 450, NADH,F400, 500, NADH, NADH, F361, 450, NADHve F353, 500, NADHgibi sinyalleri ölçün.
    4. Malate çözeltisini perfuse ve 4.3.3 tekrarlayın. ve sinyalleri ölçmek.
    5. Pirüvat çözeltisini perfüzyon ve 4.3.3 tekrarlayın. ve sinyalleri ölçmek.
    6. Malate-pirüuvat çözeltisini perperve 4.3.3 tekrarlayın. ve sinyalleri ölçmek.
    7. Rotenon çözeltisini perfuse ve tekrar 4.3.3. ve sinyalleri ölçmek.
      NOT: 5 mM pirüuvat, 5 mM malate artı 5 mM pirüuvat ve 10 μM rotenone ilavesi üzerinde kaydedilen NADH sinyali örneği Şekil 3'tegösterilmiştir.
    8. F361, 450, NADH vs F400, 500, NADH ve F361, 450, NADH vs F353, 500, NADHher eğimi hesaplayın. Şekil 3'tegösterildiği gibi . Her eğim RN1 ve RN2'yigösterir.

5. TMRE veya karboksi-SNARF-1 için uyarma ve emisyon ışığının seçimi

  1. Ek olarak mitokondriyal potansiyeli ölçmek için TMRE kullanılmışsa, 530 nm uyarma dalga boyu ve 590 nm emisyon dalga boyu kullanın.
  2. Karboksi-SNARF-1 ek olarak mitokondriyal potansiyelini ölçmek için kullanılmışsa, 540 nm uyarma dalga boyu ve 590 nm ve 640 nm12emisyon dalga boylarını kullanın.

6. Fura-2-FF'nin Kd değerinin seçimi

  1. pH değişimi ca2+ bağlama için Kd değerlerini etkileyebilir fura-2-FF10. Mitokondri için pH 7.5'te 5.28 Kd değerini kullanın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Düzeltme ye bağlı Mitokondriyal Ca2+ değişiklikleri10
Şekil 4 düzeltmeden önce ve sonra [Ca2+]m'deki değişiklikleri gösterir. Sonuçlar açıkça [Ca2 +]mönemli değişiklikler gösterdi. Sitosolik Ca2+ olmadan mitokondriyal istirahat kalsiyum konsantrasyonu ([Ca2+]c)1,03 ± 0,13 μM (ortalama ± S.E., n = 32) ve maksimum [Ca2+]m 1-μM [Ca2+] c 29,6 ± 1,61 μM...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Girişim düzeltme yöntemi, NADH ve fura-2 analoglarının sinyallerini ölçmek için başarıyla geliştirilmiştir. Sinyallerin tam olarak ölçülmesi tam düzeltme için gereklidir. Ancak, floresan cihazın doğal doğası fura-2 NADH ile ilgisi olmayan bir arka plan sinyali üretir. En yüksek kalitede bant geçiş filtresi, ışığın istenmeyen dalga boylarının yalnızca 10-8'ini geçebilir. Ancak, tek bir hücreden gelen floresan sinyal çok küçüktür ve bant-pass filtresinden sonra uyarma ışığının yansıması hala gerçek floresan siny...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların ifşa etmesi gereken çıkar çatışmaları yok.

Teşekkürler

Bu çalışma, Bilim Bakanlığı, BİT ve Gelecek Planlaması (NRF-2016M3C1A6936606) tarafından Eğitim Bakanlığı tarafından finanse edilen Kore Ulusal Araştırma Vakfı (NRF) tarafından kısmen Temel Bilim Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir. ve Ticaret, Sanayi ve Enerji Bakanlığı (10068076) tarafından.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
2 mL eppendorf tüpAxygenMCT-200-C2 mL Tüp
AD/DA dönüştürücüInstrutechITC-18Ekipman
ADP, Adenozin 5 prim; difosfat monopotasyum tuzu dihidrat< / güçlü >Sigma-aldrichA5285Kimyasallar
< güçlü > Bant geçiren filtre< / güçlü>Ealing Elektro-Optik, Inc35-3920Ekipman, 640 & plusmn; 11nm
< güçlü > Bant geçiren filtre< / güçlü >Omega Optik690-9823Ekipman, 590 ve artı; 15nm
< güçlü > Bant geçiren filtre< / güçlü >Omega Optik500DF20-9916Ekipman, 500 artı 20nm
< güçlü > Bant geçiren filtre< / güçlü >Chroma Technology Corp.60685Ekipman, 450± 30nm
< güçlü > Kalsiyum klorür çözeltisi< / güçlü >Sigma-aldrich21114Kimyasallar
< güçlü > karboksi-SNARF-1 () < / güçlü > güçlüInvitrogenC1272Kimyasallar
< güçlü > şarj bağlantılı cihaz (CCD) kamera< / güçlü >PhilipsFTM1800NH / HGIEkipman
< güçlü > Dikroik ayna < / güçlü>Chroma Teknoloji A.Ş.86009Ekipman, Çok bantlı dikroik ayna, Yansıma : < 400nm, 490 ve artımn; 10, 560± 10, İletim: 460 & 15, 510± 20, >580nm
< güçlü > dikroik ayna< / güçlü >Chroma Technology Corp.567DCXRUEkipman, Yansıma : < 560nm, İletim: > 580 nm
Dikroik aynaChroma Technology Corp.480dclpEkipman, Yansıma : < 470nm, İletim: > 490 nm
Dikroik aynaChroma Technology Corp.20728Ekipman, Çok bantlı dikroik ayna, Yansıma : < 405nm, 470 ve artı; 30, İletim: 430nm ~ 520nm, > 640 nm
< güçlü > Dimetil sülfoksit (DMSO) < / güçlü >Sigma-aldrich154938Kimyasallar
< güçlü >DMEM, Dulbecco' s Modifiye Kartal' s Orta< / güçlü >Sigma-aldrichD5030Kimyasallar
< güçlü > EGTA, Egtazik asit, Etilen-bis (oksietilennitrilo) tetraasetik asit, Glikol eter diamin tetraasetik asit < / güçlü >Sigma-aldrichE4378Kimyasallar
< güçlü > FCCP, Mezoksalonitril 4-triflorometoksifenilhidrazon< / güçlü >Sigma-aldrich21857Kimyasallar
alan diyaframı< / güçlü >Nikon86506Ekipman
< güçlü > Fura-2-FF () < / güçlü >TEFLABS137kimyasallar
< güçlü > Yeşil tüp < / güçlü >DWMtest tüpü
< güçlü > HEPES, & nbsp; 4- (2-Hidroksietil) piperazin-1-etansülfonik asit, N- (2-Hidroksietil) piperazin-N′-(2-etansülfonik asit)Sigma-aldrichH3375Chemicals
Yüksek hızlı sayaçUlusal AletlerNI-6022Ekipman
Sıcak aynaChroma Technology Corp.21002Ekipman, 50:50
ters çevrilmiş mikroskop NikonTE-300Ekipman
MalateSigma-aldrich27606Kimyasallar
Yakın kızılötesi filtre Chroma Technology Corp.D750/100XDonanımı, 750± 100nm
yağlı daldırma lensi NikonMRF0140040x, NA 1.3; Ekipman
Foton sayaç ünitesiHamamatsuC3866Ekipman
Foton çarpan tüpüHamamatsuR2949Ekipman
Polikrom IIKadar FotonikSA3/MG04Ekipman
Potasyum klorürMerck1.04936Kimyasallar
potasyum hidroksit çözeltisi< / güçlü >Sigma-aldrichP4494Kimyasallar
< güçlü > Piru < / güçlü >Sigma-aldrich107360Kimyasallar
< güçlü > Rotenon < / güçlü >Sigma-aldrichR8875Kimyasallar
Saponin < / güçlü >Sigma-aldrichS4521Kimyasallar
< güçlü > TMRE, Tetrametilrodamin, etil ester < / güçlü >moleküler problarT669Kimyasallar

Kaynaklar

  1. Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 517-529 (2003).
  2. Miyata, H., et al. Measurement of mitochondrial free Ca2+ concentration in living single rat cardiac myocytes. American Journal of Physiology. 261 (4 Pt 2), H1123-H1134 (1991).
  3. Allen, S. P., Stone, D., McCormack, J. G. The loading of fura-2 into mitochondria in the intact perfused rat heart and its use to estimate matrix Ca2+ under various conditions. Journal of Molecular Cellular Cardiology. 24 (7), 765-773 (1992).
  4. Griffiths, E. J., Halestrap, A. P. Pyrophosphate metabolism in the perfused heart and isolated heart mitochondria and its role in regulation of mitochondrial function by calcium. Biochemical Journal. 290 (Pt 2), 489-495 (1993).
  5. Crompton, M., Moser, R., Ludi, H., Carafoli, E. The interrelations between the transport of sodium and calcium in mitochondria of various mammalian tissues. European Journal of Biochemistry. 82 (1), 25-31 (1978).
  6. Chance, B., Schoener, B., Oshino, R., Itshak, F., Nakase, Y. Oxidation-reduction ratio studies of mitochondria in freeze-trapped samples. NADH and flavoprotein fluorescence signals. The Journal of Biological Chemistry. 254 (11), 4764-4771 (1979).
  7. Eng, J., Lynch, R. M., Balaban, R. S. Nicotinamide adenine dinucleotide fluorescence spectroscopy and imaging of isolated cardiac myocytes. Biophysical Journal. 55 (4), 621-630 (1989).
  8. Brandes, R., Bers, D. M. Simultaneous measurements of mitochondrial NADH and Ca(2+) during increased work in intact rat heart trabeculae. Biophysical Journal. 83 (2), 587-604 (2002).
  9. Jo, H., Noma, A., Matsuoka, S. Calcium-mediated coupling between mitochondrial substrate dehydrogenation and cardiac workload in single guinea-pig ventricular myocytes. Journal of Molecular Cellular Cardiology. 40 (3), 394-404 (2006).
  10. Lee, J. H., Ha, J. M., Leem, C. H. A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Mitochondrial Ca2+ Measurement with FURA-2-FF in Single Permeabilized Ventricular Myocytes of Rat. Korean Journal of Physiology and Pharmacology. 19 (4), 373-382 (2015).
  11. Powell, T., Terrar, D. A., Twist, V. W. Electrical properties of individual cells isolated from adult rat ventricular myocardium. Journal of Physiology. 302, 131-153 (1980).
  12. Sun, B., Leem, C. H., Vaughan-Jones, R. D. Novel chloride-dependent acid loader in the guinea-pig ventricular myocyte: part of a dual acid-loading mechanism. Journal of Physiology. 495 (Pt 1), 65-82 (1996).
  13. Page, E. Quantitative ultrastructural analysis in cardiac membrane physiology. American Journal of Physiology. 235 (5), C147-C158 (1978).
  14. Page, E., McCallister, L. P., Power, B. Sterological measurements of cardiac ultrastructures implicated in excitation-contraction coupling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68 (7), 1465-1466 (1971).
  15. Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

NADH D zeltme Y ntemiMitokondriyal Kalsiyum l mzobestik UyarmaRasyometrik FloroprobuNADH Sinyal Giri imiMitokondriyal Membran PotansiyeliTetrametilrhodamin Etil EsterKarboksi Seminaftorhodafleuor 1Kalsiyumsuz Sol syon
Canlı Hücrelerde Fura-2-Analog Ile Hücre İçi Ca2+ Ölçümü için Yeni Nikotinamid Adenin Dinükleotid Düzeltme Yöntemi
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.