Method Article

Amiloid Fibrils ile Beyin Mitokondrisi ile Etkileşimler ve Membran Permeabilizasyonu

DOI:

10.3791/59883

⸱

September 28th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Institute for Advanced Studies in Basic Sciences (IASBS), Zanjan, 45137-66731, Iran

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada verilen farklı dokulardan ve beynin çeşitli bölgelerinden izole mitokondri ile farklı peptidler ve proteinlerin yerli formu, prefibrillar ve olgun amiloid fibrils arasındaki etkileşimleri araştırmak için bir protokoldür.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kanıt büyüyen bir vücut membran permeabilizasyon gösterir, mitokondri gibi iç membranlar da dahil olmak üzere, nörodejeneratif hastalıklarda amiloid agrega kaynaklı toksisite ortak bir özellik ve birincil mekanizma. Ancak, membran bozulma mekanizmaları açıklayan raporların çoğu fosfolipid model sistemlerine dayanmaktadır ve biyolojik membranlar düzeyinde meydana gelen olayları doğrudan hedefleyen çalışmalar nadirdir. Burada açıklanan membran düzeyinde amiloid toksisite mekanizmaları incelemek için bir modeldir. Mitokondriyal izolasyon için, yoğunluk gradyan ortamı minimal miyelin kontaminasyonu ile preparatlar elde etmek için kullanılır. Mitokondriyal membran bütünlüğü doğruladıktan sonra α-sinüklein, büyükbaş insülin ve tavuk yumurtası aknüksü (HEWL) ile sıçan beyni mitokondrisinden kaynaklanan amiloid fibrillerin in vitro biyolojik model olarak etkileşimi araştırılır. Sonuçlar fibriller meclisleri ile beyin mitokondri tedavisi membran permeabilizasyon ve ROS içerik geliştirme farklı derecelerde neden olabileceğini göstermektedir. Bu amiloid fibriller ve mitokondriyal membran arasındaki yapıya bağlı etkileşimleri gösterir. Amiloid fibrillerin biyofiziksel özellikleri nin ve mitokondriyal membranlara özel bağlanmasının bu gözlemlerin bazılarına açıklama getirebileceği ileri sürülebilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Amiloidoz olarak bilinen amiloid ile ilişkili bozukluklar, farklı doku ve organlarda çözünmez protein yataklarının görünümü ile tanımlanan hastalıkların büyük bir grup oluşturmaktadır1,2. Bunlar arasında nörodejeneratif bozukluklar, protein agregalarının merkezi veya periferik sinir sisteminde en sık görülen formlardır2. Amiloid agregalarının toksisitesi dahil olduğu öne sürülse de3, amiloid patolojisinin birincil mekanizması olarak hücre zarının bozulması na ve permeabilizasyonuna işaret eden kanıt ların giderek arttığı bir vücut4, 5. Plazma zarına ek olarak, iç organeller (yani, mitokondri) de etkilenebilir.

İlginçtir, ortaya çıkan kanıtlar mitokondriyal disfonksiyon nörodejeneratif bozuklukların patogenezinde kritik bir rol oynadığını göstermektedir, Alzheimer ve Parkinson hastalıkları da dahil olmak üzere6,7. Bu soruna uygun olarak, çok sayıda rapor bağlanma ve amiloid β-peptid birikimi göstermiştir, α-sinüklein, Huntingtin, ve ALS bağlı mutant SOD1 proteinleri mitokondri8,9,10, 11. Amiloid agregalar tarafından membran permeabilizasyon mekanizması ya ayrık kanalların oluşumu ile meydana geldiği düşünülmektedir (gözenekleri) ve / veya nonspesifik bir deterjan benzeri mekanizma ile5,12, 13. yıl. Bu sonuçların çoğunun fosfolipid model sistemlerini içeren raporlara dayandığı ve biyolojik membranlarda meydana gelen olayları doğrudan hedef alan çalışmaların nadir olduğu dikkat çekicidir. Açıkçası, Bu yapay lipid iki katmanları mutlaka biyolojik membranların içsel özelliklerini yansıtmaz, mitokondri olanlar da dahil olmak üzere, heterojen yapılar ve fosfolipidler ve proteinlerin geniş bir yelpazede oluşan.

Bu çalışmada, sıçan beyinlerinden izole edilen mitokondri, α-sinükleinden kaynaklanan amiloid fibrillerin (amiloidojenik protein olarak), sığır insülininin (bir model peptid olarak gösteren bir model peptid olarak) yıkıcı etkilerini incelemek için in vitro biyolojik bir model olarak kullanılmaktadır. enjeksiyon lokalize amiloidoz dahil insan insülin ile önemli yapısal homoloji), ve tavuk yumurtası beyaz lysozyme (HEWL; amiloid agregasyon çalışması için ortak bir model protein olarak). Amiloid fibriller tarafından indüklenen mitokondriyal membranların etkileşimleri ve olası hasarı mitokondriyal magenaz (MDH) (mitokondriyal matrikste bulunan) ve mitokondri reaktif oksijen salınımı gözlemleyerek araştırılır. türler (ROS) geliştirme.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm hayvan deneyleri Tahran Üniversitesi Tıp Bilimleri Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) uyarınca yapılmıştır. Giyotin bıçaklarını keskinleştirerek ve bıçağın kararlı ve hızlı hareketlerini uygulayarak farelere yönelik acı ve zararlı etkileri en aza indirmek için maksimum çaba sarf edildi.

1. Beyin homojenizasyonu ve mitokondriyal izolasyon

NOT: Mitokondriyal izolasyon için tüm reaktifler Sims ve Anderson14'egöre hazırlanmıştır.

  1. Mitokondriyal izolasyon için tampon hazırlanması
    1. 100 mM Tris-HCl çözeltisi hazırlayın: 0,605 g Tris-HCl ağırlığında ve yaklaşık 40 mL deiyonize su (DW) içinde bir kabın içinde çözün. Çözümü 50 mL hacimsel bir şişeye aktarın ve DW ekleyerek son hacmi 50 mL'ye yükseltin.
    2. 10 mM EDTA çözeltisi hazırlayın: 0,202 g EDTA ağırlığında ve bir kabın içinde yaklaşık 40 mL DW içinde çözün. Çözümü 50 mL hacimsel bir şişeye aktarın ve DW ekleyerek son hacmi 50 mL'ye yükseltin.
      NOT: Her iki çözelti de en az 4 hafta 4 °C'de saklanabilir.
    3. Tris-HCl/EDTA/sakaroz stok çözeltisi hazırlayın: 30 mL 100 mM Tris-HCl ve 30 mL 10 mM EDTA'yı bir kabın içinde ekleyin. Tartmak 32.86 g sakaroz ve manyetik bir karıştırıcı ile karıştırArak kabına ekleyin. Sakaroz çözündüğünde, çözeltiyi 100 mL hacimsel bir şişeye aktarın ve DW ekleyerek son hacmi 100 mL'ye yükseltin.
      NOT: Bu çözelti 4 °C'de 3 güne kadar saklanabilir.
    4. İzolasyon arabelleği (IB): 100 mL Tris-HCl/EDTA/sakaroz stoğunu yaklaşık 150 mL DW'ye ekleyin. 0,1 M HCl ekleyerek pH'ı 7,4'e ayarlayın. DW ekleyerek son hacmi 300 mL'ye yükseltin.
    5. 1,5 mL yoğunluk gradyan orta ilave edilerek IB ile (v/v) yoğunluk gradyan ortamı nı 8,5 mL soğuk IB'ye ekleyerek hazırlayın.
    6. Hazırlamak 10 mg /mL sığır serum albumin (BSA) çözeltisi: 20 mg yağ asidi içermeyen BSA ağırlığında ve 2 mL şişede yaklaşık 1,5 mL DW içinde çözün. DW ekleyerek son hacmi 2 mL'ye yükseltin ve kullanıma kadar buzüzerinde saklayın.
      NOT: Mitokondriyal izolasyon gününde 1.1.4-1.1.6 adımlarından gelen çözümleri taze olarak hazırlayın ve kullanıma kadar buzüzerinde saklayın.
  2. Fare beyninin izolasyonu
    NOT: Erkek sıçanların beyin lerinin kesilmesi ve beyin denzimi (150-200 g) Sims ve Anderson14'egöre yapılmıştır.
    1. Bir buz kovasına 30 mL'lik bir kabı koyun ve kabına 10 mL soğuk IB ekleyin.
    2. Küçük bir hayvan giyotin ile sıçan decapitate ve mitokondriyal özelliklerinin bozulmasını sınırlamak için decapitation 1 dakika içinde kafatasından beyin kaldırmak.
    3. Beyni soğuk IB içeren kabına hızla aktarın.
  3. Beyin homojenizasyonu ve mitokondri hazırlanması
    NOT: Mitokondriyal kesirler Sims ve Anderson14tarafından açıklanan protokole göre izole edildi , daha önce açıklandığı gibi bazı değişiklikler ile15. Bu hızlı bir şekilde çalışmak ve prosedür boyunca buz üzerinde her şeyi tutmak önemlidir.
    1. Doku 2x IB 30 mL ile yıkayın, soğuk IB içeren bir beher transfer, ve ince makas ile beyin kıyma.
    2. Önceden soğutulmuş IB (sıçan beyni başına yaklaşık 10 mL IB) 10 cilt ekleyin.
    3. Doku süspansiyonuna 20 mL soğuk Dounce homogenizer aktarın.
    4. Bir motorlu pestle ile dokuz yukarı ve aşağı vuruş kullanarak doku parçaları homojenize.
      NOT: Homojenin soğuk kalmasını sağlamak için karışımı üç homojenizasyon vuruşundan sonra yaklaşık 30 s kadar buz üzerinde bırakın.
    5. Homojeni önceden soğutulmuş 10 mL santrifüj tüpe ve santrifüje 1300x g ve 4 °C'de 3 dakika aktarın.
    6. Supernatant'ı dikkatlice decant ve önceden soğutulmuş 10 mL santrifüj tüp ve santrifüj21.000x g 4 °C'de 10 dakika boyunca aktarın.
    7. Supernatant atın ve soğuk bir% 15 yoğunluk gradyan orta çözelti (her beyin için 5 mL) yavaşça bir pipet ile karışımı karıştırarak pelet resuspend.
    8. Sabit açılı rotorda 30.700 x 4 °C'de 5 dakika yavaş hızlanma (0 rpm'den 500 rpm'ye kadar 45 s) ve ardından normal hızlanma (fren yok) kullanarak santrifüj. Bu iki farklı malzeme bandı oluşturmalıdır(Şekil 1A, solda).
    9. Pasteur pipeti kullanarak, çoğunlukla miyelin içeren degradenin üst kısmında biriken keskin malzeme bandını çıkarın. Daha sonra, bant 2'deki zenginleştirilmiş mitokondriyal fraksiyonundan herhangi birini kaybetmeden malzemeyi (bant 2'de) örten yoğunluk gradyan orta çözeltisini mümkün olduğunca çıkarın.
      NOT: Grup 2 hem sinaptik hem de sinaptik olmayan mitokondriyi içerir.
    10. Mitokondriyal fraksiyona 8 mL IB eklerken karışımı bir pipetle hafifçe karıştırın.
    11. 10 dk için 4 °C'de 16.700 x g'de santrifüj edin ve alt takibe rahatsız edilmeden süpernatantı dikkatlice çıkarın.
    12. Santrifüj tüpüne 1 mL 10 mg/mL yağ asidi içermeyen BSA ekleyin ve karışımı pipet ucuyla hafifçe karıştırın. IB ekleyerek beyin başına 5 mL son hacmi artırın.
    13. Santrifüj 6.900x g 4 °C 10 dakika için, hangi bir firma pelet üretmelidir(Şekil 1A, sağ).
    14. Supernatant decant ve yavaşça IB mitokondriyal pelet resuspend, 0.5 mL tüpler içine aliquot ve kullanıma kadar sıvı nitrojen saklayın.

2. Protein konsantrasyonu tayini

NOT: Protein konsantrasyonu Lowry ve ark.16yöntemi kullanılarak ölçülür.

  1. Lowry tsay için çözümlerin hazırlanması
    1. A çözeltisini hazırlayın: 0,4 g NaOH ve 2 g Na2CO3 ağırlığında ve 80 mL DW'de çözünün, ardından çözeltiyi 100 mL hacimsel bir şişeye aktarın ve DW ekleyerek hacmi 100 mL'ye yükseltin.
    2. Çözelti sin B: 0,1 g potasyum sodyum tartarat ve 0,05 g CuSO4 tartat ve 8 mL DW içinde çözünür, sonra 10 mL hacimsel bir şişe ye solüsyonu aktarın ve DW ekleyerek hacmi 10 mL'ye çıkarın.
      NOT: Her iki A ve B çözeltisi de 4 °C'de 6 aya kadar sabit kalabilir.
    3. Çözelti yi hazırlayın C: 7,5 mL DW'ye 0,5 mL folin çözeltisi ekleyin.
      NOT: Çözelti C'yi taze hazırlayın ve kullanıma kadar ışıktan uzak tutun.
    4. 0, 20, 40, 60, 80, 100 ve 120 μg/mL son konsantrasyonları ile BSA standartlarını hazırlamak 0, 20, 40, 60, 80, 100 ve 120 μL 1 mg/mL BSA'yı birleştirerek 1000 μL çözelti yapmaya yetecek kadar DW ile hazırlayın.
  2. Protein konsantrasyonu ölçümü
    NOT: Daha fazla doğruluk için bu adımı triplicate olarak çalıştırın.
    1. 96 kuyu plakasının her kuyuya 50 μL standart çözelti ve mitokondriyal homojen ekleyin ve ardından 45 μL'lik a çözeltisi ekleyin. Daha sonra, 50 °C'de belirlenen ılık su banyosunda tabağı 10 dakika kuluçkaya yatırın.
    2. 5 μL çözelti B ekleyin ve oda sıcaklığında (RT) karanlıkta 10 dakika boyunca plakayı kuluçkaya yatırın.
    3. 150 μL çözelti C ekleyin ve 50 °C'de belirlenen ılık su banyosunda tabağı 10 dakika kuluçkaya yatırın.
    4. Plakayı bir plaka okuyucusuna yükleyin ve 650 nm'de standartlar ve mitokondriyal süspansiyon için emicideğerleri kaydedin. Daha sonra, bir kalibrasyon eğrisi kullanarak, mitokondri protein içeriğini hesaplamak.

3. Mitokondriyal membran bütünlüğü tayini

NOT: Triton X-100 ile membran bozulmasından önce ve sonra izole mitokondride maat dehidrogenaz (MDH) aktivitesi ölçülerek mitokondriyal membran bütünlüğü doğrulanır.

  1. Seyreltik mitokondriyal homojen 1 mg/mL soğuk IB ile ve iki yerleştirilir 1.5 mL tüpler (genellikle tüp başına mitokondri 195 μL).
  2. Bir tüpe (v/v) Triton X-100 (DW ile seyreltilmiş) 5 μL (maksimum enzim aktivitesi için pozitif kontrol olarak) ve 5 μL DW'yi başka bir tüpe (kontrol için) ilave edin ve ardından bir karıştırıcı ile karıştırın.
  3. Tüpleri 30 °C'de ılık su banyosunda 10 dakika kuluçkaya yatırın.
  4. 16.000 x g ve 4 °C'de 15 dk.'da sabit açılı rotordaki tüplerin santrifüjü ile pelet mitokondrisi.
  5. Aşağıdaki bölümde açıklanan standart bir spektrofotometrik test kullanarak mitokondriyal MDH aktivitesini tetmek için ortaya çıkan süpernatantları dikkatlice toplayın.
  6. Mitokondriyal membranın bütünlüğünü aşağıdaki gibi hesaplayın:
    figure-protocol-1

4. MDH faaliyet tayini

NOT: MDH aktivitesi Sottocasa ve ark.17tarafından açıklandığı gibi spektrofotometrik olarak ölçüldü.

  1. MDH aktivite tsanına yönelik çözümlerin hazırlanması
    1. 50 mM Tris-HCl çözeltisi (pH = 7,5): Tris-HCl kullanarak DW'de 7,9 mg/mL çözeltihazırlayın ve pH'ı 25 °C'de 1,0 M NaOH ile 7,5'e ayarlayın.
    2. 50 mM oksaloasetat çözeltisi hazırlayın: Tris-HCl'de okaloasetat kullanarak 6.6 mg/mL çözelti hazırlayın.
      NOT: Bu çözelti bir kez çözümde sabit değildir ve kullanımdan hemen önce hazırlanmalıdır.
    3. 10 mM β-NADH çözeltisi hazırlayın: Tris-HCl'de β-NADH kullanarak 7.81 mg/mL çözelti hazırlayın.
  2. MDH faaliyet tayini
    NOT: 1.0 mL reaksiyon karışımındaki son tahlil konsantrasyonları 50 mM Tris-HCl, 5 mM okaloasetat ve 0.1 mM β-NADH'dır.
    1. Spektrofotometreyi 25 °C ve 340 nm'ye ayarlayın. Pipet 890 μL Tris-HCl tamponu, 100 μL oksaloasetat çözeltisi ve boş bir cuvette ve 880 μL Tris-HCl tamponuna 10 μL NADH çözeltisi, 100 μL oksaloasetat çözeltisi ve 10 μL NADH çözeltisi numune cuvette içine.
    2. 3-4 dk ve boş karşı referans için spektrofotometre içinde kuluçka cuvettes.
    3. Daha sonra örnek cuvette 10 μL mitokondriyal homojenate (1 mg/mL) ekleyin, hemen ters çevrilerek karıştırın ve 1 dk için 340 nm'de NADH oksidasyonuna bağlı olarak absorbansta rekor düşüşler kaydedin.

5. In vitro α-sinüklein, sığır insülin ve HEWL fibril oluşumu

  1. Protein hazırlama
    1. α-synüklein:
      NOT: Rekombinant α-sinüklein ekspresyonu ve saflaştırması Hoyer ve ark.18 tarafından bazı değişikliklerle tanımlanır ve α-sinüklein saflığı SDS-PAGE tarafından doğrulanır.
      1. Bir gecede fosfat tamponlu saline (PBS) karşı saflaştırılmış α-sinüklein diyaliz.
      2. 275 nm 19'da 5600 M-1 cm-1'lik bir yok olma katsayısı kullanarak proteinkonsantrasyonununbelirlenmesi.
      3. Aliquots protein 1.5 mL tüpler ve kullanıma kadar -80 °C'de saklayın.
    2. Sığır insülin ve HEWL:
      1. Hem büyükbaş insülin hem de HEWL sağlayın.
      2. Her proteini 50 mM glisin tamponunda çözün (pH = 1.6; pH'ı HCl ile ayarlayın).
      3. 276 nm ve 280 nm, sırasıyla20,211.0 mg/mL için 1.0 ve 2.63 bir yok olma katsayısı kullanarak sığır insülin ve HEWL konsantrasyonu belirleyin.
  2. Amiloid fibrilasyon indüksiyonu
    1. Amiloid fibrilasyon için çözelti hazırlanması:
      1. Tioflavin T (ThT) tamponunu hazırlayın: 0,3 g NaH2PO4 ağırlığında ve 80 mL DW'de eritin, pH'ı 6,5'e ayarlayın ve DW ekleyerek hacmi 100 mL'ye yükseltin.
      2. ThT stok çözeltisini (5 mM) hazırlayın): 1,6 mg ThT ağırlığında ve 1 mL ThT tamponunda eritin, 0,22 μm'lik filtre kağıdından geçirin ve kullanıma kadar 4 °C'de ışıktan uzak tutun.
        NOT: Bu çözelti 4 °C'de 4 haftaya kadar saklanabilir.
      3. ThT çözeltisini hazırlayın (1 mM): 200 μL ThT stok çözeltisi (5 mM) ila 800 μL ThT tampon ekleyin.
        NOT: Bu çözelti 4 °C'de 1 haftaya kadar saklanabilir.
    2. In vitro α-synüklein amiloid fibril oluşumu:
      1. 1,5 mL'lik tüplere protein çözeltisi (200 μM) ve 6 μL ThT çözeltisi (1 mM) ekleyin.
      2. Tüpleri 37 °C'de bir termomikte 800 rpm'de 4 gün boyunca sürekli karıştırarak tüplerle inküler.
      3. Düzenli zaman aralıklarından sonra kuluçkaya yatan numunelerden (10 μL) alın ve 490 μL ThT tamponu ekleyin, iyice karıştırın ve RT'de 5 dakika kuluçkaya yatırın.
      4. Uyarma ve emisyon yarık genişliklerini sırasıyla 5 nm ve 10 nm olarak ayarlayın ve 440 nm'de uyarma ve 485 nm'de floresan spektrofotometre ile emisyon ölçün.
    3. In vitro sığır insülin amiloid fibril oluşumu:
      1. 1,5 mL tüpe 637 μL protein çözeltisi (250 μM) ekleyin. Daha sonra 13 μL ThT çözeltisi (1 mM) ekleyin ve ardından karıştırın.
      2. 20 μM ThT içeren protein çözeltisi (200 μL) temiz dipli 96 kuyu plakasının her kuyuya aliquots (200 μL) ekleyin ve plakayı kristal berraklığında sızdırmazlık bandıile kapatın.
      3. Plakayı bir floresan levha okuyucusuna yükleyin ve ajitasyon olmadan 57 °C'de kuluçkaya yatırın.
      4. ThT floresanını 30 dk aralıklarla, 440 nm'de uyarma ve 485 nm'de emisyon la 12 saat ölçün.
        NOT: Her ölçümden önce plakayı 5 s kadar çalkalayın.
    4. In vitro HEWL amiloid fibril oluşumu:
      1. 20 μM ThT içeren protein çözeltisi (1 mM) aliquots (1 mM) açık dipli 96 kuyu plakasının her kuyuya ekleyin ve plakayı kristal berraklığında sızdırmazlık bandı ile kapatın.
      2. Plakayı bir floresan levha okuyucusuna yükleyin ve ajitasyon olmadan 57 °C'de kuluçkaya yatırın.
      3. ThT floresanını 2 saat aralıklarla, 440 nm'de uyarma ve 485 nm'de 485 nm'de 4 gün boyunca emisyon ölçün.
        NOT: Her üç protein için de amiloid fibril oluşumu atomik kuvvet mikroskobu ile doğrulanır (Şekil 2B).

6. Amiloid fibriller, MDH salınım teksi ve ROS ölçümü ile mitokondri tedavisi

  1. Amiloid fibriller ile izole mitokondri inkübasyonu
    1. Santrifüj ve ılık su banyosunu açın ve sırasıyla 4 °C ve 30 °C'ye ayarlayın.
    2. IF kullanarak, 1 mg/mL son konsantrasyona mitokondriyal homojen.
    3. Mitokondriyal homojenler içeren 1.5 mL'lik iki tüp serisi hazırlayın (MDH salınım ıstasalı analiz için bir seri ve mitokondriyal ROS ölçümü için başka bir seri).
    4. Α-synüklein, büyükbaş insülin veya HEWL'nin taze veya amiloid fibrüllerini ekleyin (5 μM, 10 μM, 20 μM ve 25 mm son konsantrasyonlarda; pbs veya glisin tamponu kontrol olarak kullanın) mitokondriyal homojenat (son hacim = 200 μL) (bkz. Tablo 1, Tablo 2 , ve Tablo 3) yavaşça bir pipet ile çözelti karıştırma izledi.
      NOT: MDH salınım testi için, maksimum enzim salınımı için pozitif kontrol olarak Triton X-100'ü (%0,5 nihai konsantrasyonda [v/v]) kullanın.
    5. 30 °C'ye ayarlanmış ılık su banyosunda 30 dk mitokondriyal süspansiyon içeren kuluçka tüpleri.
    6. Bölüm 6.2 ve 6.3'te belirtildiği gibi mitokondriyal MDH salınımı ve ROS içeriğini ölçün.
  2. Mitokondriyal MDH serbest tayı
    1. 15 dakika boyunca 16.000 x g'de kuluçkaya yatan mitokondriyal homojenleri santrifüj edin, sonra bölüm 4'te açıklandığı gibi mitokondriyal MDH'nin aktivitesini saptamak için ortaya çıkan süpernatanları dikkatlice toplayın.
    2. MDH'nin serbest bırakılmasını maksimum etkinin (Triton X-100) bir kesiti olarak aşağıdaki gibi hesaplayın:

figure-protocol-2

  1. Mitokondriyal ROS ölçümü
    NOT: Oksidasyona duyarlı florojenik öncül dihidrodichlorocarboxyfluorescein diasetat (DCFDA)22ile mitokondriyal ROS içeriği belirlenir.
    1. Mitokondriyal ROS ölçümü için çözümler hazırlayın. Metanolde eriterek 50 μM DCFDA çözeltisi hazırlayın (taze hazırlayın) ve DW'de eriterek 200 mM sinknat çözeltisi hazırlayın.
    2. Pipet 191 μL inkümlenmiş mitokondriyal homojen 96 kuyunun her kuyusu ve 4 μL 50 μM DCFDA (1 μM son konsantrasyon) ve 5 μL 200 mM sközat (5 mM son konsantrasyon) ekleyin.
    3. Tabağı 30 °C'de ılık su banyosunda 30 dakika boyunca hafifçe karıştırarak kuluçkaya yatırın.
    4. Plakayı bir floresan levha okuyucuya yükleyin ve floresan şiddetini ölçün, 485 nm'de uyarma ve 530 nm'de emisyon.

7. İstatistiksel analiz

  1. Tüm deneyleri en az 2x veya 3x triplicate tahlilleri ile gerçekleştirin ve uygun istatistiksel testler yapın. Burada sonuçlar ortalama ± SD olarak sunulmuş ve istatistiksel anlamlılık hesaplamak için öğrencinin eşleştirilmiş t-testi kullanılmıştır. 0.01 ve 0.05'ten küçük P değerleri istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi (*p < 0.05; **p < 0.01).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokol bir in vitro biyolojik model olarak sıçan beyin mitokondri ile amiloid fibril etkileşimleri incelenmesi için bir model açıklar. Mitokondriyal preparat için beyin dokusunun majör kontaminasyonu olarak miyelini çıkarmak için (v/v) yoğunluk gradyan ortamı kullanılmıştır14. Şekil 1A'dagösterildiği gibi, 30.700 x g'daki santrifüj, zenginleştirilmiş mitokondriyal fraksiyoniçeren miyelin (bant1'in ana bileşeni olarak) ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deneysel sonuçlar zenginliği fibriller agregaların sitotoksisitesi önemli ölçüde etkileşim ve biyolojik membranlar 4 permeabilize yetenekleri ile ilişkili olduğu hipotezini destekler4,5. Ancak, verilerin çoğu mutlaka fosfolipidler ve proteinlerin geniş bir yelpazede heterojen yapılar olan biyolojik membranların içsel özelliklerini yansıtmayan yapay lipid iki katmanları dayanmaktadır. Burada beyin mitokondrisi in vitro biyolojik membran olarak kullanılmakta, membr...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, İran'ın Zanjan kentinde ki Temel Bilimler İleri Araştırmalar Enstitüsü Araştırma Konseyi'nin (IASBS) hibeleri ile desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2 & prime;, 7 & prime ; -Diklorodihidrofloresein diasetatSigma35845
Amonyum sülfatMerck1012171000
Siyah 96 oyuklu plakaCorning
Siyah Açık tabanlı 96 oyuklu plakaCorning
Sığır insüliniSigmaI6634
Sığır Serumu Albümin (BSA)SigmaA2153
BSA esasen yağ asidi içermezSigmaA6003
SantrifüjSigma
Kristal berraklığında sızdırmazlık bandıCorning
CuSO4Sigma451657
Diyaliz torbası (2 KDa kesilmiş)SigmaD2272
Dounce homojenizatörPotter Elvehjem
EDTASigmaE9884
Floresan plaka okuyucuBioTek
Floresan spektrofotometreCary Eclipse VARIAN
FolinMerckF9252
GlisinSigmaG7126
Giyotinİran'da
HClMerckH1758
Tavuk Yumurta Akı Lizozim (HEWL)SigmaL6876
Na2CO3SigmaS7795
NaH2PO4SigmaS7907
NaOHMerckS8045
OksaloasetatSigmaO4126
PercollGE Sağlık
Fosfat Tampon Salin (PBS)SigmaCS0030
PMSFSigmaP7626
Potasyum sodyum tartratSigma217255
Kuvars küvetSigma
Spektrofotometreanalitik jenaSPEKOL 2000 model
SüksinatSigmaS2378
SükrozMerck1076871000
TermomikserEppendorph
Thioflavin T SigmaT3516
Tris-HClMerck1082191000
Triton X-100SigmaT9284
TriptonQUELAB
Su banyosuMemmert
Maya ÖzüQUELAB
ve beta; -NADHSigmaN8129
üretilmiştir

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Merlini, G., Bellotti, V. Molecular mechanisms of amyloidosis. New England Journal of Medicine. 349, 583-596 (2003).
  2. Berg, I. Modeling amyloid disease in Drosophila melanogaster, Linköping Studies in Science and Technology Dissertation No. 1320. , Linköping University. Linköping Institute of Technology, Department of Physics, Chemistry and Biology (2010).
  3. Kagan, B. L. Protein aggregation, ion channel formation, and membrane damage. Protein Misfolding, Aggregation, and Conformational Diseases. Uversky, V. N., Fink, A. L. , Springer US. New York. 223-236 (2006).
  4. Demuro, A., et al. Calcium dysregulation and membrane disruption as a ubiquitous neurotoxic mechanism of soluble amyloid oligomers. The Journal of Biological Chemistry. 280, 17294-17300 (2005).
  5. Kayed, R., et al. Permeabilization of lipid bilayers is a common conformation-dependent activity of soluble amyloid oligomers in protein misfolding diseases. The Journal of Biological Chemistry. 279, 46363-46366 (2004).
  6. Manczak, M., Park, B. S., Jung, Y., Reddy, P. H. Differential expression of oxidative phosphorylation genes in patients with Alzheimer's disease: implications for early mitochondrial dysfunction and oxidative damage. Neuromolecular Medicine. 5, 147-162 (2004).
  7. Vila, M., Ramonet, D., Perier, C. Mitochondrial alterations in Parkinson's disease: new clues. Journal of Neurochemistry. 107, 317-328 (2008).
  8. Petersen, C. A. H., et al. The amyloid β-peptide is imported into mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13145-13150 (2008).
  9. Devi, L., Raghavendran, V., Prabhu, B. M., Avadhani, N. G., Anandatheerthavarada, H. K. Mitochondrial import and accumulation of α-synuclein impair complex I in human dopaminergic neuronal cultures and Parkinson disease brain. The Journal of Biological Chemistry. 283, 9089-9100 (2008).
  10. Costa, V., Scorrano, L. Shaping the role of mitochondria in the pathogenesis of Huntington's disease. EMBO Journal. 31, 1853-1864 (2012).
  11. Vande Velde, C., Miller, T. M., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 4022-4027 (2008).
  12. Kagan, B. L., Azimov, R., Azimova, R. Amyloid peptide channels. The Journal of Membrane Biology. 202, 1-10 (2004).
  13. Lashuel, H. A., Hartley, D., Petre, B. M., Walz, T., Lansbury, P. T. Neurodegenerative disease: amyloid pores from pathogenic mutations. Nature. 418, 291(2002).
  14. Sims, N. R., Anderson, M. F. Isolation of mitochondria from rat brain using Percoll density gradient centrifugation. Nature Protocols. 3, 1228-1239 (2008).
  15. Ghobeh, M., et al. Interaction of Aβ (25-35) Fibrillation Products with Mitochondria: Effect of Small-Molecule Natural Products. Peptide Science. 102, 473-486 (2014).
  16. Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the folin phenol reagent. The Journal of Biological Chemistry. 193, 265-275 (1951).
  17. Sottocasa, G. L., Kuylenstierna, B., Ernester, L., Bergstrand, A. Separation and some enzymatic properties of the inner and outer membrane of rat liver mitochondria. Methods in Enzymology. 10, 448-463 (1967).
  18. Hoyer, W., et al. Dependence of a-Synuclein Aggregate Morphology on Solution Conditions. Journal of Molecular Biology. 322, 383-393 (2002).
  19. Weinreb, P. H., et al. NACP, a protein implicated in Alzheimer's disease and learning, is natively unfolded. Biochemistry. 35, 13709-13715 (1996).
  20. Porter, R. R. Partition chromatography of insulin and other proteins. The Biochemical Journal. 53, 320-328 (1953).
  21. Goldberg, M. E., Rudolph, R., Jaenicke, R. A kinetic study of the competition between renaturation and aggregation during the refolding of denatured reduced egg white lysozyme. Biochemistry. 30, 2790-2797 (1991).
  22. Young, T. A., Cunningham, C. C., Bailey, S. M. Reactive oxygen species production by the mitochondrial respiratory chain in isolated rat hepatocytes and liver mitochondria: studies using myxothiazol. Archives of Biochemistry and Biophysics. 405, 65-72 (2002).
  23. Meratan, A. A., Ghasemi, A., Nemat-Gorgani, M. Membrane integrity and amyloid cytotoxicity: a model study involving mitochondria and lysozyme fibrillation products. Journal of Molecular Biology. 409, 826-838 (2011).
  24. Katebi, B., Mahdavimehr, M., Meratan, A. A., Ghasemi, A., Nemat-Gorgani, M. Protective effects of silibinin on insulin amyloid fibrillation, cytotoxicity and mitochondrial membrane damage. Archives of Biochemistry and Biophysics. 659, 22-32 (2018).
  25. Fink, A. L. The aggregation and fibrillation of alpha-synuclein. Accounts of Chemical Research. 39, 628-634 (2006).
  26. Diraviyam, K., Stahelin, R. V., Cho, W., Murray, D. Computer modeling of the membrane interaction of FYVE domains. Journal of Molecular Biology. 328, 721-736 (2003).
  27. Van Rooijen, B. D., Claessens, M., Subramaniam, V. Lipid bilayer disruption by oligomeric α-synuclein depends on bilayer charge and accessibility of the hydrophobic core. Biochimica et Biophysica Acta. 1788, 1271-1278 (2009).
  28. Kourie, J. I., Henry, C. L. Ion channel formation and membrane-linked pathologies of misfolded hydrophobic proteins: the role of dangerous unchaperoned molecules. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 29, 741-753 (2002).
  29. Bucciantini, M., et al. Inherent toxicity of aggregates implies a common mechanism for protein misfolding diseases. Nature. 416, 507-511 (2002).
  30. Bolognesi, B., et al. ANS binding reveals common features of cytotoxic amyloid species. ACS Chemical Biology. 5, 735-740 (2010).
  31. Posse, E., De Arcuri, B. F., Morero, R. D. Lysozyme interactions with phospholipid vesicles: relationships with fusion and release of aqueous content. Biochimica et Biophysica Acta. 1193, 101-106 (1994).
  32. Roqanian, S., et al. Polyphenols protect mitochondrial membrane against permeabilization induced by HEWL oligomers: possible mechanism of action. International Journal of Biological Macromolecules. 103, 709-720 (2017).
  33. Ulmer, T. S., Bax, A., Cole, N. B., Nussbaum, R. L. Structure and dynamics of micelle-bound human alphasynuclein. The Journal of Biological Chemistry. 280, 9595-9603 (2005).
  34. Stockl, M., Fischer, P., Wanker, E., Herrmann, A. Alpha-synuclein selectively binds to anionic phospholipids embedded in liquid-disordered domains. Journal of Molecular Biology. 375, 1394-1404 (2008).
  35. Devi, L., et al. Mitochondrial import and accumulation of α-synuclein impair complex I in human dopaminergic neuronal cultures and Parkinson disease brain. The Journal of Biological Chemistry. 283, 9089-9100 (2008).
  36. Ghio, S., Kamp, F., Cauchi, R., Giese, A., Vassallo, N. Interaction of α-synuclein with biomembranes in Parkinson's disease-role of cardiolipin. Progress in Lipid Research. 61, 73-82 (2016).
  37. Petersen, C. A. H., et al. The amyloid β-peptide is imported into mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13145-13150 (2008).
  38. Costa, V., Scorrano, L. Shaping the role of mitochondria in the pathogenesis of Huntington's disease. EMBO Journal. 31, 1853-1864 (2012).
  39. Vande Velde, C., Miller, T. M., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 4022-4027 (2008).
  40. Oladzad Abbasabadi, A., et al. Disruption of mitochondrial membrane integrity induced by amyloid aggregates arising from variants of SOD1. International Journal of Biological Macromolecules. 61, 212-217 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Amyloid FibrilsBrain MitochondriaMembrane PermeabilizationMitochondrial IsolationDensity GradientMalate DehydrogenaseROS MeasurementAlpha SynucleinBovine InsulinHen Egg White Lysozyme

Related Articles