Bu protokol, fare rabdomiyosarkom primer hücrelerinin izolasyonu, tümörsphere oluşumu ve tedavisi ve tümörküre kültürlerinden başlayan allograft transplantasyonu için tekrarlanabilir bir yöntemi tanımlar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Mouse Rhabdomiyosarkomlardan İzole Edilen Primer Tümör Hücrelerinden Tümörfer Türevve Tedavisi
Bu makalede
Özet
Özet
Rhabdomyosarkom (RMS) çocuklarda en sık görülen yumuşak doku sarkomudur. Önemli çabalar RMS ile ilişkili yaygın mutasyonların belirlenmesini ve farklı RMS alt tiplerinin ayrımcılığa izin vermesine rağmen, prognozu daha da iyileştirmek için yeni tedavilerin geliştirilmesinde hala büyük zorluklar vardır. Miyojenik belirteçlerin ekspresyonu ile tanımlansa da, rms'nin miyojenik mi yoksa miyojenik olmayan kökenleri mi yoksa miyojenik olmayan kökenleri mi olduğu konusunda hala önemli tartışmalar vardır, çünkü menşe hücresi hala tam olarak anlaşılamamıştır. Bu çalışmada fare RMS için tümörfer tetkik için güvenilir bir yöntem sağlanmıştır. Test tümör hücrelerinin fonksiyonel özelliklerine dayanmaktadır ve tümörijenik fonksiyonlar ile tümörnadir popülasyonların belirlenmesini sağlar. Ayrıca rekombinant proteinlerin test edilmesi, transfeksiyon protokollerinin tümörküre testi ile bütünleştirilmesi ve tümör gelişimi ve büyümesinde rol oynayan aday genlerin değerlendirilmesi için yapılan prosedürler de tanımlanmıştır. Ayrıca açıklanan in vivotümörijenik fonksiyonu doğrulamak için alıcı fareler içine tümörkürelerin allogreft nakli için bir prosedürdür . Genel olarak, açıklanan yöntem, farklı bağlamlarda ortaya çıkan RMS'lere uygulanabilen nadir RMS tümörijenik popülasyonların güvenilir bir şekilde tanımlanmasına ve test edilmesine olanak sağlar. Son olarak, protokol ilaç taraması ve terapötik gelecekteki gelişimi için bir platform olarak kullanılabilir.
Giriş
Kanser heterojen bir hastalıktır; ayrıca, aynı tip tümör farklı hastalarda farklı genetik mutasyonlar sunabilir, ve bir hasta içinde bir tümör hücrelerin birden fazla popülasyonları oluşur1. Heterojenlik, kanserin başlatılmasından ve yayılmasından sorumlu hücrelerin belirlenmesinde bir sorun teşkil eder, ancak bunların karakterizasyonu etkin tedavilerin geliştirilmesi için gereklidir. Tümör yayılma hücreleri kavramı (TPC), tümör gelişimine katkıda bulunan hücrelerin nadir bir popülasyon, daha önce kapsamlı olarak gözden geçirilmiştir2. TPTS kanser birden fazla tip karakterize olmasına rağmen, onların güvenilir izolasyon ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute'un onaylı IACUC protokolü nün ardından farelerin barınma, tedavisi ve kurban edilmesi gerçekleştirildi.
1. Reaktif hazırlama
- 100 mL hücre izolasyonu ortamı hazırlayın: F10 orta %10 at serumu (HS) ile desteklenir.
- 50 mL kollajenaz tip II çözeltisini hazırlayın: hücre izolasyon uytonunun 50 mL'sinde 1 g kollajenaz tipi II tozunu çözündürün (çok bağlı olarak birim sayısı değiştiğinden, 1 mL'lik ortam başına enzimin birimlerine dikkat edin). Aliquot çözeltisi ve kullanıma hazır olana kadar -20 °C'lik bir dondurucuda saklayın.
NOT: Enzim aktivitesi farklı kuralar arasında ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Tümör küreleri tespiti
Hücre izolasyonu tümör dokusunda bulunan hücre popülasyonlarının maksimum heterojenliğini elde etmek için optimize edildi. İlk olarak, izole dokular morfolojik olarak farklı alanlar sunduğından, tek tip nadir hücre popülasyonlarını izole etme şansını artırmak için, tümörün birden fazla alanından örnekleme yapıldı(Şekil 1A, soldaki ilk panel). İkinci olarak, hasat edilen numunelerin mekanik ayrılması, kıyma doku boyut.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Tümör klojen iyotlar, FACS izolasyonu ve tümörsphere formasyon testi: tümör klojeni tahlilleri, tümör klojeni tahlilleri ve tümörsphere oluşumu tahlillerinden TBM'lerin izolasyonu ve karakterizasyonu için birden fazla yöntem kullanılmıştır. Tümör klojenisi titreti ilk olarak 1971 yılında tanımlanmıştır, kök hücre çalışmaları için kullanılan, ve sadece daha sonra kanser biyolojisi29uygulanan,30. Bu yöntem yumuşak jeller kültürlerde kısıtlamalar olmadan genişletmek.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
Bu çalışma Ellison Medical Foundation hibe AG-NS-0843-11 ve NCI Kanser Merkezi Destek Hibe P30CA030199 a.S. içinde NIH Pilot Grant tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Akaktaz hücre ayrışma reaktifi | Gibco | A1110501 | Yapışık hücreleri ayırın ve tümör kürelerini ayırın |
| Celigo | Nexcelom | Celigo | Yapışık ve süspansiyon hücreleri için mikrowell plaka tabanlı görüntü sitometresi |
| Kollajenaz, Tip II | Yaşam Teknolojileri | 17101015 | Doku sindirim enzimi |
| Dispase II, proteaz | Yaşam Teknolojileri | 17105041 | Doku sindirim enzimi |
| DMEM yüksek glukoz ortamı | Gibco | 11965092 | Tümör hücreleri ortamının |
| DMEM/F12 ortamı | Gibco | 11320033 | Tümosfer ortamının bileşeni |
| EDTA | ThermoFisher | S312500 | FACS tamponunun bileşeni |
| EGF rekombinant fare proteini | Gibco | PMG8041 | Tümörosfer ortamının bileşeni |
| FACSAria II Akış Sitometrisi | BD Biosciences | 650033 | Floresan aktif hücre sıralayıcı |
| Fetal Sığır Serumu | Omega Scientific | FB-11 | Tümör hücreleri ortamının bileşeni |
| Fluriso (İzoflorna) anestezik ajan | MWI Vet Hayvanlar | için 502017 Anestezik reaktif | |
| tedarik FxCycle Menekşe Leke | Yaşam Teknolojileri | F10347 | ve ölü hücreleri ayırt edin |
| Keçi Serumu | Yaşam Teknolojileri | 16210072 | FACS tamponunun bileşeni |
| Ham'ın F10 Media | Life Technologies | 11550043 | FACS tamponunun bileşeni |
| At Serumu | Yaşam Teknolojileri | 16050114 | Hücre izolasyon ortamının bileşeni |
| Lipofektamin 3000 transfeksiyon reaktifi | ThermoFisher | L3000015 | Transfeksiyon Reaktifi |
| Matrigel membran matrisi | Corning | CB40234 | Ekilen hücrelere destek sağlar |
| N-2 Supplemtns (100X) | Gibco | 17502048 | Tümörosfer ortamının bileşeni |
| Neomisin-Polimiksin B Sülfatlar-Basitrasin Çinko Oftalmik Merhem | MWI Veteriner Kaynağı | 701008 | Göz merhemi |
| PBS | Gibco | 10010023 | FACS tamponunun bileşeni ve hücreleri yıkamak için kullanılır |
| pEGFP-C1 | Addgene | 6084-1 | GFP plazmid |
| Penisilin - Streptomiyosin | Yaşam Teknolojileri | 15140163 | Tümörosfer ve tümör hücrelerinin bileşeni ortam |
| Rekombinant İnsan ve beta; FGF-basic | Peprotech | 10018B | Tümör ortamının bileşeni |
| Rekombinant fare Flt-3 Ligand Proteini | R& D Systems | 427-FL-005 | Rekombinant protein |
| Tripan mavisi | ThermoFisher | 15250061 | Canlı ve ölü hücreleri ayırt edin |
Kaynaklar
- Dagogo-Jack, I., Shaw, A. T. Tumour heterogeneity and resistance to cancer therapies. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (2), 81-94 (2018).
- Wicha, M. S., Liu, S., Dontu, G. Cancer stem cells: an old idea--a paradigm shift. Cancer Research. 66 (4), 1883-1890....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
