Bu protokol, fare oküler yüzey hücrelerinden canlı birincil kültürlerde reaktif oksijen türlerinin (ROS), canlı hücrelerin ve ölü hücrelerin eşzamanlı olarak tespitini göstermektedir. 2',7'-Dichlorofluoresceindiacetate, propidium iyodür ve Hoechst boyama ros, ölü hücreleri ve canlı hücreleri değerlendirmek için kullanılır, sırasıyla, görüntüleme ve analiz izledi.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Ultraviyole-C (UV-C) Hasarına Yanıt Olarak Birincil Fare Oküler Yüzey Hücrelerinde/Kök Hücrelerinde Oksidatif Hasarın Değerlendirilmesi
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Oküler yüzey çeşitli çevresel faktörler nedeniyle düzenli aşınma ve yıpranmaya maruz kılmaktadır. UV-C radyasyonuna maruz kalmak iş sağlığı açısından tehlike oluşturur. Burada, fare oküler yüzeyinden UV-C radyasyonuna birincil kök hücrelerin maruz kalma gösteriş. Reaktif oksijen türleri (ROS) oluşumu oksidatif stres/hasar ın derecelerinin okunmasıdır. Deneysel bir in vitro ayarda, oksidatif stres nedeniyle oluşan ölü hücrelerin yüzdesini değerlendirmek de gereklidir. Bu yazıda, UV-C maruz kalan fare primer oküler yüzey kök hücrelerinin 2',,7'-Dichlorofluoresceindiacetate (DCFDA) boyama ve dcfda boyama floresan görüntüleridayalı bunların nicelliği gösterecektir. DCFDA boyama doğrudan ROS üretimine karşılık gelir. Ayrıca sırasıyla propidium iyodür (PI) ve Hoechst 3332 ile eşzamanlı boyama ve DCFDA (ROS pozitif) ve PI pozitif hücrelerin yüzdesi ile ölü ve canlı hücrelerin sayısallaştırılmasını gösteriyoruz.
Giriş
Göz yüzeyi (OS) fonksiyonel bir birim ağırlıklı olarak dış tabaka ve kornea glandüler epitel oluşan, lachrymal bezi, meibomian bezi, konjonktiva, göz kapağı marjları ve innervasyonları bir parçası bu transduce sinyalleri1. Şeffaf kubbe şeklindeki kornea tabakası retinaüzerine ışık odaklanır. Bu avasküler doku epitel hücreleri, keratositler ve endotel hücreleri ve kollajen ve glikozaminoglikanlar 2 gibi hücresel bileşenler gibi hücresel bileşenlerden oluşur2. Alan da besinlerin çoğunu kaynağı gözyaşları tarafından boşaltılır. İşletim sistemi anatomik konumu genellikle parlak ışık, mikroplar, toz parçacıkları ve kimyasalla....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Deney İsviçre albino fare gözünden elde edilen primer göz hücreleri/kök hücreler üzerinde gerçekleştirildi. Bu deney için hayvanların göz hasat için kullanımı Kurumsal Hayvan Etik Komitesi, Yenepoya (Üniversite olarak kabul) (IEAC onay numarası, 6a.19.10.2016) tarafından onaylanmıştır.
1. Reaktiflerin hazırlıkları
NOT: Fare oküler yüzeyinden birincil hücrelerin/kök hücrelerin türemesi bu protokolün kapsamı dışındadır. Bu nedenle, UV-C maruziyet dozları, ROS, canlı ve ölü hücreleri ve bunların nicel değerlendirmek için reaktif hazırlık göstermek. Reaktiflerin ilgili hacimleri için tablo 1'e bakınız ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
DCFDA hücrelerde ROS tespit etmek için bir gösterge olarak kullanılan floresan kimyasal olarak azaltılmış bir formu renksiz bir boya. Bu boya hücrelerin içinde sıkışıp alır ve kolayca floresan diklorodihidrolüorescein okside edilir (DCF), hangi yeşil floresan yayan. Bu floresan floresan mikroskopi ile tespit edilebilir. Hücreler şu şekilde görüntülenebilir ve ROS birikimi ile ilişkilendirilebilir: (i) ROS'suz canlı hücreler yüksek mavi floresan yontabilir; (ii) ROS birikimi ile canlı hücreler düşük yeşil floresan ile yük.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada açıklanan DCFDA boyama yöntemi, UV-C radyasyonu ile tedavi edilen fare primer göz canlı hücrelerinde ROS'un görüntülenmesine olanak sağlar. Bu boyama yönteminin bir avantajı da araştırmacılar UV-C hemen etkilerini incelemek için izin olmasıdır (3 saat uvc sonrası maruz kalma) canlı hücreler ve ROS pozitif yüzdesi için eşzamanlı numaralandırma, yanı sıra, ölü hücreler. Ayrıca, boyama yöntemi canlı hücreler üzerinde kullanıldığından, hücreler UV-C radyasyonunun gecikmiş etkilerinin incelenmesi için daha uzun bir sür.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar bio-Rad Laboratories India Private Limited'den makaleye sponsor olduğu için fon desteği aldılar.
Teşekkürler
Yazarlar, altyapı tesisleri için Yenepoya Araştırma Merkezi, Yenepoya (Üniversite olarak kabul edilir) desteği kabul.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 2 ', 7'-Diklorofloresein diasetat (DCFDA) | Sigma | D6883 | 2 ', 7'-Diklorofloresein diasetat florojenik probdur ve hücrelere geçirgendir. Reaktif oksijen türlerinin miktar tayini için kullanılır. |
| Hücre kültürü kabı (35 mm) | Eppendorf | SA 003700112 | Hücreleri kültürlemek için steril kaplar. |
| DMEM Yüksek Glikoz HiMedia | AT007 | En yaygın kullanılan hücre kültürü ortamı, 4500 mg / L glikoz içerir. | |
| Fetal Sığır Serumu, AB Menşeili | HiMedia | RM99955 | Hücre kültürü ortamının en önemli bileşenlerinden biridir. Büyüme faktörleri, amino asitler, proteinler, A, D, E ve K gibi yağda çözünen vitaminler, karbonhidratlar, lipitler, hormonlar, mineraller ve eser elementler sağlar. |
| GlutMax | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 35050061 | L-glutamine ek ve alternatif olarak kullanılır. Hücre canlılığını ve büyümesini iyileştirmeye yardımcı olur. |
| HL-2000 Hybrilinker | UVP | Hibridizasyon fırını / UV çapraz bağlayıcı | |
| Hoechst 33342 | Sigma | B2261 | Hoechst boyası hem canlı hem de ölü hücrelere karşı geçirgendir. Hücrenin ölü ya da diri olmasına bakılmaksızın çift yıldızlı DNA'ya bağlanır. |
| Matrigel | Corning | Bodrum membran matrisi | |
| MEM Esansiyel Olmayan Amino Asitler (100X) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11140050 | Hücre büyümesini ve canlılığını artırmak için ek olarak kullanılır. |
| Penisilin-Streptomisin (Pen-Strep) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Kültürde bakteriyel kontaminasyonu önlemek için penisilin ve streptomisin kullanılır. |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170 | Sadece ölü hücrelere karşı geçirgen olan floresan boya. DNA ile bağlanır ve canlı ve ölü hücreleri ayırt etmeye yardımcı olur. |
| TryplE Express | Thermo Fisher Scientific | Nazik hücre ayrışma ajanı | |
| ZOE Floresan Hücre Görüntüleyici | Bio-rad |
Kaynaklar
- Gipson, I. K. The ocular surface: the challenge to enable and protect vision: the Friedenwald lecture. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (10), 4391-4398 (2007).
- Sridhar, M. S. Anatomy of cornea and ocular surface.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
