Floresan Problar ve Lignin Bitki Kesitlerinde Doğal Otofloresan Dayalı SFLIM Ile Etkileşimlerinin Ölçülmesi

Glikoz gibi monomerik şekerler içine lignoselüloz hidrolize enzimler gerektirir. Onların aktivitesi enzimler ve lignin arasında non-spesifik etkileşimlerin kurulması ile ölçülü olduğu bilinmektedir¹,^2,ikinci bir hidrofobik polimer ve lignoselüloz önemli bir bileşeni olan³. Bu nedenle, bu tür etkileşimleri doğrudan hücresel ölçekte kantitatif olarak ölçmek enzim katalitik aktivitesini optimize etmek ve lignoselüloz tedavi öncesi^4'üoptimize etmek için ele alınması gereken bir sorundur.

Förster (veya floresan) rezonans enerji transferi (FRET) ölçümü biyomoleküllerin etkileşimini yerinde değerlendirmek için tercih edilir bir yöntemdir. Bu olmayan Radyatif enerji transferi farklı koşulları yerine getirmeleri halinde bir donör ve bir alıcı florofor arasında oluşabilir. Donör emisyon spektrumu, en azından kısmen, kabul eden uyarma spektrumu örtüşmelidir. Bu nedenle florofor seçimi bu tür deneyler için çok önemlidir. Daha sonra, aktarım verimliliği onların mesafe⁵ altıncı güç ile azalır ve sadece her iki molekül yakın yakın (genellikle nanometre aralığında) oluşur. Dipol-dipol oryantasyonu gibi transfer verimliliğini diğer acil durumlar değiştirebilir, ancak floroforların esnekliği varsa azaltılır.

FRET farklı tekniklerle ölçülebilir ve^literatürdedetaylı açıklamalar bulunabilir 6^,7. Kısacası, ana yöntemler emisyonu temel: i) hangi kabul veya emisyon floresan varyasyon takip edilir ve esas olarak nitel sonuçlar sağlar duyarlı emisyon; ii) donör emisyon floresanının kabul edilen den önce ve sonra ölçüldüğü kabul veya fotobeyazrlama (Bu durumda, daha hassas FRET tahminleri elde edilebilir ancak sabit numunelere uygulanan güçlü lazer gücü gerektirir); ve iii) kabul edenin varlığında donör için azalan yaşam boyu ölçümü. Bu yöntem belirli aletler gerektirir ve floroforlar arasında hassas ve hassas etkileşim ölçümleri sağlar. Floresan problar ve lignoselüloz arasındaki FRET ölçümü göz önüne alındığında, ana zorluk lignoselüloz tek bir iyi karakterize florofor değildir: güçlü bir yerli ve spectrally-geniş otofloresans vardır, esas olarak lignin kaynaklanan, ve biyokütle türlerine bağlı^8,9.

Bu yazıda, ahşap/bitki örneklerinin bölümlerine uyarlanmış yeni ve özgün bir prosedür öneriyoruz. Bu sFLIM bazlı yöntem, yerli lignoselüloz örneklerinde floresan problar ve lignin arasındaki nicel FRET ölçümlerinin yolunu açar.

1. Örnek hazırlama

NOT: Örnekleri hazırlamak için ardışık adımlar Şekil 1'deaçıklanmıştır.

1. Bitki numunesi hazırlama
   1. Ahşap gövdelerden veya parçalardan, 1 cm uzunluğundaki numuneleri, yapılarına zarar vermeden jiletlerle kesin.
   2. Numuneleri %100 PEG'e ulaşana kadar suda seyreltilmiş PEG konsantrasyonunun art arda çözeltilere batırarak polietilen glikol (PEG) ortamına yerleştirin.
      1. Suyu çıkarmak için numuneyi vakumun altına yerleştirin.
      2. Numuneleri %30 v/v PEG'de 24 saat boyunca hafifçe karıştırın.
      3. Örnekleri %50 v/v PEG'de 24 saat boyunca hafifçe karıştırın.
      4. 70 °C'de 24 saat boyunca %100 PEG'de numuneleri hafifçe karıştırın (saf PEG oda sıcaklığında katıdır).
   3. Numuneleri 70 °C'de (sıcak plakaüzerine) kapsüllere yerleştirin ve oda sıcaklığına ulaşıncaya kadar sıcaklığı kademeli olarak düşürün.
   4. Bir mikrotom ve tek kullanımlık bıçaklar kullanarak bu PEG bloklardan 30-60 μm kalınlığında düz kesitleri dikkatlice hazırlayın.
   5. Peg'i bölümlerden çıkarmak için 5 dk boyunca art arda üç banyoda bölümleri toplayın ve yıkayın.
2. Floresan sonda hazırlama
   1. 30 mM fosfat tampon çözeltisini pH 6.0'da hazırlayın.
   2. PEG rhand dextran rhodamine prob tozu tartın.
   3. 0,1 g/L'lik son konsantrasyonda karanlıkta 1 saat boyunca cam bir şişede sürekli karıştırarak sonda tozunu tampona çözün.
3. Bitki numunesi boyama
   1. Karanlıkta plastik bir tüpte (tüp başına en fazla 3 bölüm) 72 saat (karıştırma yok) için 500 μL floresan probu (bkz. 1,2,3) ile kuluçka bölümleri.
   2. Bir fırça ile bir bölüm pick-up, temiz bir levha ile tampon adsorb (bölümü kurutma önlemek), ve sonra bir kapak cam ve #1.5H coverslip arasında kuluçka bölümleri monte.

2. Floresan sayılyıç ömrü ve spektral ölçüm sistemi kalibrasyonu

NOT: SFLIM ölçümü için tam iş akışı Şekil 2'desunulmuştur.

1. sFLIM dedektörünün spektral pencere genişliğini belirleyin.
   1. 0,17 μm cam alt ile bir kültür kutusuna üre kristalleri koyun.
   2. Kültür kutusunu bir mikroskop örnek tutucuya yerleştirin ve 20x hedefini seçin.
   3. 900 nm dalga boyuna ve %2 güce sahip bir Ti:Sa lazerseçin ve taramayı açın.
   4. SFLIM dedektöründeki ikinci harmonik sinyali toplayın.
      NOT: İkinci harmonik sinyal 450 nm tam yarım uyarma dalga boyunda yayılır; anlık iken, bu ölçü aynı zamanda sistemin enstrümantal yanıt fonksiyonu sağlar.
   5. İkinci spektral kanalda (462,5 nm) ikinci harmonik sinyal toplanana kadar lazer uyarma dalga boyunu 900'den 980 nm'ye kademeli olarak ayarlayın.
   6. Spektral pencere uzunluğunu (12,5 nm) belirleyin.
   7. Spektral aralık beklenenden farklıysa, aşağıdakileri yaparak sorun giderme.
      1. Lazeri 910 nm'ye ayarlayın.
      2. Sadece ilk kanaldaki ikinci harmonik sinyali ölçmek için ızgara konumunu kaydırma tekerleği ile hareket ettirin (ilk kanal sınırı).
      3. Lazeri 935 nm'ye ayarlayın.
      4. Sadece birinci kanaldaki ikinci harmonik sinyali ölçmek için ızgara konumunu kaydırma tekerleği ile hareket ettirin (ikinci kanal sınırı).
2. Genel spektrometre kanallarının kalibrasyonu
   1. Aynayı mikroskop aşamasına yerleştirin.
   2. Görünür sürekli lazeri seçin (458 nm, %1 güç).
   3. SFLIM dedektöründeki yansıma sinyalini toplayın ve fotonların uygun spektral kanalda ölçülüp ölçülmedigini kontrol edin.
   4. Tüm mevcut sürekli lazerlerle (514 nm, 561 nm ve 633 nm) 2.2.2 ve 2.2.3 adımlarını tekrarlayın.
   5. Spektral kanal beklenenden farklıysa, kaydırma tekerleği ile ızgara konumunu hareket ettirin ve 2.1 ve 2.2 adımlarını tekrarlayın.

3. Örnek floresan karakterizasyonu

1. Film tutucu aksesuarı (örneğin, Jasco FP-8500 cihazı) ile donatılmış bir spektroflorometrede, bitki kesiti örneğini yerleştirin (floresan prob ile kuluçkaya yatırılamaz).
2. Floresan emisyonungenellikle 300-600 nm aralığında ölçün, numuneyi ise genellikle 250-550 nm aralığında heyecanlandırın.
3. Floresan şiddetini uyarma ve emisyon dalga boylarına karşı çizin ve 3B floresan haritasını çizin.
4. Çizimden maksimum uyarma/emisyon alanını belirleyin.

4. Spektral FRET ölçümü

1. Otofloresan kalibrasyon
   1. Hedef 20x'i seçin (NA: 0.8).
   2. 750 nm iki foton lazer uyarma ayarlayın.
   3. Buğday saman (WS) tek başına bitki bölümü slayt ve coverslip arasında yerleştirin.
   4. Yazılımda aşağıdaki parametreleri uygulayın. Lambda moduna geçin. 9,7 nm çözünürlüğe sahip spektral dedektör ChS'yi seçin. 420 ile 722 nm arasındaki spektral aralığı seçin.
   5. Görüntüyü edinin.
   6. Donör emisyon tepe noktasını (bu kurulumla 470 nm) belirleyin.
2. Acceptor kalibrasyonu
   1. 0,17 μm cam alt ile bir kültür kutusuna rhodamine bazlı floresan problar yerleştirin.
   2. Görüntüyü aynı ayarda edinin.
   3. Kabul eden emisyon tepe noktasını (bu kurulumla 570 nm) belirleyin.
3. SFLIM ölçümleri için donör sadece emisyon (bu kurulum ile 460-490 nm) olarak maksimum "WS tek başına" sinyali ve hiçbir kabul sinyali ile spektral aralığı belirleyin.
4. Örnek ölçümü
   1. Lekeli bitki bölümünü slayt ve kapak lı kayma arasına yerleştirin.
   2. Görüntüyü aynı ayarda edinin.
   3. LSM dosyasını kaydedin.
   4. Güçlü bir FRET olayını "WS tek başına numune" ile karşılaştırıldığında donör emisyon zirvesinde ki azalma ve rhodamine örneğine kıyasla kabul edici emisyon zirvesinde ki artışla ilişkilendirin.

5. sFLIM ölçümleri

NOT: sFLIM kurulumu için kullanılan sistem, daha önce¹⁰olarak açıklandığı gibi bir zaman etki alanı sFLIM kurulumudur. Dik mikroskop ve çeşitli zaman ilişkili tek foton sayma kartları ve konfokal mikroskop üreticileri kullanılabilir ve protokol buna göre uyarlanmalıdır.

1. Sistemi sFLIM moduna geçin.
   1. Konfokal mikroskobu 4.1.1 ve 4.1.2'de açıklandığı şekilde ayarlayın.
   2. Floresan fotonları sFLIM dedektörüne göndermek için yazılımdaki Descanned olmayan moduna geçin.
   3. SPC150'de foton sayılmasına izin vermek için sFLIM edinimi etkinleştir metodunu etkinleştir metodunu ayarlayın.
   4. SPC150'de 30 s zaman koleksiyonunu seçin.
   5. CFD'nin 1 x 10⁵ ile 1 x 10⁶arasında olup olmadığını kontrol edin.
      DİkKAT: TCSPC kartında ölçülen foton sayısının lazer uyarma frekansının her zaman %1'inden az olduğundan emin olun (Bu kurulumda lazer uyarma frekansı 80 Mhz'dir ve algılama oranı herhangi bir pikselde 800 kHz'yi geçemez ve bir yığın etkisinden kaçınmak için^11).
2. "TEK BAŞıNA" bitki bölümünü slayt ve kapak kayması arasına yerleştirin.
   1. Lazer tetkikini sağlamak için yazılımı Sürekli moduna ayarlayın.
   2. Örnekteki ölçüm alanını seçin.
   3. SPC150'ye Başlat'ı tıklatın.
   4. sdt dosyasını kaydedin.
   5. Koşul başına en az 10 örnek için işlemi tekrarlayın.
3. Lekeli bitki bölümünü slayt ve kapak lı kayma arasına yerleştirin.
   1. Adımları 5.2.1 - 5.2.5'i tekrarlayın.

6. sFLIM analizi

1. "Yalnızca WS"de edinilen sFLIM verilerini seçin ve Dosyayı kullanarak SPCImage yazılımına aktarın | İthalat.
2. Sığdırama parametrelerini seçin.
   1. Seçenekten | Model, Eksik çoküstel seçin: 12,5 ns.
   2. Seçenekten | Tercihler, Enstrümantal Yanıtı otomatik olarak hesapla'yıseçin.
   3. Ana panelin sağ menüsünden 2 üstel sığdırmayı seçin:
      
3. Her kanal için montaj modelini uygulayın ve uygun parametreleri elektronik tabloya kaydedin₍₁, a₂, t₁, t₂).
4. Kanallar ve deneyler arasında karşılaştırma için, bir elektronik tablodaki ortalama floresan ömrünü hesaplayın (T_m):
   
5. Tüm kanallardaki tüm örneklerin (en az 10) ortalama kullanım ömrünü hesaplayın.
   1. Donör kanallarda T_m'yi analiz edin (kanal 1'den 3:460-490 nm'ye kadar) ve en yüksek foton numarasını gösteren ve lignin maksimum emisyonuna karşılık gelen özel kanalı (Kanal 2 467,5 - 480 nm'ye karşılık gelen) belirleyin. Kanal 2'deki değerler adım 6.7'de kullanılmalıdır.
6. Lekeli WS'de edinilen sFLIM verilerini seçin ve Bunları SPCImage yazılımına aktarın.
   1. Adımları 6.1-6.4'e tekrarlayın.
7. Önceki seçilen kanal WS Alone (T_mD)ve lekeli bitki numunesi (T_mDA)donör için FRET verimliliği E_FRET hesaplayın:
   
8. WS ve örnek arasında sFLIM ve E_FRET değerlerini karşılaştırın.
   1. WS ile örnek arasında homojen bir yaşam boyu azalma ile ilişkili pozitif bir E_FRET'in fret olayı olarak analiz edilmesi gerektiğini düşünün (ayrıntılar için Spriet ve ark.¹² ve Terryn ve ark.^10'un temsili sonuçları ve çalışmalarına bakın).
   2. FRET ve lignin sıkıştırma seviyesinin bir karışımına bağlı olarak farklı dağılmış bir ömür boyu düşüşü düşünün ve moleküler etkileşimler olarak yorumlamayın.
   3. Ölçülebilir FRET sinyalinin yokluğu olarak hiçbir ömür boyu değişiklik düşünün, ancak lignin ile etkileşim eksikliği olarak değil

Lignin ve floresan etiketli moleküller arasındaki moleküler etkileşimleri parçalama sFLIM yeteneğini göstermek için, ilk olarak üç farklı örnek kullandık(Şekil 3):yerli buğday samanı (WS), peg ile kuluçkaya yatan yerli buğday samanı rhodamine (PR10) ve eşkenar izam ile etiketlenmiş yerli buğday samanı (DR10). DR10 inert olması gerekiyordu pr10 lignin ile etkileşime olduğu bilinmektedir13,14,15. sFLIM eğrileri(Şekil 3, üstte) referans örnek (WS) ve iki etkileşim olgusu (DR10 ve PR10) arasında elde edilebilen bazı değişiklikler gösterir. Gerçekten de, bir ilk kolayca rhodamine emisyon aralığına karşılık gelen spektral bölgelerde floresan artış fark edebilirsiniz. Üç ilk kanal foton bozunma eğrileri dikkatli gözlem de PR10 için daha DR10 için daha güçlü bir çekim ortaya koymaktadır. Foton bozunma eğrileri takılmıŠve her kanal ortalama floresan yıllık hesaplaÅ tıktan sonra FRET imzası daha belirgin hale gelir(Şekil 3, alt). Gerçekten de, floresan ömrü alternatif olarak artar ve WS örnek için floresan spektrum boyunca azalır iken, açık bir FRET imza ile hem PR10 ve DR10 için gözlenir: 1) donör sadece emisyon kanalında sabit bir ömür boyu değer (3 ilk kanallar, mavi); ve 2) spektral kanal da artan bir floresan ömrü yüksek ömür boyu donör florofor artan bir katkıkarşılık.

Net FRET belirlendikten sonra, lignin floresan ömür müddeti (kanal 2) karşılaştırılması, WS (0,47 ns), DR10 (0,42 ns) ve PR10 (0,36 ns) arasındaki yaşam boyu azalmanın nicelleştirilmesini sağlar ve böylece lignin ile hem PR10 hem de DR10, PR10'a daha güçlü bir yakınlık la karşı.

Farklı etkileşim düzeylerini ölçmek için bu yöntemin alaka düzeyini göstermek için, işlenmiş bitki örnekleri üzerine enzim erişilebilirliğini taklit eden üç örnek daha seçiyoruz: 5 kDa ve 20 kDa (PR5 ve PR20) iki kontrastmoleküler molekül ağırlığının PR'ı ile birlikte asitle tedavi edilmiş WS (AWS). SFLIM imzalarının dikkatli bir şekilde incelenmesinden sonra lignin floresan ömrü ayıklanır (Şekil 4). Daha önce belirtildiği gibi, lignin floresan ömrü çevresi tarafından değiştirilebilir16,17. Asit tedavisinden sonra, AWS'deki floresan yaşam boyu önlemleri (0,28 ns) WS (0,47 ns) için önceden ölçülenden daha düşük olur ve bu da yaşam boyu azalmanın kesin yorumlanması ve test edilen her durum için negatif kontrol gereksinimini doğrular. Beklendiği gibi, lignin ile etkileşimde iken AWS pr eklerken güçlü bir yaşam boyu azalma gözlenir. Ayrıca, etkileşim PR5 ile daha güçlüdür (0.16 ns) PR20 (0.16 ns), hangi onların hidrodinamik yarıçap ölçümü ile tutarlı (2.3 nm ve 4.8 nm PR5 ve PR20 için, sırasıyla), farklı steric kısıtlamaları indükleyen ve böylece lignin PR5 daha yüksek erişilebilirlik.

Her iki deney de, lignin enzimlerle olan etkileşimlerini, boyutlarına ve bitki örneklerine göre tedavi öncesi olarak ince bir şekilde değerlendirmek için bu yöntemin alaka durumunu göstermektedir.

Şekil 1: Örneklerin farklı hazırlama adımları. Buğday saman (WS) (A) ilk boyutu azalır(B) PEG orta gömülü olmak (C). Blok tek kullanımlık bıçaklar(D)ile donatılmış bir mikrotom kullanılarak kesilir. Yıkandıktan sonra, ortaya çıkan kesitler (E) PEG veya dextran etiketli-rodazin çözeltisi (F)kuluçka için yerleştirilir. Etiketli bölümler sFLIM ölçümleri için monte edilmiştir (G). Pul çubukları 2 cm (A), 1 cm (B ve C), 200 μm (E ve G'dir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Spektral FRET tabanlı etkileşim ölçümlerinin tam iş akışı. Şekil spektral floresan yoğunluğu ve ömür boyu ölçümleri birleştiren kurulum sunar. Spektral floresan görüntüleri konfokal mikroskop ile elde edilir ve her spektral aralık için sırayla floresan ömürleri sFLIM dedektörü ile ölçülür. Foton bozunma eğrilerinin analizi, numune ile ilgi molekülleri arasındaki etkileşimlerin doğru belirlenmesini sağlar. Kalibrasyonlar eserlerden kaçınmak için işlenmeli. İlk olarak, sFLIM dedektörü spectrally kalibre edilmesi ve enstrümantal tepki fonksiyonu kontrol edilmelidir. İkinci olarak, karmaşık otofloresan sinyali, bir kabul leyici molekül üneklenmesinden önce her kanaldaki floresan ömrünü belirlemek için her numune için tam olarak kalibre edilmelidir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Temsilci sFLIM ölçümleri. sFLIM eğrileri (üst panel) yerli buğday samanı (WS), WS PEG rhodamine (WS +PEG) ve dextran rhodamine (WS +DEX) ile etiketlenmiş yerli buğday saman ile kuluçka ya da dekstran ile inkübe edilmiştir. Her örnek için, sFLIM eğrileri iki üstel bozunma modeli ile donatılmıştır ve ortalama floresan ömrü her kanal için hesaplanmıştır (alt panel). WS+PEG ve WS+DEX örnekleri, otofloresan ve rodaminin karışık emisyonuna karşılık gelen kanalda ömür boyu artışla ilişkili olarak yalnızca otofloresansa (üç ilk çubuk) karşılık gelen kanalda floresan ömründe bir azalma sunar. Bu davranış lignin ve rhodamine etiketli moleküller arasındaki bir FRET olayının karakteristik özelliğidir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Kanalın lignin otofloresansına karşılık gelen floresan yaşam boyu analizi. SFLIM imzaya dayalı bir FRET olayı nın doğrulanmasından sonra ortalama floresan ömrü asitle işlenmiş WS (AWS) ile pr5 veya PR20 (sırasıyla 5 kDa ve 20 kDa) ile birlikte ölçüldü. Her iki PR örnekleri ömür boyu azalma mevcut iken, küçük lignin ile daha güçlü bir moleküler etkileşim ortaya, daha güçlü bir ömür boyu azalma ile karakterizedir. Yöntem böylece her ikisi arasında ayrım yapmak için yeterince hassastır (ortalama değer ve standart hata temsil edilir, durum başına n>10). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.