Yöntem makalesi

NMR tabanlı aktivite bileşik Inhibisyonu belirlenmesi için Assays, ıC50 değerleri, Artifactual aktivite, ve Nükrenoside Ribohidolases tüm hücre aktivitesi

DOI:

10.3791/59928

⸱

30 Haziran 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Adelphi University, 2Department of Chemistry, Washington University in St. Louis, 3Department of Chemistry, Boston University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NMR tabanlı aktivite, iki nükle ribohidolaz enzimin inhibitörlerinin tanımlanması ve karakterize edilmesi için geliştirilmiştir. 500 μM ve 250 μM ' de ilk bileşik olarak yapılan protokoller, ıC50 değerlerinin belirlenmesi, deterjan sayacı ekranı, atlama-seyreltme sayacı ekranı ve E. coli tüm hücrelerde saptanması için doz-yanıtı sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NMR spektroskopisi, özellikle parça taraması bağlamında ilaç keşfinde enzim inhibitörlerinin tanımlanması ve karakterize edilmesi için kullanılır. NMR tabanlı aktivite, bu zayıf inhibitörleri tespit etmek için gerekli olan test bileşiklerinin daha yüksek konsantrasyonlarda çalışmak için idealdir. NMR deneyinde Dinamik Aralık ve kimyasal vardiya dağılımı, substrat, ürün ve test bileşiklerinin rezonansları kolayca çözebilir. Bu spektrofotometrik analizlerle tezat, hangi okuma-Out parazit sorunları genellikle çakışan UV-Vis emilim profilleri ile bileşiklerin ortaya çıkar. Buna ek olarak, onlar muhabir enzimleri eksikliği beri, tek enzim NMR asdiyor birleşme eğilimli değildir-assay yanlış pozitif. Bu nitelik onları ortogonal olarak yararlı hale getirir, geleneksel yüksek verimlilik taramaları tamamlayan ve en iyi değerlendirme kriterleri tamamlar. 500 μM ve 250 μM ' de ilk bileşik bilgi için ayrıntılı protokoller sağlanır, ıC50 değerleri, deterjan sayaç ekranı, atlama-seyreltme sayacı ekranı, ve E. coli tüm hücrelerde de saptanması için doz-yanıtı sağlar. Yöntemler iki nükribohidolaz enzimleri kullanılarak gösterilmiştir. 1H NMR kullanımı purine özgü enzim için gösterilir, 19F NMR pyrimidine özgü enzim için gösterilir iken. Protokoller genellikle substrat ve ürün rezonansları gözlemlenebilir ve NMR spektroskopisi ile ayırt edilen herhangi bir enzim için geçerlidir. İlaç keşfi bağlamında en yararlı olmak için, substrat son konsantrasyonu 2-3x onun Km değeri daha fazla olmalıdır. NMR deneyi seçimi, mevcut NMR enstrümantasyon yanı sıra enzim reaksiyonu ve substratlar bağlıdır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Atom manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi, enzim reaksiyonları1,2olarak karakterize etmek ve izlemek için iyi kurulmuştur. Kimyasal vardiya ve kavrama desenleri farklılıkları substrat ve ürün rezonansları ayırt etmek için kullanılır, ve bağıl rezonans yoğunlukları reaksiyon yüzdesini ölçmek için kullanılır. Hem substrat tüketimi hem de ürünün oluşturulması NMR spektrumunda doğrudan görülmektedir. Bu spektrofotometri veya floresans spektroskopisi ile karşıtlık, hangi reaksiyon süresi ders tüketilen veya oluşturulan bazı kimyasal türler için atflama emilebilir bir değişiklik ile belirtilir. Diğer yöntemlerle olduğu gibi, NMR sıcaklık, pH veya diğer çözüm koşullarının bir fonksiyonu olarak enzim reaksiyonları incelemek için kullanılabilir ve inhibitörlerin etkileri tespit edilebilir.

Daha yakın zamanda, NMR tabanlı enzim aktivitesi, parça taraması3,4için gösterildi. NMR tabanlı testler, bu zayıf inhibitörleri tespit etmek için gerekli olan test bileşiklerinin daha yüksek konsantrasyonlarda (genellikle 1 mM kadar yüksek) çalışmak için idealdir. NMR deneyinde Dinamik Aralık ve kimyasal vardiya dağılımı, substrat, ürün ve test bileşiklerinin rezonansları kolayca çözebilir. Bu, Okunma parazitlerinin sıklıkla çakışan UV-Vis emilim profilleriyle bileşiklerden ortaya çıktığı spektrofotometrik analizlere olumlu bir şekilde göre karşılaştırılır. Buna ek olarak, onlar muhabir enzimleri eksikliği beri, tek enzim NMR asdiyor birleşme eğilimli değildir-assay yanlış pozitif. Bu avantaj onları ortogonal olarak yararlı kılar, geleneksel yüksek verimlilik taramaları tamamlayan ve üst düzey kriterlere göre değerlendirme5.

Araştırma laboratuarımızda, NMR tabanlı aktivite teşhis ve Trichomonas vaginalis nükvoyan ribohydrolases inhibitörleri değerlendirmek için kullanılır. T. vaginalis paraziti en yaygın olmayan viral cinsel yolla bulaşan hastalık6neden olur. Mevcut terapilere direnç artırma7 , ana hedefleri temsil eden temel nükle kurtarma yolu enzimleri ile, yeni, mekanizma tabanlı tedaviler için ihtiyaç sürüş olduğunu8. NMR tabanlı aktivite her iki pyrimidine-ve purine özgü enzimler için geliştirilmiştir, üridin nükl tarafı ribohydrolase (Unh)9, ve adenozin/guanozin tercih nükvanoside ribohidolaz (agnh)10. Bu iki enzim tarafından katalizlenmiş reaksiyonlar Şekil 1' de gösterilir. NMR asdiyor kimyasal başlangıç noktaları için parça kitaplıkları ekran için kullanılan, ıC50 değerlerini belirlemek, ve ot dışarı toplama tabanlı veya kovalent bağlama inhibitörleri11. Aynı Ayrıca tüm hücrelerde enzim etkinliğini değerlendirmek için tercüme ediliyor12.

500 μM ve 250 μM ' de ilk bileşik bilgi için ayrıntılı protokoller sağlanır, ıC50 değerleri, deterjan sayaç ekranı, atlama-seyreltme sayacı ekranı, ve E. coli tüm hücrelerde de saptanması için doz-yanıtı sağlar. Protokoller genellikle substrat ve ürün rezonansları gözlenen ve NMR spektroskopisi tarafından ayırt edilebilir herhangi bir enzim için geçerlidir. Basitlik için üç varsayım yapılmıştır. İlk olarak, substrat belirtilmedi. NMR tabanlı aktivite için yararlı olması için, substrat son konsantrasyonu 2-3x Km değeri4daha fazla olmalıdır. Gösterilen örneklerde, son Adenozin ve 5-fluorouridin konsantrasyonları sırasıyla 100 μM (km = 54 μM) ve 50 μm (km = 15 μm) ' dir. Protokollerde, bu konsantrasyonlar elde 12 μL 5 mM adenozin veya 12 μL 2,5 mM 5-fluorouridine karşılık gelir.

Ikinci olarak, protokollerde sağlanan enzim miktarı, 5 μL, yaklaşık% 75 oranında substrat ürüne 30 dakika içinde dönüşmesine neden olmak için gereken miktara karşılık seçildi. Bu miktar genellikle bir arıtılmış enzim stoktaki büyük bir seyreltme temsil eder ve seyreltme her enzim için önceden belirlenmelidir. Saflaştırılmış agnh ve Unh enzim stok çözümleri, birkaç bin reaksiyon için yeterli enzim sağlayan plakaya-80 °c ' de saklanır. Böylece, seyreltme faktörü ideal olarak sadece her birkaç ayda bir belirlenmeli veya doğrulanmalıdır. Üçüncü olarak, belirli 1D NMR deneyi belirtilmemiş. Temsili sonuçlarında, 1h NMR agnh10 ve 19F NMR için gösterilen Unh9için gösterilir, NMR deneyi ile ilgili referanslar açıklanmıştır. NMR deneyi seçimi, mevcut NMR enstrümantasyon yanı sıra enzim reaksiyonu ve substratlar bağlıdır. Son olarak, tarif edilen deneysel yaklaşımın nicel NMR (qnmr)13,14' ün sıkı gereksinimlerine uymaz olduğunu belirtmelidir. Protokolde, yüzde reaksiyon, mutlak konsantrasyonları belirlemekten ziyade, her spektrumdaki aynı rezonansın yoğunluğunda göreli değişiklikler kullanılarak belirlenir. Bu yaklaşım, qNMR için gerekli olan iç veya dış standartların yanı sıra veri edinme ve işleme değişikliklerinin de gereksinimini ortadan kaldırır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1.500 μM ve 250 μM ' de ilk test bileşiği tespit edildi

  1. Reaksiyonları için substrat ve test bileşiği hazırlayın.
    1. Su içinde alt substrat (adenozin veya 5-fluorouridine) ve 50 mM test bileşiği dökerli dimetil sülfoxid (DMSO) stok çözümleri hazırlayın. Kullanım substrat çözeltisi konsantrasyonları için giriş bölümüne bakın.
    2. 12 μL substrat (adenozin veya 5-fluorouridine) her dört 1,5 mL mikrofuge tüpler, 1-4 ekleyin.
    3. 6 μL 'i 1 (0 dk. kontrol) ve 4 (30 dk. kontrol) ' ya katılan DMSO 'ya ekleyin. Tüp 2 ' ye 6 μL test bileşiği ekleyin. 3 μL test bileşiği ve 3 μL 'den boru 3 ' e kadar döşeli DMSO ekleyin.
  2. Yeterli reaksiyon stok çözümü hazırlayın.
    Not: stok çözümü, her biri 517 μL tampon, 60 demeryum oksit ve 5 μL enzim çözeltisi (AGNH veya UNH) içeren beş reaksiyon içindir. Kullanmak için enzim çözeltisi konsantrasyonları için giriş bölümüne bakın.
    1. 15 mL Konik Tüpe 2,59 mL reaksiyon tamponu (50 mM potasyum fosfat, 0,3 M KCl, pH 6,5) ekleyin. Konik Tüpe 300 μL döeryum oksit ekleyin. Konik için 25 μL enzim çözeltisi (AGNH veya UNH) ekleyin.
    2. Konik tüpü hafifçe karıştırmak için iki kez ters çevirin.
  3. Aynı anda 0 dk kontrol reaksiyonu başlatmak ve gidermek. Transfer 582 μL reaksiyon stok çözeltisi temiz bir mikrofuge tüpü. Bu mikrofuge tüpüne 10 μL 1,5 M HCl ekleyin. Kombine 592 μL 'i mikrofuge borusu 1 ' e aktarın. Numuneyi yavaş ama kasıtlı bir moda iki kez aspirate ve dağıtır.
  4. Başlatma ve geri kalan üç reaksiyon sendeleyerek moda çalıştırın. Zaman 0 dk, Transfer 582 μL reaksiyonu stok solüsyonu mikrofuge tüp 2. Numuneyi yavaş ama kasıtlı bir moda iki kez aspirate ve dağıtır. Mikrofuge tüpler 3 ve 4 için 30 s aralıklarla tekrarlayın. 30 dakika bekleyin.
  5. Reaksiyonları gidermek. Zaman 30 dk, 10 μL 1,5 M HCl mikrofuge 2 ekleyin. Mikrofuge tüpler 3 ve 4 için 30 s aralıklarla tekrarlayın. Transfer 600 μL çözeltinin her mikrofuge NMR tüpler için.
  6. Her örnekteki 1D NMR spektrumunu edinin. Doğru aşamalı ve düz taban çizgilerini sağlamak için verileri işleme.
  7. Kontrol spektrumları için substrat yüzde dönüşümü hesaplayın.
    1. Spektrumları 0 dk ve 30 dakika kontrolleri için bindirin. 30 dk kontrol ile eşleştirmek için 0 dk kontrol substrat sinyali ölçeklendirin. Bu yüzdeyi not alın.
    2. Yüzde dönüşümünü hesaplayın (100 – adım 1.7.1 'de belirlenen yüzde).
  8. Test bileşiği içeren reaksiyonlar için substrat yüzde dönüşümü hesaplayın.
    1. 0 dk kontrol ve 500 μM test bileşiği içeren ilk reaksiyon için kaplama spektrum. Test bileşiği ile spektrum eşleştirmek için 0 dk kontrol substrat sinyali ölçeklendirin. Bu yüzdeyi not alın. Yüzde dönüşümünü (100 – belirlenen yüzde) hesaplayın.
    2. 250 μM test bileşiği içeren ikinci reaksiyon için tekrarlayın.
  9. Her test bileşik konsantrasyonu için yüzde reaksiyon ve yüzde inhibisyonu hesaplayın.
    1. Yüzde reaksiyon olarak hesaplayın (1.8.1/1.7.2) x 100.
    2. Yüzde inhibisyonu olarak hesaplayın (100 – adım,,, 1.9.1).

2. ıC50 değerlerinin belirlenmesi

  1. Reaksiyonları için substrat ve test bileşiği hazırlayın.
    1. Su içinde alt substrat (adenozin veya 5-fluorouridine) ve 10 mM test bileşiği deuterated DMSO stok çözümleri hazırlayın. Kullanım substrat çözeltisi konsantrasyonları için giriş bölümüne bakın.
  2. 10 mM test bileşiği seri dilüsyonları hazırlayın (dılerated DMSO).
    1. Eklemek 36 μL deuterated DMSO için beş 1,5 mL mikrofuge tüpler, 1 – 5.
    2. Tüp 1 ' e 12 μL 10 mM test bileşiği ekleyin ve karıştırmak için hafifçe dokunun. Test bileşiği şimdi 2,5 mM 'dir.
    3. 12 μL tüp 1 ' den tüp 2 ' ye aktarın ve karıştırmak için hafifçe dokunun. Test bileşiği şimdi 0,63 mM 'dir. 12 μL tüp 2 ' den Tüp 3 ' e aktarın ve karıştırmak için hafifçe dokunun. Test bileşiği şimdi 0,16 mM 'dir. 12 μL Tüp 3 ' ten tüp 4 ' e aktarın ve karıştırmak için hafifçe dokunun. Test bileşiği şimdi 0,04 mM 'dir. 12 μL tüp 4 ' ten 5 ' e aktarın ve karıştırmak için hafifçe dokunun. Test bileşiği şimdi 0,01 mM 'dir.
  3. Hazırlamak 14 1,5 mL mikrofuge tüpler reaksiyonlar için.
    1. 14 1,5 mL mikrofuge tüpleri, 1-14 her biri için 12 μL substrat (adenozin veya 5-fluorouridine) ekleyin.
    2. 12 μL 'i 1 (0 dk. kontrol) ve 14 (30 dk. kontrol) ' a katacak olan DMSO 'ya ekleyin.
    3. 2 ve 3 numaralı tüplere 12 μL 10 mM test bileşiği ekleyin. 4 ve 5 numaralı tüplere 12 μL 2,5 mM test bileşiği ekleyin. 6 ve 7 numaralı tüplere 12 μL 0,63 mM test bileşiği ekleyin. 8 ve 9 numaralı tüplere 12 μL 0,16 mM test bileşiği ekleyin. 10 ve 11 numaralı tüplere 12 μL 0,04 mM test bileşiği ekleyin. 12 ve 13 numaralı tüplere 12 μL 0,01 mM test bileşiği ekleyin.
  4. 511 ml tampon, 60 μL döeryum oksit ve 5 μL enzim çözeltisi (AGNH veya UNH) içeren 15 reaksiyonu çalıştırmak için yeterli reaksiyon stok çözümünü hazırlayın. Kullanmak için enzim çözeltisi konsantrasyonları için giriş bölümüne bakın.
    1. 15 mL Konik Tüpe 7,67 mL reaksiyon tamponu (50 mM potasyum fosfat, 0,3 M KCl, pH = 6,5) ekleyin. Konik Tüpe 900 μL döeryum oksit ekleyin. Konik için 75 μL enzim çözeltisi (AGNH veya UNH) ekleyin.
    2. Hafifçe karışımı için konik tüp 2x ters çevirin.
  5. Her test bileşik konsantrasyonu için yüzde reaksiyonu belirlemek üzere 1.3 – 1.9 adımlarında (576 μL reaksiyon stok çözümünü kullanarak) özetlenen adımları izleyin.
  6. GraphPad Prism kullanarak ıC50 değerini hesaplayın.
    1. Reaksiyon testi bileşik konsantrasyonların günlüğünü (200 μM, 50 μM, 12,5 μM, 3,13 μM, 0,78 μM, 0,20 μM), yüzde reaksiyonla (her iki değer) ilişkilendiren bir veri tablosu oluşturun.
    2. IC50 değerini ve standart hatayı belirlemek için doğrusal olmayan eğri Sığdır kullanın.

3.100 μM ve 50 μM ' de deterjan sayaç ekranı

  1. Reaksiyonları için substrat ve test bileşiği hazırlayın.
    1. Su içinde alt substrat (adenozin veya 5-fluorouridine) ve 10 mM test bileşiği deuterated DMSO stok çözümleri hazırlayın. Kullanım substrat çözeltisi konsantrasyonları için giriş bölümüne bakın.
    2. Her sekiz 1,5 mL mikrofuge tüpleri, 1 – 8 her biri için 12 μL substrat (adenozin veya 5-fluorouridine) ekleyin.
    3. 6 μL 'i 1 ve 5 (0 dk kontrol) ve 4 ve 8 (30 dak kontrol) ' a kadar olan altı DMSO 'ya ekleyin. 2 ve 6 numaralı tüplere 6 μL test bileşiği ekleyin. 3 μL test bileşiği ve 3 μL ve 3
  2. 517 ml tampon, 60 μL döeryum oksit ve 5 μL enzim çözeltisi (AGNH veya UNH) içeren beş reaksiyonu çalıştırmak için deterjan olmadan yeterli reaksiyon stok çözümünü hazırlayın. Kullanmak için enzim çözeltisi konsantrasyonları için giriş bölümüne bakın.
    1. 15 mL Konik Tüpe 2,59 mL reaksiyon tamponu (50 mM potasyum fosfat, 0,3 M KCl, pH = 6,5) ekleyin. Konik Tüpe 300 μL döeryum oksit ekleyin. Konik için 25 μL enzim çözeltisi (AGNH veya UNH) ekleyin.
    2. Hafifçe karışımı için konik tüp 2x ters çevirin.
  3. 0,01% v/v Triton X-100 deterjan Ile yeterli reaksiyon stok çözümünü hazırlamak için 517 μL tampon, 60 μL döeryum oksit ve 5 μL enzim çözeltisi (AGNH veya UNH) içeren beş reaksiyon çalıştırın.
    1. 2 μL Triton X-100 deterjan, 20 mL reaksiyonuna (50 mM potasyum fosfat, 0,3 M KCl, pH = 6,5) ekleyin. Deterjan çözeltileri 1 gün içinde kullanılmalıdır.
    2. 15 mL konik tüpte% 0,01 Triton X-100 deterjan içeren 2,59 mL reaksiyon tamponu ekleyin. Konik Tüpe 300 μL döeryum oksit ekleyin. Konik için 25 μL enzim çözeltisi (AGNH veya UNH) ekleyin.
    3. Hafifçe karışımı için konik tüp 2x ters çevirin.
  4. 1 – 4 tüpler için, deterjan olmadan reaksiyon stok çözümünü kullanarak, her test bileşik konsantrasyonu için yüzde inhibisyonu belirlemek için 1.3 – 1.9 adımlarında özetlenen adımları izleyin.
  5. 5 – 8 tüpler için,% 0,01 v/v Triton X-100 deterjan Ile reaksiyon stok çözümünü kullanarak, her test bileşik konsantrasyonu için yüzde inhibisyonu belirlemek için 1.3 – 1.9 adımlarında özetlenen adımları izleyin.

4. atlama-seyreltme sayacı ekran deneyleri

  1. Reaksiyonları için substrat ve test bileşikleri hazırlayın
    1. Su içinde alt substrat (adenozin veya 5-fluorouridine) ve 10 mM test bileşiği deuterated DMSO stok çözümleri hazırlayın. Kullanım substrat çözeltisi konsantrasyonları için giriş bölümüne bakın.
    2. 53,8 ekleme μL reaksiyon tampon (50 mM potasyum fosfat, 0,3 M KCl, pH = 6,5) iki 1,5 mL mikrofuge tüpler (her biri), 1 ve 2. 1 ve 2 numaralı tüplere 5 μL enzim (AGNH veya UNH) ekleyin.
    3. 511 iki 1,5 mL mikrofuge tüpleri, 3 ve 4 (her) için reaksiyon tamponu μL ekleyin. 3 ve 4 numaralı tüplere 60 μL döeryum oksit ekleyin. 3 ve 4 numaralı tüplere 5 μL enzim (AGNH veya UNH) ekleyin.
    4. 1,2 (30 dk. kontrol) tüp 1 ' e döşeli DMSO için μL ekleyin. 1,2 tüp 2 ' ye test bileşiği μL ekleyin. 12 μL 'ye döşeli DMSO 'ya Tüp 3 (30 dk kontrol) ekleyin. Tüp 4 ' e 12 μL test bileşiği ekleyin. 30 dakika boyunca kulyur.
  2. 2 1,5 mL mikrofuge tüpleri seyreltme çözeltisi ile hazırlayın.
    1. Her iki 1,5 mL mikrofuge tüpleri, 5 ve 6 her biri için 468 μL reaksiyon tamponu ekleyin. Her tüpe 60 μL döeryum oksit ekleyin (5 ve 6).
  3. Reaksiyonları için dört 1,5 mL mikrofuge tüpleri hazırlayın.
    1. 12 μL substrat (adenozin veya 5-fluorouridine) her dört 1,5 mL mikrofuge tüpler, 7-10 ekleyin.
  4. Atlama-dilüsyonları gerçekleştirin ve reaksiyonları başlatın.
    1. Transfer 528 μL çözeltinin tüp 5 ' ten tüp 1 ' e aktarılması. Numuneyi yavaş ama kasıtlı bir moda iki kez aspirate ve dağıtır. Transfer 528 μL solüsyon tüp 6 ' dan tüp 2 ' ye. Numuneyi yavaş ama kasıtlı bir moda iki kez aspirate ve dağıtır.
    2. Zaman 0 dk, Transfer 588 μL solüsyon tüp 1 ' den tüp 7 ' ye. Örnek 2x yavaş ama kasıtlı bir moda aspirate ve dağıtmak. 30 s aralıklarla, Transfer 588 μL solüsyon tüp 2 ' den tüp 8, Tüp 3 için tüp 9, ve tüp 4 için tüp 10. Numuneyi yavaş ama kasıtlı bir moda iki kez aspirate ve dağıtır. 30 dakika bekleyin.
  5. 7 – 10 tüpler için, her test bileşik konsantrasyonu için yüzde inhibisyonu belirlemek üzere 1,5 – 1.9 adımlarında özetlenen adımları izleyin.

5. bileşik E. coli tüm hücrelerde deneyleri

  1. 10 mL gece kültürü E. coli önceki deneylerde hazırlayın.
  2. NMR deneyleri için E. coli hücrelerini hazırlayın.
    1. 15.000 x g'de 10 dakika boyunca 1 ml 'de hücreleri santrifüjler.
    2. Süpernatant atın ve her bir kısım hücreler 1 ml reaksiyon tampon (50 mm potasyum fosfat, 0,3 M KCl, pH = 6,5) vortexing tarafından pelletini.
  3. Aşağıdaki değişiklikler ile istenen tahlil için bölümler 1 veya 2 izleyin:
    1. 280 μL resuspended hücrelerle reaksiyon stok çözeltisi 280 μL tamponu yerine koyun.
    2. 5 μL tampon ile reaksiyon stok çözümünde 5 μL enzim (AGNH veya UNH) yerine koyun.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şekil 2 , 1H NMR aşağıdaki bölüm 1 ' i kullanarak agnh 'ye karşı iki bileşiği test etme sonuçlarını gösterir. Enzim reaksiyonu en kolay gözlenen ve 8,48 ppm ve 6,09 ppm, sırasıyla adenozin atlet ve Doublet rezonansları ortadan kaybolması ile nicelik, ve bir adenin atlet rezonans görünüm içinde 8,33 ppm olarak gözlenen 30 dk kontrol Spektrum. 500 μM bileşiği 1 ' in varlığında, 8,33 ppm 'de bir adenin rezonans eksikliği tarafından kanıtlandığı gibi hiçbir ürün oluşturulmaz. 250 μM b...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Açıklanan protokoller genellikle birçok enzimler için geçerlidir, substratlar ve/veya ürünlerin NMR spektrumunda çözülebilir sinyaller olması koşuluyla. Ancak, substrat konsantrasyonu Km değerine yakın ve makul bir zaman dilimi içinde bir NMR deneyi tespit edilecek kadar yüksek önemlidir. 2-3x ' den yüksek olmayan bir substrat konsantrasyonu, Km değeri rekabetçi, rekabetçi olmayan ve rekabetçi olmayan inhibitörler4' ü algılamak için idealdir. UNH için burada...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz AGNH ve UNH enzimleri sağlamak için AstraZeneca parça Kütüphanesi ve Dr David Parkin bileşikleri sağlayan Dr Dean Brown teşekkür ederiz. Bu yayında bildirilen araştırmalar, Ulusal Sağlık Enstitüsü alerji ve bulaşıcı hastalıklar tarafından R15AI128585 ödül numarası altında, B. J. S. tarafından destekleniyordu. İçerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüsü 'nün resmi görüşlerini temsil etmiyor. Research de bir Horace G. McDonell yaz araştırma bursu tarafından destekleniyordu S. N. M., bir Landesberg ailesi ile ödüllendirildi Kardeşlik, Adelphi Üniversitesi 'nden B. J. S. ' ye J. A. G. ve fakülte kalkınma hibe ve Frederick Bettelheim Araştırma Ödülü 'nü verdi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
AGNHSaflaştırılmış kurum içiN/ATVAG_213720
UNHSaflaştırılmış kurum içiN/ATVAG_092730
AdenozinSigmaA9251
5-FlorouridinSigmaF5130
Dimetil sülfoksit-D6Cambridge İzotop LaboratuvarlarıDLM-10-100D, %99,9
Potasyum fosfat monobazikSigmaP0662
Potasyum fosfat dibazikSigmaP3786
Potasyum klorürSigmaP9541
Döteryum oksitCambridge İzotop LaboratuvarlarıDLM-4-100D, %99,9
Hidroklorik asitFisher ChemicalA144212
Triton X-100SigmaX100
3- (Trimetilsilil) propiyonik-2,2,3,3,-d4 asit sodyum tuzu (TSP)Sigma269913D, %98
2,2,2-Trifloroetanol-1,1-d2Sigma612197D, %99,5
PipetGilsonF123602PIPETMAN Classic P1000
PipetGilsonF123601PIPETMAN Classic P200
PipetGilsonF123600PIPETMAN Classic P20
Mikrofüj tüpleriFisher Scientific05-408-129
Konik tüplerCorning352099
MikrosantrifüjEppendorf5418
Vorteks karıştırıcıFisher Scientific02215365
NMR tüpleriNorell502-7Veya NMR
NMR spektrometresiBrukerN/ AAvanceIII500
Prizma yazılımıGraphPadN/ASürüm 5.04
için uygun olduğu gibi

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jardetzky, O., Roberts, G. C. K. NMR in Molecular Biology. , Academic Press. New York. (1981).
  2. Evans, J. N. S. Biomolecular NMR spectroscopy. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1995).
  3. Dalvit, C., et al. A general NMR method for rapid, efficient, and reliable biochemical screening. Journal of the American Chemical Society. 125, 14620-14625 (2003).
  4. Dalvit, C. Ligand- and substrate-based 19F NMR screening: Principles and applications to drug discovery. Progress in NMR Spectroscopy. 51, 243-271 (2007).
  5. Stockman, B. J., et al. Identification of allosteric PIF-pocket ligands for PDK1 using NMR-based fragment screening and 1H-15N TROSY experiments. Chemical Biology & Drug Design. 73, 179-188 (2009).
  6. Hirt, R. P., Sherrard, J. Trichomonas vaginalis origins, molecular pathobiology and clinical considerations. Current Opinion in Infectious Diseases. 28, 72-79 (2015).
  7. Conrad, M. D., Bradic, M., Warring, S. D., Gorman, A. W., Carlton, J. M. Getting trichy: Tools and approaches to interrogating Trichomonas vaginalis in a post-genome world. Trends in Parasitology. 29 (2013), 17-25 (2013).
  8. Versées, W., Steyaert, J. Catalysis by nucleoside hydrolases. Current Opinion in Structural Biology. 13, 731-738 (2003).
  9. Shea, T. A., et al. Identification of proton-pump inhibitor drugs that inhibit Trichomonas vaginalis uridine nucleoside ribohydrolase. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 24, 1080-1084 (2014).
  10. Beck, S., Muellers, S. N., Benzie, A. L., Parkin, D. W., Stockman, B. J. Adenosine/guanosine preferring nucleoside ribohydrolase is a distinct, druggable antitrichomonal target. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25, 5036-5039 (2015).
  11. Muellers, S. N., et al. Ligand-efficient inhibitors of Trichomonas vaginalis adenosine/guanosine preferring nucleoside ribohydrolase. ACS Infectious Diseases. 5, 345-352 (2019).
  12. Veronesi, M., et al. Fluorine nuclear magnetic resonance-based assay in living mammalian cells. Analytical Biochemistry. 495, 52-59 (2016).
  13. Holzgrabe, U. Quantitative NMR spectroscopy in pharmaceutical applications. Progress in NMR Spectroscopy. 57, 229-240 (2010).
  14. Bharti, S. K., Roy, R. Quantitative 1H NMR spectroscopy. Trends in Analytical Chemistry. 35, 5-26 (2012).
  15. Dalvit, C., et al. Sensitivity improvement in 19F NMR-based screening experiments: Theoretical considerations and experimental applications. Journal of the American Chemical Society. 127, 13380-13385 (2005).
  16. Lambruschini, C., et al. Development of fragment-based n-FABS NMR screening applied to the membrane enzyme FAAH. ChemBioChem. 14, 1611-1619 (2013).
  17. Stockman, B. J. 2-Fluoro-ATP as a versatile tool for 19F NMR-based activity screening. Journal of the American Chemical Society. 130, 5870-5871 (2008).
  18. Aldrich, C., et al. The ecstasy and agony of assay interference compounds. ACS Central Science. 3, 143-147 (2017).
  19. Feng, B. Y., Shoichet, B. K. A detergent-based assay for the detection of promiscuous inhibitors. Nature Protocols. 1, 550-553 (2006).
  20. Copeland, R. A., Basavapathruni, A., Moyer, M., Scott, M. P. Impact of enzyme concentration and residence time on apparent activity recovery in jump dilution analysis. Analytical Biochemistry. , 206-210 (2011).
  21. Griveta, J. -P., Delort, A. -M. NMR for microbiology: In vivo and in situ applications. Progress in NMR Spectroscopy. 54, 1-53 (2009).
  22. Nijman, S. M. B. Functional genomics to uncover drug mechanism of action. Nature Chemical Biology. 11, 942-948 (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

NMR Aktivite AnalizleriEnzim nhibisyonuIC50 BelirlemeDeterjan Kar t TaramaS rama Seyreltme AnaliziProton NMRFlor NMRSubstrat D n m

İlgili makaleler