Proliferasyon hücresel fonksiyonun kritik bir parçasıdır ve yeni ilaçların potansiyel toksisitesini değerlendirmek için kullanılan yaygın bir okumadır. Bu nedenle, proliferasyonun ölçülmesi hücre biyolojisinde sıkça kullanılan bir ispondur. Burada, yapışık ve yapışık olmayan hücrelerde kullanılabilecek basit ve çok yönlü bir proliferasyon ölçme yöntemi salıyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Click Kimya kullanarak Vasküler Düz Kas Hücrelerinin Çoğalmasını Ölçme
Bu makalede
Özet
Özet
Bir hücrenin çoğalma yeteneği çoğu hücrenin normal fonksiyonunun ayrılmaz bir parçasıdır ve proliferasyon un disregülasyonu birçok hastalık süreçlerinin merkezinde yer alır. Bu nedenlerden dolayı, proliferasyonölçümü hücre fonksiyonunu değerlendirmek için kullanılan yaygın bir araçtır. Hücre çoğalması basitçe sayılarak ölçülebilir; ancak bu, çoğalma ölçmek için dolaylı bir araçtır. Bölmeye hazırlanan hücreleri doğrudan algılamanın ortak yollarından biri, etiketli nükleozit analoglarının birleştirilmesidir. Bunlar arasında radyoaktif nükleozit analog 3H-timinin artı 5-bromo-2' deoksiürin (BrdU) ve 5-etirnil-2′-deoksitürin (EdU) gibi radyoaktif olmayan nükleozit analogları bulunmaktadır. EdU'nun dahil edilmesi, BrdU ile karşılaştırıldığında çeşitli avantajları olan tıklama kimyası ile algılanır. Bu raporda, EdU'nun dahil edilmesiyle çoğalma ölçmek için bir protokol salıyoruz. Bu protokol, her birinin avantajları ve dezavantajları ile birlikte çeşitli okumalar için seçenekler içerir. Ayrıca, protokolün planlanan deneyin özel gereksinimlerini karşılamak üzere optimize edilebildiği veya değiştirilebileceği yerleri de tartışırız. Son olarak, bu temel protokolün diğer hücre metabolitlerini ölçmek için değiştirilme yollarına değiniyoruz.
Giriş
Proliferasyon hücresel fonksiyonun kritik bir parçasıdır1,2. Proliferasyonun kontrolü, kanser ve kardiyovasküler hastalık gibi gelişim ve patolojik süreçler gibi normal süreçleri etkiler. Vasküler düz kas hücrelerinin hiperplastik büyüme, örneğin, ateroskleroz bir habercisi olduğu düşünülmektedir3. Hücre çoğalmasındaki değişiklikler, yeni ilaçların potansiyel toksisitesini değerlendirmek için de kullanılmaktadır. Yaygın etkisi göz önüne alındığında, proliferasyon ölçümü birçok hücre biyolojisi tabanlı laboratuvarların dayanak noktasıdır.
Hücre çoğalması, hücr....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Floresan etiket kullanılarak EdU'nun algılanması
- Stok çözümleri
- 10 mL çift distile H2O'ya 12,5 mg EdU ekleyerek 5 mM EdU stok çözeltisi hazırlayın.
- Etiketleme çözeltisi bileşenlerini hazırlayın: 200 mM tris (3-hidroksipropiltririlolylmethyl)amin (THPTA) (100 mg in 1.15 mL H2O), 100 mM CuSO4 (1m CuSO 1 mL H2O; taze olun), 10 mM Cy3 pikolyl-azide (1 mg in 95.3 m HL2L2L - 20 °C'de 5°L aliquots ve 1 M sodyum askorbat (1 mL H2O 200 mg; taze olun) saklanır.
- Resazurin stok çözeltisini 0.15 mg/mL konsantrasyonda hazırlayın. Filtre sterilize ve 4 ° C'de 1 mL aliquots sa....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Şekil2'de, PDGF'ye yanıt olarak VSMC'nin çoğalmasını ölçen üç farklı deneyin sonuçlarını gösteriyoruz. Kobİ'ler için formüle edilmiş ortamdaki hücreleri büyüttükten sonra, serum veya büyüme faktörlerinin çoğalma üzerindeki olası etkilerini ortadan kaldırmak için serumsuz DMEM'de deney yaptık. Şekil 2A'da, aynı deneyden elde edilen sonuçları floresan vs Parlak okuma kullanarak karşılaştırıyoruz. Bu plakaları okumak için, emicilik, floresan ve Parlaklığı okuyabile.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
EdU'nun birleştirilmesi hücre çoğalmasını ölçmenin basit ve basit bir yoludur; özellikle yapışık hücreler için yararlıdır13. Protokolümüz düz kas hücreleri kullanır, ancak herhangi bir yapışık hücre için geçerlidir (epitel, endotel, vb). Protokol karmaşık olmasa da, tek kritik adım etiketleme çözümünü yapmaktır — maddeler listelenen sıraya eklenmelidir. Buna ek olarak, kemilüminesans Batı lekeleri gibi, lüminesans okuma kullanıyorsanız plaka hemen okunmalıdır.
Protokolü.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
Katie Carroll'a teknik yardım için teşekkür ederiz. Ayrıca Dr David Cool ve Proteomics Analiz Laboratuvarı öğretim ve Cytation görüntüleme plaka okuyucu sağlanması için teşekkür ederiz. Bu çalışma Wright Devlet Vakfı hibe (L.E.W.) tarafından desteklendi.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 5-Etinil-2'-deoksiüridin | Karbosynth | NE08701 | |
| biyotin pikolil azid | Kimya Araçları Tıklayın | 1167-5 | |
| CuSO4 | Fisher Scientific | C1297-100G | |
| Cy3 pikolil azid | Tıklama Kimyası Araçları | 1178-1 | |
| Sitasyon Plakası Okuyucu | Biotek | ||
| EVOS Mikroskop | Thermo Fisher Scientific | ||
| Hidrojen peroksit çözeltisi | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| Na askorbat | Sigma-Aldrich | 11140-250G | |
| NucBlue Sabit Hücre Lekesi Hazır Problar | Invitrogen | R37606 | DAPI nükleer leke |
| Odyssey Engelleme Tamponu | Li-Cor | 927-40000 | engelleme tamponu |
| Paraformaldehit | Elektron Mikroskobu Hizmetleri | 15710 | |
| PBS | Fisher Scientific | SH3002802 | |
| Sodyum Klorür | Sigma Yaşam Bilimleri | S3014-5kg | |
| Streptavidin Yaban turpu Peroksidaz Konjuge | Yaşam Teknolojileri | S911 | |
| Süper Sinyal ELISA Femto Termo | Bilimsel | PI137075 | ELISA substratı |
| Sinerji Plaka Okuyucu | Biotek | ||
| THPTA | Tıklama Kimyası Araçları | 1010-100 | |
| Tris Hidroksimetil Aminometan Hidroklorür (Tris-HCl) | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| Triton X 100 | Bio-Rad | 1610407 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 |
Kaynaklar
- Fuster, J. J., et al. Control of cell proliferation in atherosclerosis: Insights from animal models and human studies. Cardiovascular Research. 86 (2), 254-264 (2010).
- Zhu, J., Thompson, C. B. Metabolic regulation of cell ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
