Yöntem makalesi

Click Kimya kullanarak Vasküler Düz Kas Hücrelerinin Çoğalmasını Ölçme

DOI:

10.3791/59930

⸱

30 Ekim 2019

 ,  , 
1Department of Neuroscience, Cell Biology, and Physiology, Wright State University, 2Department of Surgery, Boonshoft School of Medicine, Wright State University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proliferasyon hücresel fonksiyonun kritik bir parçasıdır ve yeni ilaçların potansiyel toksisitesini değerlendirmek için kullanılan yaygın bir okumadır. Bu nedenle, proliferasyonun ölçülmesi hücre biyolojisinde sıkça kullanılan bir ispondur. Burada, yapışık ve yapışık olmayan hücrelerde kullanılabilecek basit ve çok yönlü bir proliferasyon ölçme yöntemi salıyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir hücrenin çoğalma yeteneği çoğu hücrenin normal fonksiyonunun ayrılmaz bir parçasıdır ve proliferasyon un disregülasyonu birçok hastalık süreçlerinin merkezinde yer alır. Bu nedenlerden dolayı, proliferasyonölçümü hücre fonksiyonunu değerlendirmek için kullanılan yaygın bir araçtır. Hücre çoğalması basitçe sayılarak ölçülebilir; ancak bu, çoğalma ölçmek için dolaylı bir araçtır. Bölmeye hazırlanan hücreleri doğrudan algılamanın ortak yollarından biri, etiketli nükleozit analoglarının birleştirilmesidir. Bunlar arasında radyoaktif nükleozit analog 3H-timinin artı 5-bromo-2' deoksiürin (BrdU) ve 5-etirnil-2′-deoksitürin (EdU) gibi radyoaktif olmayan nükleozit analogları bulunmaktadır. EdU'nun dahil edilmesi, BrdU ile karşılaştırıldığında çeşitli avantajları olan tıklama kimyası ile algılanır. Bu raporda, EdU'nun dahil edilmesiyle çoğalma ölçmek için bir protokol salıyoruz. Bu protokol, her birinin avantajları ve dezavantajları ile birlikte çeşitli okumalar için seçenekler içerir. Ayrıca, protokolün planlanan deneyin özel gereksinimlerini karşılamak üzere optimize edilebildiği veya değiştirilebileceği yerleri de tartışırız. Son olarak, bu temel protokolün diğer hücre metabolitlerini ölçmek için değiştirilme yollarına değiniyoruz.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proliferasyon hücresel fonksiyonun kritik bir parçasıdır1,2. Proliferasyonun kontrolü, kanser ve kardiyovasküler hastalık gibi gelişim ve patolojik süreçler gibi normal süreçleri etkiler. Vasküler düz kas hücrelerinin hiperplastik büyüme, örneğin, ateroskleroz bir habercisi olduğu düşünülmektedir3. Hücre çoğalmasındaki değişiklikler, yeni ilaçların potansiyel toksisitesini değerlendirmek için de kullanılmaktadır. Yaygın etkisi göz önüne alındığında, proliferasyon ölçümü birçok hücre biyolojisi tabanlı laboratuvarların dayanak noktasıdır.

Hücre çoğalması, hücre popülasyonu oldukça hızlı bölünürse, sadece hücreleri sayarak ölçülebilir. Yavaş büyüyen hücreler için hücre sayıları daha az hassas olabilir. Proliferasyon genellikle etiketli nükleozit analoglarının birleştirilmesi ile ölçülür. Altın standart 3H-timidin dahil olmasına rağmen, birçok laboratuvarlar yeni, radyoaktif olmayan alternatifler durumu göz önüne alındığında bu yöntemden uzak laşıyorlar. Bunlar arasında sitoplazmik floresan boyalar, hücre döngüsü ile ilişkili proteinlerin saptanması ve 5-bromo-2' deoksiürin (BrdU) ve 5-ethynyl-2′-deoksitürin(EdU) 4 gibi radyoaktif olmayan nükleozit analoglarının birleşmesi sayılabilir.

Karboksifluorescein diasetat succinimidyl ester (CFSE) gibi sitoplazmik boyalar, hücre5'iher bölünde de boyanın yoğunluğu yarıya indiği için çoğalma tespit eder. Bu teknik genellikle non-yapışık hücreler için akış sitometri kullanılır. Bu yapışık hücreler için çok kullanılmamıştır, ancak görüntüleme plaka okuyucuların yeni nesil ile bu değişebilir. Antikor temelli tekniklerle (akış sitometrisi, immünohistokimya, vb.) hücre döngüsü ile ilişkili proteinlerin saptanması genellikle dokular veya non-yapışık hücreler için kullanılır. Bu hücreler/dokular boyama dan önce sabit ve permeabilize edilmelidir. Nükleozit analogları BrdU ve EdU 3H-timidin yaklaşım benzer, ancak radyoaktivite rahatsızlık olmadan. BrdU'nun dahil edilmesi anti-BrdU antikorları tarafından saptanmıştır ve bu nedenle hücreler boyamadan önce sabit ve permeabilize edilmelidir. Buna ek olarak, brdU epitop maruz kalmak için hücreler DNase ile tedavi edilmelidir.

EdU'nun birleştirilmesi, alkin ve azid gruplarının katalitik bakır varlığında bir araya gelip "tıkladığı" tıklama kimyası ile saptanır. Her iki grup biyosentetik olarak dahil molekül veya algılamamolekülü 4olarak hizmet verebilir. Ticari olarak mevcut nükleozit analogları alkyne grubu bağlı. Bu nedenle, alkine fonksiyonel nükleozit analogunun floresan boya veya diğer belirteçlere konjuge bir azid ile saptanır. EdU'nun bã1/4tçeye karŠı çok sayıda avantajı bulunuyor. Birincisi, alkine ve azit grupları memeli hücrelerinde bulunmadığından, bu etkileşim düşük arka plan6ile son derece spesifiktir. Her iki grup da küçük olduğundan, brdU7için gerekli olan nükleozit analogunu ortaya çıkarmak için hücrelerin DNA denatürasyonuna geçmesi gerekmez. Son olarak, tıklama kimyası çok yönlü, ve DNA, RNA, protein, yağ asitleri vekarbonhidratlar8,9,10,11metabolik etiketleme için kullanılabilir. Metabolik olarak etiketlenmiş ilgi hedefi hücre yüzeyinde ise, canlı hücreler12olarak etiketlenebilir. Buna ek olarak, hücreler daha fazla antikorlar ile immünofloresan boyama için işlenebilir.

Aşağıdaki protokol, insan vasküler düz kas hücrelerinde çoğalmayı ölçmek için EdU kuruluş ve tıklama kimyası kullanımını açıklar(Şekil 1). EdU'nun üç farklı şekilde ölçülebileceğini, her birinden temsili sonuçlar ve bunların avantaj ve dezavantajlarının ölçülebileceğini gösteriyoruz. Tıklama kimyası ile çoğalma ölçme özellikle yapışık, yavaş büyüyen hücreler için yararlıdır. Buna ek olarak, hücrenin morfolojisi iyi korunur ve antikor bazlı boyama da yapılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Floresan etiket kullanılarak EdU'nun algılanması

  1. Stok çözümleri
    1. 10 mL çift distile H2O'ya 12,5 mg EdU ekleyerek 5 mM EdU stok çözeltisi hazırlayın.
    2. Etiketleme çözeltisi bileşenlerini hazırlayın: 200 mM tris (3-hidroksipropiltririlolylmethyl)amin (THPTA) (100 mg in 1.15 mL H2O), 100 mM CuSO4 (1m CuSO 1 mL H2O; taze olun), 10 mM Cy3 pikolyl-azide (1 mg in 95.3 m HL2L2L - 20 °C'de 5°L aliquots ve 1 M sodyum askorbat (1 mL H2O 200 mg; taze olun) saklanır.
    3. Resazurin stok çözeltisini 0.15 mg/mL konsantrasyonda hazırlayın. Filtre sterilize ve 4 ° C'de 1 mL aliquots saklayın.
      NOT: Picolyl azide birkaç farklı flor, biotin ve horseradish peroksidaz (HRP) konjuge mevcuttur.
  2. Etiket vasküler düz kas hücreleri (VSMC) EdU ile.
    NOT: İnsan VSMC'leri iliyak arterlerden dışa dönük doku parçalarından büyüme yoluyla izole edildi. İnsülin, transferrin, selenyum ile serumsuz ortamda büyüdüklerinde bu hücreler VSMC belirteçlerini smoothelin, düz kas miyozin ağır zinciri (SM-MHC) ve SMC αactin13'üifade eder.
    1. Plaka vasküler düz kas hücreleri 2 x 104/ mL Dulbecco modifiye Eagle's orta (DMEM) bir 96 iyi plaka.
      NOT: Hücreler %2 fetal sığır serumu ile düz kas hücreli ortamda 37 °C'de yetiştirilir.
    2. (İsteğe bağlı) Bağlılık için bir gecede birkaç saat bekleyin. Her kuyuya 20 μL resazurin stoğu ekleyin. 37 °C'de 3 7 °C'de kuluçkaya yatırın. Ortamı taze DMEM ile değiştirin.
      NOT: Bu adım isteğe bağlıdır. Resazurin hücre numaralarını normalleştirmek ve kaplama iyi-to-well değişkenlik hesap için kullanılır14.
    3. Kültür döneminin başlangıcında tedavi başına 3−6 kuyuya fosfat tamponlu salin (PBS) veya trombosit kaynaklı büyüme faktörü (PDGF) ekleyin ve 72 saat kuluçka yada kuluçka.
    4. 5 mM EdU stoku 1 mM'ye seyreltin. 72 saat kültür periyodunun son 24 h'si için her kuyuya 2°L (son konsantrasyon 20°L) ekleyin. EdU'yi bir çoğaltma kümesine eklemeyin. Bu kuyular arka plan floresan / lüminesans belirlemek için kullanılacaktır.
      NOT: EdU ile kültür ve etiketleme süresi düz kas hücreleri için optimize edilmiştir, ancak hücre tipine göre değiştirilmesi gerekebilir.
  3. Paraformaldehit (PFA) hücreleri düzeltmek.
    1. Ortamı çıkarın ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca her kuyuda %4 PFA (PBS'de) 150 μL ekleyin.
    2. PFA'yı çıkarın ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca kuyu başına %1 polietilen glikol tert-oktilfenil eter (TX-100) (suda) ekleyin.
    3. TX-100'ü PBS ile üç kez yıkayarak çıkarın.
      DİkKAT: PFA toksiktir, dikkatli bir şekilde ele alın.
      NOT: Protokol burada duraklatılabilir. Sabit hücreler 4 °C'de PBS'de saklanabilir.
  4. Dahil edu algıla.
    1. Aşağıdaki sırayla stok çözeltilerinden reaktifler ekleyerek kullanılmadan hemen önce etiketleme çözeltisi (96 kuyu başına 10 mL) yapın: THPTA 20 μL, CuSO4 20 μL, Cy3 picolyl azide 5 μL, Na askorbate 100 μL pbs toplam hacmi için 10 mL.
    2. PBS'yi kuyulardan çıkarın ve her kuyuya 150 μL etiketleme çözümü ekleyin. 37 °C'de kuluçka 30 dk. Tüm çekirdekleri algılamak için, her iyi 4',6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) ekleyin. Bir floresan plaka okuyucu (Cy3 550ex, 570emokuyun ; DAPI 350ex, 470em) veya bir mikroskop üzerinde görüntü.
      NOT: Protokol burada duraklatılabilir. Sabit ve lekeli hücreler PBS'de 4 °C'de saklanabilir ve daha sonra görüntülenebilir.

2. Lüminesans kullanarak EdU'nun saptanması

  1. Bölüm 1.1-1.3'ün tamamını tamamlayın.
  2. %0,1 polisorbat 20 (TBST) ile Tris-tamponlu tuzlu hazırlayın.
  3. Kuyuları engelleyin.
    1. Her kuyuya 150 μL bloke tamponu(Malzeme Tablosu)ekleyin ve oda sıcaklığında 90 dakika kuluçkaya yatırın.
    2. Engelleme tamponu çıkarın ve 200 μL PBS ile üç kez yıkayın.
  4. Dahil edu algıla.
    1. Adım 1.4.1 yönettiği gibi etiketleme çözümü olun, Cy3 pikolyl azide için biotin picolyl azide yerine.
    2. 200 μL TBST ile kuyuları beş kez yıkayın, sallayarak, yıkama başına 3 dk.
    3. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca %0,3 H2O2 ile 150 μL'lik endojen peroksidazları söndürün.
    4. H2O2'yi çıkarın ve 200 μL TBST ile beş kez yıkayın ve yıkama başına 3 dk sallayın.
    5. Seyreltik streptavidin-horseradish peroksidaz (SA-HRP; 1:200) TBST ve her kuyuya 50 μL ekleyin. Oda sıcaklığında 1 saat kuluçka.
    6. 200 μL TBST ile beş kez yıkayın, sallayarak, yıkama başına 3 dk.
    7. Her kuyuya 50 μL kemilüminesan enzimbağlantılı immünosorbent tsay (ELISA) substratı(Malzeme Tablosu)ekleyin.
    8. Lüminesans algılama yeteneğine sahip plaka okuyucu hemen okuyun.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şekil2'de, PDGF'ye yanıt olarak VSMC'nin çoğalmasını ölçen üç farklı deneyin sonuçlarını gösteriyoruz. Kobİ'ler için formüle edilmiş ortamdaki hücreleri büyüttükten sonra, serum veya büyüme faktörlerinin çoğalma üzerindeki olası etkilerini ortadan kaldırmak için serumsuz DMEM'de deney yaptık. Şekil 2A'da, aynı deneyden elde edilen sonuçları floresan vs Parlak okuma kullanarak karşılaştırıyoruz. Bu plakaları okumak için, emicilik, floresan ve Parlaklığı okuyabile...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EdU'nun birleştirilmesi hücre çoğalmasını ölçmenin basit ve basit bir yoludur; özellikle yapışık hücreler için yararlıdır13. Protokolümüz düz kas hücreleri kullanır, ancak herhangi bir yapışık hücre için geçerlidir (epitel, endotel, vb). Protokol karmaşık olmasa da, tek kritik adım etiketleme çözümünü yapmaktır — maddeler listelenen sıraya eklenmelidir. Buna ek olarak, kemilüminesans Batı lekeleri gibi, lüminesans okuma kullanıyorsanız plaka hemen okunmalıdır.

Protokolü...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Katie Carroll'a teknik yardım için teşekkür ederiz. Ayrıca Dr David Cool ve Proteomics Analiz Laboratuvarı öğretim ve Cytation görüntüleme plaka okuyucu sağlanması için teşekkür ederiz. Bu çalışma Wright Devlet Vakfı hibe (L.E.W.) tarafından desteklendi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
5-Etinil-2'-deoksiüridinKarbosynthNE08701
biyotin pikolil azidKimya Araçları Tıklayın1167-5
CuSO4Fisher ScientificC1297-100G
Cy3 pikolil azidTıklama Kimyası Araçları1178-1
Sitasyon Plakası OkuyucuBiotek
EVOS MikroskopThermo Fisher Scientific
Hidrojen peroksit çözeltisiSigma-Aldrich216763
Na askorbatSigma-Aldrich11140-250G
NucBlue Sabit Hücre Lekesi Hazır ProblarInvitrogenR37606DAPI nükleer leke
Odyssey Engelleme TamponuLi-Cor927-40000engelleme tamponu
ParaformaldehitElektron Mikroskobu Hizmetleri15710
PBSFisher ScientificSH3002802
Sodyum KlorürSigma Yaşam BilimleriS3014-5kg
Streptavidin Yaban turpu Peroksidaz KonjugeYaşam TeknolojileriS911
Süper Sinyal ELISA Femto TermoBilimselPI137075ELISA substratı
Sinerji Plaka OkuyucuBiotek
THPTATıklama Kimyası Araçları1010-100
Tris Hidroksimetil Aminometan Hidroklorür (Tris-HCl)Fisher ScientificBP153-500
Triton X 100Bio-Rad1610407
Tween 20Fisher ScientificBP337-100

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fuster, J. J., et al. Control of cell proliferation in atherosclerosis: Insights from animal models and human studies. Cardiovascular Research. 86 (2), 254-264 (2010).
  2. Zhu, J., Thompson, C. B. Metabolic regulation of cell growth and proliferation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2019).
  3. Cizek, S. M., et al. Risk factors for atherosclerosis and the development of preatherosclerotic intimal hyperplasia. Cardiovascular pathology the Official Journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 16 (6), 344-350 (2007).
  4. Romar, G. A., Kupper, T. S., Divito, S. J. Research techniques made simple: Techniques to assess cell proliferation. Journal of Investigative Dermatology. 136, e1-e7 (2016).
  5. Quah, B. J. C., Parish, C. R. The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation. Journal of Visualized Experiments. 44, 4-7 (2010).
  6. Sletten, E., Bertozzi, C. R. Bioorthogonal Chemistry: Fishing for Selectivity in a Sea of Functionality. Angewandte Chemie International Edition. 48 (38), 6974-6998 (2009).
  7. Cecchini, M. J., Amiri, M., Dick, F. A. Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells. Journal of Visualized Experiments. (59), 1-7 (2012).
  8. Clarke, S. T., Calderon, V., Bradford, J. A. Click Chemistry for Analysis of Cell Proliferation in Flow Cytometry. Current Protocols in Cytometry. 82 (1), (2017).
  9. Jiang, H., et al. Monitoring dynamic glycosylation in vivo using supersensitive click chemistry. Bioconjugate Chemistry. 25 (4), 698-706 (2014).
  10. Izquierdo, E., Delgado, A. Click chemistry in sphingolipid research. Chemistry and Physics of Lipids. 215, 71-83 (2018).
  11. Jao, C. Y., Salic, A. Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15779-15784 (2008).
  12. Hong, V., Steinmetz, N. F., Manchester, M., Finn, M. G. Labeling Live Cells by Copper-Catalyzed Alkyne-Azide Click Chemistry. Bioconjugate Chemistry. 21 (10), 1912-1916 (2011).
  13. Arumugam, P., Carroll, K. L., Berceli, S. A., Barnhill, S., Wrenshall, L. E. Expression of a Functional IL-2 Receptor in Vascular Smooth Muscle Cells. The Journal of Immunology. 202 (3), 694-703 (2019).
  14. Stoddart, M. J. Mammalian cell viability: methods and protocols. , Humana Press. New York, NY. (2011).
  15. Uttamapinant, C., Tangpeerachaikul, A., Grecian, S., Clarke, S., Singh, U. Fast, Cell-compatible Click Chemistry with Copper-chelating Azides for Biomolecular Labeling. Angewandte Chemie International Edition. 154 (11), 2262-2265 (2012).
  16. Bescancy-Webler, C., et al. Raising the Efficacy of Bioorthogonal Click Reactions for Bioconjugation: A Comparative Study. Angewandte. Chemie International Edition. 50 (35), 8051-8056 (2011).
  17. Diermeier-Daucher, S., et al. Cell type specific applicability of 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EDU) for dynamic proliferation assessment in flow cytometry. Cytometry Part A. 75 (6), 535-546 (2009).
  18. Cieślar-Pobuda, A., Los, M. J. Prospects and limitations of “Click-Chemistry”-based DNA labeling technique employing 5-ethynyl-2′deoxyuridine (EdU). Cytometry Part A. 83 (11), 977-978 (2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

EdU Proliferasyon AnaliziClick Kimyas DeteksiyonuFloresan OkumaL minesans OkumaTrombosit Kaynakl B y me Fakt rParaformaldehit FiksasyonuTX 100 PermeabilizasyonuG r nt leme Plaka OkuyucusuManuel H cre Say m

İlgili makaleler