Affinity Kromatografi Reçiyatlarının Hızlı Gelişimi İçin Aktif Çapraz Bağlantılı Agarose - Örnek Olay Olarak Antikor Yakalama

Summary

Bu prosedürde, Bir DsRed tabanlı epitop ligand protein A alternatif olarak, ham bitki özleri veya hücre kültürü supernatants monoklonal antikorların yakalanması için son derece seçici afinite reçine üretmek için immobilize edilir.

Abstract

Monoklonal antikorların (mAbs) saflaştırılması genellikle protein A affinity kromatografisi ile elde edilir, bu da genel proses maliyetlerinin %25'ini karşılayabilir. Alternatif, uygun maliyetli yakalama adımları bu nedenle, tek bir mAb büyük miktarlarda üretilen endüstriyel ölçekli üretim için değerlidir. Burada, Protein A kullanmadan, HIV nötralize edici antikor 2F5'in ham bitki özlerinden seçici olarak yakalanmasına olanak tanıyan çapraz bağlantılı agarose reçine DsRed tabanlı epitop ligand'ın immobilizasyonu için bir yöntem salıyoruz. Lineer epitop ELDKWA ilk olarak genetik olarak floresan protein DsRed ile kaynaşmış ve füzyon proteini transgenik tütün(Nicotiana tabacum)bitkilerinde immobilize metal-iyon afinite kromatografisi ile saflaştırmadan önce ifade edilmiştir. Ayrıca, aktif çapraz bağlı agarose dayalı bir yöntem yüksek ligand yoğunluğu, verimli bağlantı ve düşük maliyetler için optimize edilmiştir. PH ve tampon bileşimi ve çözünür ligand konsantrasyonu, deneylerin tasarımı yaklaşımı kullanılarak geliştirilmiş olan bağlantı işlemi sırasında ki en önemli parametrelerdi. Ortaya çıkan afinite reşin seçici bir ham bitki ekstresi hedef mAb bağlamak için yeteneği için test edildi ve elüsyon tampon yüksek mAb kurtarma, ürün aktivitesi ve yakınlık reşin istikrar için optimize edilmiştir. Bu yöntem doğrusal epitopslarla diğer antikorlara kolayca adapte edilebilir. Yeni reçinler Protein A'dan daha nazik elüsyon koşullarına izin verir ve aynı zamanda mAb üretimi için ilk yakalama adımının maliyetini azaltabilir.

Introduction

Biyofarmasötik ürünler tıbbın hemen hemen her dalında hastalıklarıngeniş bir yelpazede tedavisi için önemlidir 1. Monoklonal antikorlar (mAbs) biyofarmasötik pazarına hakim, dünya çapında satış 2020²yılında yaklaşık 110 milyar € ulaşması bekleniyor. mAbs için tercih edilen ifade platformu Çin hamster over hücre hatları, genellikle kültür supernatant^3,410 g'L^-1 kadar yüksek mAb titreleri üretmek vardır. Ancak, memeli hücre kültürlerinde mAbs üretimi orta yüksek maliyet ve steril fermantasyonihtiyacı nedeniyle pahalı 5. Bitkiler gibi alternatif ifade platformları potansiyel endüstriyel üretim için daha hızlı, basit, daha az pahalı ve daha ölçeklenebilir bir yaklaşım sunuyoruz^6,7.

Memeli hücre kültürleri ile ilgili maliyetlere ek olarak, protein a a affinity kromatografisinin ürün yakalamada yaygın kullanımı, mAbs'lerin endüstriyel üretimi için önemli bir maliyet itici gücüdür. Protein A doğal Staphylococcus aureus hücrelerinin yüzeyinde bulunan ve bazı murine ve insan antikorlarının parça kristalize (Fc) bölgeye bağlanır, bu nedenle mizahi bağışıklık sistemi kaçınmak için bir savunma mekanizması olarak hareket⁸. Protein A hücre kültürü supernatants mAbs yakalamak için sanayi altın standart haline gelmiştir ve aynı zamanda yaygın olarak araştırma topluluğu tarafından son derece seçici olduğu için kullanılır, genellikle tek bir adımda ~ 95% mAb saflıkları elde⁸. Beklendiği gibi, son yirmi yılda Protein A satışları yakından mAbs satış yansıtmıştır⁸. Üretim ölçeğine bağlı olarak, Protein A'nın maliyeti toplam proses maliyetlerinin %'inden fazlasına karşılık gelebilir ve bu nedenle 2.000 € g^-15,9€'yakadar olabilir terapötik mAbs, piyasa fiyatını etkileyebilir. Bu nedenle, benzer bir arıtma performansına sahip alternatif kromatografi reçinejleri üretim maliyetlerini önemli ölçüde düşürme potansiyeline sahiptir, bu da antikor bazlı tedavileri daha fazla sayıda hasta için erişilebilir hale getirir^{10,11 ,12}. Bu tür alternatifler, düşük pH'daki sert elüsyon koşulları da dahil olmak üzere Protein A kromatografisinin dezavantajlarını da aşabilir (tipik olarak <3.5) mAbs'nin agregasyonu teşvik eden konformasyonel değişikliklere uğramasına neden olabilir¹³ . Daha da önemlisi, Protein A sadece belirli IgG alt sınıflarının Fc bölgesi için seçicidir, bu nedenle kesilen bağlayıcı etki alanları olan işlevsel olmayan moleküller bozulmamış ürün⁵ile birlikte arındırılabilir, oysa mAb tek zincirli değişken parçaları gibi türeyen Protein A'ya hiç bağlanmaz.

Burada, doğrusal epitop ELDKWA (bir harf amino asit kodu)^5,14kullanarak HIV nötralize mAb 2F5 yakalamak için alternatif bir yakınlık kromatografi reçine açıklar. 2F5 epitopunu, taşıyıcı ve muhabir molekül olarak işlev gören floresan protein DsRed'in C-terminusuna genetik olarak erittin ve transgenik tütünde Ortaya çıkan DsRed-2F5-Epitop (DFE) proteinini ürettik ( Nicotiana tabacum) bitkiler. DFE tek adımlı immobilize metal-iyon afinite kromatografisi (IMAC) ile saflaştırılmıştı. Saflaştırılmış DFE afinite ligand bir çapraz bağlı agarose resin üzerine immobilizasyon n-hidroksisuccinimid kullanılarak kimyasal kaplin elde edildi (NHS)-aktive çapraz bağlı agarose sütunlar. İstatistiksel deneysel tasarımlar daha sonra immobilizasyon prosedürü ve kaplin verimliliği optimize etmek için kullanılmıştır¹⁵. mAb 2F5 için arınma stratejisi antikor saflığı, verim ve ligand stabilitesi açısından değerlendirilmiştir. Fc bölgesini bağlayan Protein A'nın aksine, DFE 2F5'in tamamlayıcılık belirleyici bölgesine bağlı karak, moleküllerin sağlam bir paratopla arınmasını sağlar. Konseptimiz herhangi bir mAb'ye doğrusal epitop ile veya mikrodizi çalışmaları ile kolayca tespit edilebilen diğer peptid bazlı afinite ligandlara kolayca adapte edilebilir^16.

Şekil 1: Ham bitki özlerinden veya hücre kültürü süpernatantlarından mAbs yakalama için kullanılabilecek epitop afinite reçinelerinin hazırlanması için proses akış şeması. (A) Transgenik tütün bitkilerinde ligand DFE yakınlığı ifade edilebistir. Hasat edilenyapraklar homojenize edilmeden önce bir ısı yağış adımı (B) dahil edilmiştir (C). (D) Ham bitki özü torba filtrasyon, derinlik filtrasyon ve 0,2 μm steril filtrasyon ile açıklığa kavuşturulmuştur. (E) DFE daha sonra IMAC tarafından arındırıldı. (F, G) Saflaştırılmış DFE yakınlık ligand EDC / NHS-aktif çapraz bağlı agarose sütunlar üzerinde immobilize edildi. (H) T-DNA kodlayıcı antikor 2F5 taşıyan bakteri kültürleri, fitotronda yetişen N. benthamiana bitkilerindegeçiciifade için kullanılmıştır. (J) N. benthamiana yaprakları hasat edildi ve D. (K) mAb 2F5'te açıklandığı gibi işlendi, DFE yakınlık sütunları (L) kullanılarak açıklık ekstresinden arındırıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Protocol

1. Transgenik Tütün Bitkileri yetiştirmek

NOT: DFE füzyon proteintasarımı ve transgenik bitkilerin üretimi başka bir yerde açıklanmıştır^5,17.

1. Topraktaki transgenik tütün fidelerini çimleştirin. Bitkileri 1,0 g· ile sulamak L^-1 gübre çözeltisi. Bitkilerin ~0,04 m çapa ulaştıklarında tek, 100 mm x 100 mm x 60 mm (uzunluk, genişlik, yükseklik) kaplara aktarın.
2. 16-h fotoperi (25/22 °C ışık/karanlık sıcaklık rejimi) ile bir serada transgenik tütün bitkileri yetiştirmek, 70% bağıl nem ve otomatik gübreleme ile 1.0 g· L^-1 gübre çözeltisi her saat 15 dk.
3. 7 hafta sonra, bitki kök tabanında dört cotyledon yaprakları dışında tüm yaprakları hasat. Hasat edilen yaprakları aşağıda açıklandığı gibi hemen işleme.

2. Konak Hücre Proteinlerinin Isı Yağışı

1. Paslanmaz çelik ısıtmalı kapta (0,3 m x 0,3 m x 0,3 m) 20 L çalışma hacmine sahip bir su banyosu ayarlayın. Başlangıçta, 5 L dk^-1akışı ile sıvı kalıcı olarak ajite su banyosu bir manyetik pompa yerleştirin. Sıcaklık kontrolü için su banyosuna ayarlanabilir bir termostat monte edin (adım 2.4 ve 2.8).
   DİkKAT: 2.10'a kadar olan tüm aşağıdaki adımlar sıcak sıvının işlenmesini içerir. Termal yalıtımlı eldiven ler ve gözlükler de dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipman giyin.
2. Su banyosuna 15 L deiyonize su ekleyin ve sıvıyı 70 °C'ye ısıtın.
3. Manyetik bir karıştırıcı üzerine 5 L deiyonize su dolu 10 L kova yerleştirin. 120 mM'lik son konsantrasyona sodyum fosfat ekleyin. 10 M hidroklorik asit kullanarak pH'ı 8,14'e ayarlayın. Tüm bileşenler çözündüğünde, elde edilen konsantre beyazlatma tamponunu (5 L) 2.2 adımdan su banyosuna ekleyin.
4. Sıcaklık 70 °C'ye ulaşana kadar su banyosunu çalkalayın. Gerekirse pH'ı 8,14'e ayarlamak için 10 M hidroklorik asit kullanın. Gerekli sıcaklık ve pH'a ulaşıldıktan sonra en az 15 dakika boyunca ajitasyona devam edin ve tüm montajın termal dengede olduğundan emin olun.
5. ~17 °C sıcaklıkta deiyonize su ile doldurulmuş 20 L kova (0,3 m x 0,3 m x 0,3 m) hazırlayın (adım 2.9 için gereklidir).
6. Adım 1.3 hasat tütün yaprakları 400 g aliquots hazırlayın. Delikli sepete bir aliquot yerleştirin (0,2 m x 0,2 m x 0,2 m; gözenek genişliği en az 0,02 m x 0,02 m). Sepetin bitki malzemesi yle aşırı doldurulmasını veya dokuya zarar vermemek için yaprakları çok sıkı bir şekilde paketlemekten kaçının.
7. 2.4 adımdan itibaren sepeti sıcak beyazlatma tamponuna batırın ve tüm yaprakların sıvı yüzeyin altında kaldığından emin olun. Gerekirse yüzey altında yaprakları tutmak için bir termokararlı silikon kaşık kullanın.
8. Pompa hala sıvı ajitasyon ise tütün beyazlatma sıvısı 1,5 dakika için bırakır kuluçka. Tüm kuluçka dönemi boyunca sıvı sıcaklığını izleyin. Tütün yaprakları ile pompa girişi engelleme kaçının.
9. 30 s. Soğuk su ile dolu kova sepeti aktarın (adım 2.5) ve 30 s. için yaprakları batırmak için 30 s. Le gelen artık su boşaltmak için yaprakları beyazlatma tampon ve drenaj artık tampon dan tütün yaprakları sepeti çıkarın homojenizasyondan önce 30 s aves (adım 3).
10. 2,6'dan 2,9'a kadar taze aliquots ile tüm hasat biyokütle işlenir kadar adımları tekrarlayın. Su banyosundaki blanching tamponunun pH'sını ve sıcaklığını sürekli olarak izleyin ve ayarlayın.
    NOT: Blanched bitki malzemesi tüm biyokütle işlemek için birkaç beyazlatma döngüleri gerektiğinde 30 dakika kadar buz üzerinde saklanabilir. Blanched yaprakları da vakum mühürlü torbalarda saklanabilir -80 °C en az 3 hafta. Ancak, uzun süreli depolama DFE verimini azaltabileceğinden hemen işlenmesi önerilir.

3. Protein Ekstraksiyonu ve Açıklama

DİkKAT: Aşağıdaki adımlar, dönen bıçakları ile bir blender içerir. Motor ünitesine güç verdiğinde veya monte edildiğinde blender kabında çalışmayın.

1. Blender kabına 150 g (ıslak kütle) beyazlatılmış tütün yaprağı (adım 2.9) yerleştirin ve 450 mL ekstraksiyon tamponu ekleyin (50 mM sodyum fosfat, 500 mM sodyum klorür, 10 mM sodyum disülfür, pH 7.5). Bitki materyalinin veya tamponun dökülmesini önlemek için blender kapağını sıkıca kapatın.
2. 30 s için 3x için yaprakları homojeize, her darbe arasında 30 s tatili ile. Tüm yaprakların homojen olduğundan ve hiçbirinin blender kabının üstüne yapışmadığından emin olun. Gerekirse, tatili sırasında blender açın ve temiz bir silikon kaşık kullanarak, kabın üst kısmında sopa yaprakları aşağı itin.
3. Homojenizasyondan sonra, sonraki analiziçin homojenin 1.0 mL numunesini alın (adım 7).
4. Homojeni yeterli büyüklükte bir kapta toplayın (örn. toplam biyokütle 1,0 kg ile çalışıyorsanız, en az 5 L kapasiteli bir kap kullanın). 3.1 ile 3.3 adımlarını tüm beyazlatılmış biyokütle homojenleşene kadar tekrarlayın.
5. Bir filtre yuvasına bir torba filtresi yerleştirin ve montajın altına yeterli büyüklükte başka bir kap yerleştirin (bkz. 3.4). Homojeni torba filtresine ~0,15 L dk^-1oranında uygulayın. Sonraki analiz (adım 7) için her litreden sonra çanta filtrasyon örneklerini alın ve bir türbidimetre veya benzeri bir cihaz kullanarak ekstraksiyon tampon 1:10 seyreltme olarak çanta filtrate havuzunun bulanıklık ölçmek.
6. Ayrıca 0.02 m² k700 (üst) ve KS50 (alt) derinlik filtre katmanı kombinasyonu çanta filtrate havuzu litre başına kullanarak çanta filtrat havuzu açıklığa kavuşturmak. Maksimum 0,2 MPa basınca kadar 3,0 L min^-1·m^-2 akış hızı uygulayın. Daha sonra daha önce açıklandığı gibi 0,2 μm steril filtre ile açıklık filtrat geçirerek artık parçacıkları kaldırmak⁵.

4. DFE Affinity Ligand saflaştırma

1. Elütion tamponu (10 mM sodyum fosfat, 300 mM imidazol, pH 7.4), yıkama tamponu (10 mM sodyum fosfat, pH 7.4) ve equilibration tampon (20 mM sodyum fosfat, 500 mM sodyum klorür, pH 7.4) ile kızartarak hızlı protein sıvı kromatografi sistemi hazırlayın. Yaprak biyokütlesinin kilogramı başına ~50 mL şelat çapraz bağlı agarose reçine içeren bir sütun monte edin (~2.5 L derinlik filtrat).
2. 200 mM nikel sülfat çözeltisi 5 kolon hacmi (CV) uygulayarak koloni nikel iyonları ile şarj edin ve 5 CV elüsyon tamponu ile yıkayın. 50 cm h^-1 akış hızı kullanın ve sonraki tüm kromatografi adımları için UV sinyallerini 260, 280 ve 558 nm'de izleyin.
3. Sütunu 10 CV'lik denge arabelleği ile dengeleyin. Daha sonra, açıklığa kavuşturulmuş bitki ekstresinin 50 CV'sini (3.6 adımdan) şartlı sütuna yükleyin.
4. Sütunu 10 CV yıkama tamponu ile yıkayın. 5 CV elüsyon tamponu ile DFE füzyon proteinini yakınve 280 nm ve 558 nm'deki UV sinyalleri taban çizgisinin üzerinde 5 mAU'dan fazla arttıktan sonra ürün içeren fraksiyonu toplayın.
5. Toplam çözünür protein (TSP) konsantrasyonu (adım 7.1), DFE konsantrasyonu (adım 7.2 ve 7.3) ve DFE saflığını (adım 7.4) ölçmek için elüsyon fraksiyonundan 0,2 mL numune alın.
6. Kromatografi sistemine ~50 mL çapraz bağlı dekstran reçine içeren bir kolon monte edin. Kolonu 5 CV bağlantı tamponu (200 mM HEPES, 500 mM sodyum klorür, pH 8,5) ile dengeleyin. Tampon değişimi için DFE elüsyon fraksiyonunun 10 mL'sini (adım 4.4) enjekte edin ve UV emiciliğini 280 ve 558 nm'de izleyin.
7. 280 nm ve 558 nm'deki UV sinyalleri taban çizgisinin üzerinde 5 mAU'dan fazla bir artış yaptıktan sonra DFE içeren fraksiyonu toplayın. 0,2 mL numune alın ve TSP konsantrasyonu, DFE konsantrasyonu ve DFE saflığını belirleyin (adım 7).
8. Saflaştırılmış DFE örneğini (adım 4.7'den 15 g L -1'e, 3.000 x g'de 4 °C'de 30 dk'da bir santrifüjde santrifüjde bir santrifüj de santrifüj lüzumlu bir konsantratör tüp kullanarak 15 g L^-1'e yoğunlaştırın. Kaplin reaksiyonuna devam edin (adım 5).
   NOT: Konsantrasyon veya kaplin adımları hemen gerçekleştirilemiyorsa DFE çözeltisini 4 °C'de saklayın.

5. Aktive Çapraz bağlı Agarose Resin dfe kaplin

NOT: Bağlantı için tüm ekipman ve çözümler hazır olana kadar NHS tarafından etkinleştirilen kolonlar için kullanılan izopropanol'ü değiştirmeyin. Sütunların kurumasına asla izin vermeyin.

1. DFE'nin aktif rezorna bağlantısını pH, tampon bileşimi ve DFE konsantrasyonu ile optimize etmek için bir deneme (DoE) modeli tasarla. DoE yönteminin ayrıntıları başkabir yerde 15 açıklanmıştır.
2. Afinite ligand çözeltisini (adım 4.8'den) 0.5-15 g· konsantrasyon aralığında hazırlayın. L^-1 veya DoE'da tanımlandığı gibi ve kaplin reaksiyonu hazır olana kadar buzüzerinde saklayın (adım 5.5). En az on 2 mL şırıngayı DFE çözeltisi ile doldurun ve şırıngaları 1,0 mL yatak hacmine sahip NHS tarafından etkinleştirilen çapraz bağlantılı agarose sütunlara monte etmek için bir adaptör hazırlayın.
3. Bağlantı için kullanılan her 10 kolon için 30 mL deaktivasyon çözeltisi (0,5 M etanolin, 0,5 M sodyum klorür, pH 8,3), 30 mL düşük pH çözeltisi (0,1 M sodyum asetat, 0,5 M sodyum klorür, pH 4,0) ve 10 mL depolama çözeltisi (0,05 M disodyum fosfat , %0.1 (m/v) sodyum azit, pH 7.0).
4. Bir tüpte 1 mM hidroklorik asit20 mL hazırlayın ve en az 20 dakika buz üzerinde kuluçka. Bağlantı reaksiyonu sırasında tüm adımlar için akış-through fraksiyonları izlemek için hassas bir ölçek hazırlayın (adım 5.7).
5. Mühürlü bir NHS tarafından etkinleştirilen çapraz bağlı agarose sütunu açın ve şırınga adaptörlerini sütun girişine monte edin. Şırıngaya bağlamadan önce bağdaşör girişine bir damla arabellek uygulayarak kolona giren havayı önleyin.
6. <1 mL min^-1 akış hızında 6 mL buz gibi 1 mM hidroklorik asit (adım 5.4'ten) ile kolonu yıkayın ve hemen adım 5.7'ye geçin.
7. <1 mL min^-1 akış hızında 2 mL şırınga kullanarak 1,5 mL DFE çözeltisi (adım 5.2) enjekte edin ve sonraki analiziçin akış için fraksiyonu hassas bir ölçekte (adım 5.4) toplayın (adım 7). DoE kurulumuna bağlı olarak kolonu her iki uçta ve 22 °C'de 15-45 dk kuluçkaya yatırın.
8. 6 mL deaktivasyon çözeltisi enjekte edin ve ardından 6 mL düşük pH çözeltisi <1 mL min^-1 akış hızında nakış hızıyla kovalent bağlı olmayan ligandları reçineden çıkarın. Daha sonra 6 mL deaktivasyon çözeltisi enjekte edin ve kolonu 15 dk kuluçkaya yatırın.
9. Kolona 6 mL düşük pH çözeltisi enjekte edin, ardından 6 mL devre dışı bırakma çözeltisi. Ardından kolona 6 mL daha düşük pH çözeltisi enjekte edin.
10. Kolona 2 mL depolama çözeltisi enjekte edin ve 4 °C'de depolayın.

6. Açıklık Bitkiler Özlerinden MAbs Saflaştırma Test

1. 2F5⁵ içeren 100 mL açıklıklı bitki ekstresi veya yine 2F5 içeren tercih edilen hücre tabanlı ifade sisteminden supernatant hazırlayın.
2. Denge tamponu (20 mM sodyum fosfat, 500 mM sodyum klorür, pH 7,4), düşük pH elüsyon tamponu (0,05 M sitrat, 0,05 M sodyum klorür, pH 4,0-3,25) ve yüksek iyonik mukavemetli elüs tamponu (1.0-4.0 M magnezyum klorür, 0.1 M HEPES, pH 8.0)
3. Renkbilim sistemini tamponlarla temizle. Kromatografi sistemine bir DFE yakınlık sütunu (adım 5.10'dan itibaren) monte edin ve 1,0 mL min^-1akış hızında 5 CV denge tamponu ile dengeleyin. UV emiciliğini 280 nm'de izleyin.
   NOT: Sütunüzerine bitki ekstresi veya hücre kültürü supernatant yükleme backpressure bir artışa neden olabilir. Kromatografi sistemine veya DFE sütununa zarar vermemek için 0,2 MPa'da yüksek basınç uyarısı ayarlayın.
4. 2 dk temas süresini garanti lemek için 0,5 mL min^-1 akış hızında kolonun üzerine açıklığa kavuşturulmuş bitki ekstresinin veya süpernatantın 80 mL'ini (adım 6.1) yükleyin. Anında numune analizi mümkün değilse, akış tantana örneklerini 4 °C'de saklayın.
5. Sütunu 6 CV'lik denge arabelleği ile yıkayın. Bu adımın başında, ortasında ve sonunda yıkama bir örnek toplayın.
6. Elute mAb 2F5 düşük pH elüsyon tampon veya yüksek iyonik mukavemetli elüsyon tampon (0.1 M HEPES, 1.25 M magnezyum klorür, pH 8.0) 5 CV ile. UV 280 nm sinyali taban çizgisinin üzerinde 5 mAU'ya yükseldiğinde DFE fraksiyonu toplayın.
   1. Her epitop-antikor çifti için elüsyon tamponu optimize edin. 2F5 için, 1.25 M magnezyum klorür ürün geri kazanımı ve ligand stabilitesi arasında optimum bir denge sağladı.
      NOT: Magnezyum klorür çözeltisi yağış eğilimli. Bu nedenle, magnezyum klorür çözün ~ 700 mL su. HEPES'i 100 mL suda ayrı ayrı çözün ve pH'ı 8.0'a ayarlayın. Çözünmüş magnezyum klorür çözeltisini HEPES çözeltisine ekleyin ve 1,0 L'lik son hacmine su ekleyin. Bu yağış neden olur, çünkü magnezyum klorür erittikten sonra pH ayaryapmayın.
7. 6.4-6.6 adımlarında alınan tüm örnekleri Bradford yöntemi, lityum dodecylsülfat poliakrilamid jel elektroforezi (LDS-PAGE) ve yüzey plazmon rezonans (SPR) spektroskopisi (adım 7) kullanarak analiz edin.

7. Örnek Analiz

1. Bradford yöntemi 18 ,¹⁹kullanarak TSP konsantrasyonu ölçün.
   1. Triplicate olarak, pipet 2.5 μL her örnek 96-well plaka tek bir kuyu içine. 0-2.000 mg· aralığıkapsayan triplicate sekiz büyükbaş serum albumin (BSA) standartları kullanın· L^-1.
   2. Her kuyuya 200 μL Bradford reaktifi ekleyin ve yavaşça yukarı ve aşağı boru lar ekleyerek karıştırın. Sonraki okuma bozan kabarcıklar oluşumunu önlemek için pipet seviyesini tutun.
   3. Plakayı 22 °C'de 10 dakika kuluçkaya yatırın ve emiciliği 595 nm'de spektrofotometrede ölçün. BSA referans noktaları üzerinden standart bir eğriyi temel alarak numunelerde TSP konsantrasyonu hesaplayın.
2. Florimetri ile DFE'yi ölçün
   1. Triplicate olarak, pipet 50 μL siyah 96-iyi yarım alan plaka tek kuyular içine her örnek. 0-225 mg· aralığını kapsayan altı DsRed standardı içerir· L^-1.
   2. Floresan'ı 530 ± 30 nm uyarma filtresi ve spektrofotometrede 590 ± 35 nm emisyon filtresi kullanarak iki kez ölçün. Örneklerdeki DFE konsantrasyonu, DsRed referans noktaları aracılığıyla standart bir eğriyi temel alarak hesaplayın.
3. SPR spektroskopisi 20ile 2F5 konsantrasyonu ölçün.
   1. HBS-EP çalışan tampon (10 mM 4-(2-hidroksitil)-1-piperazineeesulfonik asit (HEPES), 3 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA), 150 mM sodyum klorür, 0.005% v/v Tween-20, pH 7.4) hazırlayın ve 2μμ0 üzerinden geçerek filtre ile sterilize 2 μμμ şişe üstü filtre. Tamponu 15 dk degas.
   2. Karboksimetilleştirilmiş dekstran yüzey yongasını yerleştirmeden önce HBS-EP çalışan tamponu SPR cihazına bağlayın ve asal işlevi kullanarak sistemi dengeleyin. 30 μL min^-1 akış hızıyla manuel çalıştırmaya başlayın ve 30 mM hidroklorik asit ve 25 mM sodyum hidroksit (her biri iki enjeksiyon) akış hücreleri 1 ve 2'yi 1 dk için 30 μL min^-1 akış hızında dönüşümlü olarak enjekte ederek talaş yüzeyini koşullandırma.
   3. 500 mg' ın 300 μL'sini hazırlayın· L^-1 Protein 10 mM sodyum asetat çözeltisi (pH 4.0). 0.4 M 1-etil-3-(3-dimethylaminopropyl) karbodiimid hidroklorür (EDC) ve 0.1 M NHS ve santrifüj içeren çözülme şişeleri 1 dk için 1 6.000 x g EDC 70 μL ve 70 μL NHS karıştırmadan önce.
   4. EDC/NHS karışımını ve Protein A çözeltisini 7 mm plastik numune şişelerine aktarın ve numune rafına yerleştirin. 10 dk^-1 akış hızında EDC/NHS karışımını akış hücreleri 1 ve 2'ye enjekte ederek karboksimetillenmiş dekstran talaş yüzeyini etkinleştirin.
   5. Çift Protein A aktif karboksimetillenmiş dextran yüzeyine 15 μL min akış hızında akış hücre 2 üzerinde Protein A çözeltisi enjekte ederek 15 dk^-1 için.
   6. Protein A'yı bağlarken, 1,0 M etanolin hidroklorür (pH 8,5) ve 1 dk. 150 μL'lik bir şişeyi 7 mm plastik şişeye aktarın ve aletin içine yerleştirin. Adım 7.3.5 tamamlandığında, 7 dakika boyunca 10 μL min^-1 akış hızında akış hücreleri 1 ve 2 üzerine etanolamin çözeltisi enjekte ederek talaş yüzeyini devre dışı bırakın.
   7. 30 mM hidroklorik asit ve 25 mM sodyum hidroksit (her biri iki enjeksiyon) akış hücreleri 1 ve 2'nin üzerine 30 μL min^-1 akış hızıyla 0,5 dakika boyunca dönüşümlü olarak enjekte ederek talaş yüzeyini koşullandırma.
   8. HBS-EP çalışan tamponda 500 μg· konsantrasyonda antikor 2F5 standartlarını hazırlayın· HBS-EP'de 2F5 içeren L^-1 ve seyreltik numuneler 20-1.000 μg· aralığında son konsantrasyona kadar L^-1. 3 dk için 30 μL min^-1 akış hızında akış hücreleri 1 ve 2 üzerinden numune ler ve standartlar enjekte edin.
   9. Her örnek için akış hücresi 2 (ölçüm hücresi) sinyalinden akış hücresi 1'in (referans hücresi) göreli birimlerini (RU) çıkarın ve 2F5 standart enjeksiyonların RU sinyaline dayalı antikor konsantrasyonu hesaplayın.
   10. Her numune veya standart enjeksiyondan sonra, akış hücreleri 1 ve 2 üzerinde 0,5 dakika boyunca 30 μL min^-1 akış hızında 30 mM hidroklorik asit enjekte ederek talaş yüzeyini yeniden kurun.
   11. 2F5 atılım eğrisi elde etmek için hacim üzerinden akış karşı adım 6.4 her akış yoluyla örnek için 2F5 konsantrasyonu çizin. %10 dinamik bağlama kapasitesini (DBC) elde etmek için yükleme 2F5 konsantrasyonunun %10'una ulaşıldığında enjekte edilen 2F5 miktarını hesaplayın.
4. LDS-PAGE ile protein örneklerini analiz edin.
   1. Kullanıma hazır %4-12 BisTris LDS poliakrilamid jelaçınve elektroforez modülüne yerleştirin. 800 mL çalışan tamponu (50 mM MES, 50 mM Tris taban, 0,1% (m/v) SDS, 1 mM EDTA, pH 7,3) modüle aktarın ve 0,5 mL antioksidan çözelti ekleyin.
   2. 1,5 mL'lik bir reaksiyon tüpünde, 10 μL yükleme tamponu ile 4 μL azaltma maddesi ve 26 μL protein numunesini karıştırın. Tüpü 80 °C'de 10 dakika boyunca bir ısı bloğunda kuluçkaya yatırın. Tüpü 30 s için 500 x g'de santrifüj edin.
   3. LDS poliakrilamid jelini (şerit başına 10 μL numune) yükleyin ve 5 μL önceden lekeli protein standardını (10-180 kDa) ayrı bir şeride yükleyin.
   4. Elektroforez odasını kapatın ve güç kaynağını bağlayın. Elektroforez 40 dakika ve sabit 200 V'de çalışmalıdır.
   5. Jeli elektroforez odasından çıkarın. Jel yığılmayı açın ve 19 rpm bir shaker üzerinde 15 dakika suda jel yıkayın. 19 rpm bir shaker üzerinde boyama çözeltisi 1 saat için jel leke.
   6. 19 rpm bir shaker üzerinde suda 1 saat için jel destain. Bir film tarayıcısı kullanarak jeltini tarayın.

Results

İfade ve yakınlık ligand arınma

Füzyon proteinI DFE bir serada yetiştirilen transgenik tütün bitkileri ifade edildi. Verim ~ 120 mg·kg^-1

Discussion

Roman affinity resin uygulamaları

MAbs'nin yakalanması için özel yakınlık kromatografi reçinelerinin, NHS tarafından aktive edilen çapraz bağlı agarose'a mAb'ye özgü bir epitop içeren bir ligandın immobilize edilerek üretilebildiği gösterilmiştir. Böyle bir rezorin tasarlamak için epitop dizisini bilmek ve lineer bir epitop kullanmak gerekiyordu. Ortaya çıkan rejenler mAbs'nin yakalanması için avantajlıdır, çünkü pahalı Protein A affinity kromatografi adımlarının yerini alabilir. Olgu tetkiklerimizde 2F5 ve DFE arasındaki etkileşim epitop-paratop bağlanması ile aracılık edilebildi, bu nedenle ligandımız protein A'dan daha seçici olmalıdır, bu da çoğu murine ve insan IgG'nin Fc bölgesine bağlanır. Her mAb için bireysel ligandlar gerekli olduğundan, yöntemimiz başlangıçta çok büyük ölçekte üretilen antikorlar için uygun görünebilir. Ancak, hızlı bitki bazlı geçici protein ekspresyonu ile yaklaşımımızı birleştirerek, yeni afinite ligands az 2 hafta içinde hazırlanabilir²⁷ minimal çaba^{ile 28}. Bu nedenle, yöntem de küçük ölçekli mAb arıtma için uygundur.

Üretim ve yakınlık ligand potansiyel iyileştirmeler

Bitkiler yakınlık ligands^içinhızlı ve güvenli bir üretim platformu sunuyoruz 5^,29,30, DFE füzyon proteini gibi bizim vaka çalışmasıözellikli. Bitki materyalinin beyazlatma büyük ölçüde tek bir adımda konak hücre proteinlerinin miktarını azalttı ve kolayca standart bir açıklama rutin entegre edildi. Ancak, ligand kurtarma mevcut kurulum düşük, muhtemelen orta termal stabilite ve filtre katmanları bazı non-spesifik bağlama nedeniyle, diğer ürünler için bildirilen^31,32,33. Mühendislik taşıyıcı termal istikrarı artırmak için bu nedenle gelecekte ligand verimi artırmak için yardımcı olabilir, sıtma aşısı adayı CCT için açıklandığı gibi, antitümör enzim PpADI veya mezofilik β-glukozidaz^{34, 35,36}. Aynı protein mühendisliği filtre malzemesi³⁷non-spesifik bağlama azaltmaya yardımcı olabilir derinlik filtrasyon adım için geçerlidir. DFE ve benzeri ligandlar için üretim maliyetleri de flocculants veya filtre katkı maddeleri kullanarak açıklama genel verimliliğini artırarak azaltılabilir^38,39.

DsRed taşıyıcı olarak kullanıldığında tetramerik bir kompleks oluşturur. Bu, ligand başına epitopsayısı artar, çünkü avantajlıdır, ama aynı zamanda afinite kromatografi sırasında demontaj veya denatürasyon ligand daha duyarlı hale getirebilir. Düşük pH⁴⁰kararlı olduğu için mCherry gibi monomerik taşıyıcı protein tercih edilebilir, ve epitop tandem tekrarları dahil ligand avidite artacak ve böylece reçine kapasitesini artırmak^{5, 26.000 , 41}. Basit taşıyıcı-epitop proteinler için (yani, disülfür bağı veya çeviri sonrası modifikasyonları olmayanlar) mikrobiyal üretim sistemleri üretim maliyetlerini azaltabilir ve ligandları Protein A ile daha rekabetçi hale getirebilir. Örneğin, yeşil floresan protein ~ 1 g·kg^-1 biyokütle verimi ile bakteri hücrelerinde ifade edilmiştir, hangi önemli ölçüde ligand üretim maliyetlerini azaltacak⁴².

Ne olursa olsun ifade ana bilgisayar, saflaştırılmış bir yakınlık ligand aksi takdirde reçine seçicilik ve kapasitesini azaltabilir konak hücre proteinleri veya medya bileşenlerinin immobilizasyonen en aza indirmek için kaplin sırasında gerekli oldu. IMAC arınma için bir poli-histidin etiketi dahil tek bir adımda ~ 90% saflık arttı, hızlı ve ucuz ligand üretimi kolaylaştırmak^5,43,44. Ancak, bu steral epitop bağlanmasını engellemek veya taşıyıcı⁴⁵veya epitop ya dekolte indüklemek için potansiyele sahiptir çünkü füzyon etiketinin konumu önemlidir 45^,46.

NHS-aktive kromatografi kolonlarında afinite ligandın immobilizasyonu

İmmobilizasyon el ile veya kromatografi sistemi kullanılarak gerçekleştirildi. Sütun başına küçük tampon hacimleri manuel kullanımdan yana görünüyordu (örn. minimum atık hacimleri nedeniyle). Ancak, birden fazla/daha büyük sütun gerekiyorsa, kromatografi sistemi bağlantı koşullarını kontrol etmeyi kolaylaştırır (örn. düzenlenmiş akış hızları) ve bu nedenle DBC açısından tekrarlanabilir sonuçlar elde etme olasılığı daha yüksektir. Verilerimiz, bağlantı arabelleği ve pH'ın bağlantı verimliliği ve genel sütun maliyetleri üzerinde önemli bir etkiye sahip olduğunu göstermektedir. Kaplin reaksiyonunu etkileyen tarama faktörleri ve her taşıyıcı protein için ayarlanması (hatta her taşıyıcı-ligand füzyonu için) bu nedenle bağlantı verimliliğini ve reçin performansını artırabilir ve bu yaklaşımı öneriyoruz.

DFE afinite reçiyinkullanarak 2F5 izolasyontest

Ürün verimi ve saflık rekarne performansının önemli yönleridir ve DFE durumunda 105 ± %11 (±SD, n=3) ve %97 ± 3 saflık (±SD, n=3) elde ettik ve bu da kıyaslama Protein A rekarnelerinin performansıyla karşılaştırılabilir^{25 ,26}. Genel olarak rekarneler için bir diğer önemli performans göstergesi (ve özellikle afinite ligands dayalı olanlar için) DBC% 10 ürün atılım, bu parametre belirli bir işlem ve böylece maliyetleri için gerekli rekarin miktarını etkilediği için. DFE ligand için, ilk DBC ~4 g· L^-1 rezorin, benzer koşullar altında Protein A için karşılık gelen değerin ~% 13 (sadece 2 dk temas süresi)^25,47 ama yaklaşık 15 kat daha yüksek gibi diğer özel afinite recins göre anti-FSH-immünafinite ligand 2 dk⁴⁸aynı ikamet süresi kullanarak . DFE DBC 25 bind-ve-elute döngüleri sonra başlangıç değerinin% 15'e geriledi, 50'den fazla döngüleri ticari Protein A reisins⁴⁹DBC aynı kaybı için gerekli ise . Ancak, taşıyıcımızın henüz protein A ile aynı ölçüde optimize edilmemiş olduğunu belirtmek önemlidir, bu da son 40yılda kapsamlı bir şekilde araştırılmış ve geliştirilmiştir 8.

Şimdiye kadar düşük pH elüsyon tampon magnezyum klorür yüksek konsantrasyon (Şekil3),daha önceki çalışmalarda tavsiye 13 geçişyaparak rezorin stabilitesi ve ürün kurtarma geliştirdik. Yakınlık ligand karakteristik kırmızı renk 25 bind-ve-elute döngüleri sırasında önemli ölçüde solmaya vermedi, bu yüzden açıklık bitki özleri endojen bitki proteses³¹ kesilmiş olabilir ve böylece epitop inaktive ligand. Bu nedenle, taşıyıcı ve epitop bağlamak için proteaz dirençli bağlayıcılar tasarımı döngüleri uzun sayıda üzerinde ilk DBC korumak için yardımcı olabilir. DFE ligandının hızlı ve basit bir şekilde ifade edilip saflaştırılması, ticari kromatografi reçinelerine bağlanması ve mükemmel ürün verimi ve saflığı göz önüne alındığında, yöntemimizin Protein A'ya uygun bir alternatif sunduğuna inanıyoruz. özellikle taşıyıcı ve bağlayıcıdaki iyileştirmeler DBC ve ligand stabilitesini iyileştirebiliyorsa, Protein A'ya bağlanmayan mAb'lerin ve antikor türevlerinin saflaştırılması. Bu varsayım DFE saflaştırılmış ve Protein A-saflaştırılmış 2F5 antikor⁵dissosilasyon sabitindeki küçük fark tarafından desteklenerek, yeni yakınlık ligand'ımızın yüksek kaliteli mAbs'lerin geri kazanılmasına olanak sağladığını göstermiştir.

Yöntemin yararları ve mevcut sınırlamaları

Taşıyıcı protein ile genetik füzyon olarak yakınlık ligand üretmek sulu tamponlarda çözünürlüğü ve böylece tipik ligand kaplin koşulları ile uyumluluğu artırır. Buna karşılık, katı faz peptid sentezinden elde edilen boş peptidler,mAb tarafından tanınan epitopun amino asit dizisi tarafından dikte edildiği için değiştirilememiştir, 50 sırası nedeniyle bu koşullar altında sınırlı çözünürlüğe sahip olabilir. arındırılabilir. Diğerleri bu nedenle peptit ligands bir on-rekarne sentezi kullanmış⁵¹. Elde edilen reçinenin statik bağlama kapasitesi yüksekti (~80 g· L^-1), ancak reçine hazırlama süreci uzundur, dinamik bir bağlama kapasitesi rapor edilmemiş ve elde edilen saflık ve geri kazanım yaklaşımımıza göre daha düşüktür. Laboratuvar ölçeğinde bir füzyon protein ligand ek bir avantajı ligand ve bunların varyantları hızla üretilebilir, saflaştırılmış ve kolay kullanımı yüksek ekspresyon sistemi⁵²en az çaba ile test edilebilir.

Burada sunulan yöntemin iki güncel sınırlaması 3 g· düşük dinamik bağlama kapasitesidir. L^-1 ve 25 bind-ve-elute döngüleri⁵boyunca% 90 azalma . Bu sınırlamalar gelecekte daha az sıkı yükleme koşulları uygulanarak ve geçerli DsRed taşıyıcısının sırasıyla tasarlanmış, daha kararlı bir varyantla değiştirilmesiyle giderilebilir. Örneğin, geçerli temas süresini 2 ila 4 dakika arasında iki katına çıkarmak, bazı Protein A reçinekleri^26'dagösterildiği gibi dinamik bağlama kapasitesini iki katına çıkarma potansiyeline sahiptir.

Sorun giderme

Aşağıdaki tablo, bu protokol sırasında karşılaşılabilen olası sorunları vurgular ve bunlarınnasıl çözüleceğiniz hakkında ipuçları sağlar (Tablo 1).

Tablo 1: Karşılaşılabilen olası sorunlar ve olası düzeltmeler.
Protokol adımı	Sorun	Sebebi	Düzeltmek
1	Bitkiler yetişmiyor	Uzlaşmalı büyüme koşulları	Gübrenin pH'sını ve iletkenliğini kontrol edin
			Sıcaklık ve ışık koşullarını kontrol edin
2 ve 3	Ekstraksiyondan sonra büyük miktarlarda konak hücre proteinleri bulunur.	Eksik yağış	Beyazlatma sırasında sıcaklığı kontrol edin
			Beyazlatma banyosundaki ajitasyonu kontrol edin
2 ve 3	Bitki ekstresinde ürün bulunamadı	Beyazlatma sıcaklığı çok yüksek	Beyazlatma sırasında sıcaklığı ve pH'ı kontrol edin
		pH beyazlatma tampon çok düşük
3	Büyük sap veya yaprak parçaları çıkarmadan sonra kalır	Blender'da eksik karıştırma	Tesis malzemesinin blender'da fiş oluşturmadığından emin olun
3	Derinlik filtrasyonu sırasında hızlı basınç artışı	Yanlış filtre seçimi ve/veya yönlendirme	Filtre türünü ve yönünü kontrol edin
4	Elüzyon sırasında küçük füzyon proteini / akış yoluyla füzyon protein bir sürü	IMAC reşini metal iyonları ile şarj edilmedi	IMAC reşinini iyonlarla doğru şekilde şarj edip olmadığını kontrol edin
		Füzyon proteini afinite etiketini kaybetti	Bitki yetiştiriciliği sırasında yoğun güneş ışığından ve yüksek sıcaklıklardan kaçının
4	Konsantrasyon sırasında kaybedilen füzyon proteini	Membrana bağlı füzyon proteini	Membran türünü kontrol edin
			Konsantrasyon faktörünün çok yüksek olmadığından emin olun
5	Düşük bağlantı verimi	Bağlantı reaktifi ekinin yanlış sırası	Reaktif etiketlerini ve ekleme sırasını kontrol edin
		Bağlantıdan önce sütunların yanlış hazırlanması	Sütun preparaton koşullarını kontrol edin
5 ve 6	Düşük mAb verimi	Bitki biyokütlesinde düşük mAb ekspresyonu	Biyokütlede test mAb ekspresyonu
		Düşük ligand yoğunluğu	Füzyon protein preparatının saflığını kontrol edin
7	Bradford satoklarında çok düşük/yüksek protein konsantrasyonları	Pipetleme sırasında kabarcık oluşumu	96-iyi palte kabarcıklar için kontrol edin
7	SPR ölçümü sırasında düşük mAb konsantrasyonu	Tehlikeye Protein Bir çip	Bilinen konsantrasyon ile standart mAb sonuçları ile karşılaştırın
		Yanlış numune seyreltme	Seyreltme oranını ve tamponu kontrol edin

Tablo 1: Sorun giderme.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 L / 20 L Kova	n/a	n/a	Ağartma ekipmanı
2100P taşınabilir bulanıklık ölçer	Hach	4650000	Bulanıklık ölçer
ve AUML; KTApure	GE Helthcare	29018226	Kromatografi sistemi
Allegra 25R	Beckman Coulter	369434	Santrifüj
Amin Birleştirme Kiti	GE Healthcare	BR100050	SPR çip birleştirme kiti
Amin Birleştirme Kiti	GE Healthcare	BR100050	SPR çip birleştirme kiti
Antikor 2G12	Fraunhofer IME	n/a	SPR için Standart nicelik belirleme
Blender	Waring	800EG	Blender
BP-410	Fuhr	2632410001	Torba filtre
CanoScan 5600F	Canon	2925B009	Tarayıcı
Santrifüj tüpü 50 mL kendi kendine duran	Labomedik	1110504	Reaksiyon tüpü
Şelatlama Sefaroz FF	GE Helthcare	17-0575-01	Kromatografi reçinesi
Cond 3320	WTW	EKA 3338	İletim Ölçer
Tasarım Uzmanı (R) 8	Stat-Ease, Inc.	n/a	DoE yazılımı
Discovery Compfort Gilson		F81029	Çok kanallı pipet
Disodyum fosfat	Carl Roth GmbH	4984.3	Medya bileşeni
Çeşitli şişeler	Schott Duran	n/a	Glas şişeler
Dri Block DB8	Techne	Z381373	Isı bloğu
DsRed	Fraunhofe IME	n/a	Standart
EDTA	Carl Roth GmbH	8043.2	Tampon bileşeni
EnSpire	Perkin Elmer	2390-0000	Plaka okuyucu
ETHG-912	Oregon Scientific	086L001499-230	Termometre
F9-C	GE Helthcare	29027743	Fraksiyon toplayıcı
Ferty 2 Mega	Kammlott	5.220072	Gübre
Forma - 86C ULT dondurucu	ThermoFisher	88400	Dondurucu
HEPES	Carl Roth GmbH	9105.3	Tampon bileşen
Hettich Santrifüj Mikro 200	Hettich	2400	Santrifüj
HiPrep 26/10	GE Helthcare	GE17-5087-01	Kromatografi kolonu
HiTrap NHS ile aktive edilen Sepharose HP, 1 mL	GE Helthcare	17-0716-01	Kromatografi sütunlar
Hidroklorik asit	Carl Roth GmbH	4625.1	Tampon bileşeni
İmidazol	Carl Roth GmbH	3899.2	Tampon bileşeni
K700	Pall	5302305	Derinlik filtre tabakası
KM02 basic	IKA	n/a	Manyetik karıştırıcı
KS50P 60D	Pall	B12486	Derinlik filtre katmanı
L/S 24	Masterflex	SN-06508-24	Boru
Lauda E300	Lauda Dr Wobser GmbH	Z90010	Daldırma sirkülatör
Magnezyum klorür	Carl Roth GmbH	KK36.2	Tampon bileşeni
Masterflex L/S	Masterflex	HV-77921-75	Peristaltik pompa
Minisart 0.2 &mikro; m	Sartorius	16534K	Filtre ünitesi
Nalgene Hızlı Akışlı PES şişe üstü filtre	Thermo Fischer Scientific	595-4520	SPR tamponlarının vakumlu filtrasyonu
Nikel sülfat	Carl Roth GmbH	T111.1	Tampon bileşeni
Novex NuPAGE %4-12 BisTris LDS jeller	Invitrogen	NP0336BOX	LDS-PAA jelleri
Novex X-cell Mini Cell	Invitrogen	EI0001	PAGE odası
NuPAGE 20x çalışan tampon	Invitrogen	NP0002	Tampon konsantresi
NuPAGE antioksidan	Invitrogen	NP0005	Antioksidan
PageRuler protein merdiveni (10-180 kDa)	Invitrogen	26616	Protein standart
Delikli bucked	n/a	n/a	Ağartma
PH 3110	WTW	2AA110	PH metre
PowerPac HC	Biorad	1645052	Elektroforez modülü
Staphylococcus aureus	Sigma-Aldrich	P7837-5MG'den	Protein A SPR cipslerinin kaplanması
Sephadex G-25 ince, çapraz bağlı dekstran	GE Helthcare	17003301	Kromatografi reçinesi
Silikon kaşık	n/a	n/a	Kaşık
Simply Blue SafeStain	Invitrogen	LC6060	Jel boyama solüsyonu
Sodyum asetat	Carl Roth GmbH	6773.1	Tampon bileşeni
Sodyum asetat	Carl Roth GmbH	X891.1	Medya bileşeni
Sodyum azit	Sigma Aldrich	S2002-100G	Medya bileşeni
Sodyum klorür	Carl Roth GmbH	P029.2	Tampon bileşeni
Sodyum sitrat	Carl Roth GmbH	HN13.2	Tampon bileşeni
Sodyum bisülfit	Carl Roth GmbH	243973-100G	Medya bileşeni
Sodyum fosfat	Carl Roth GmbH	T877.2	Medya bileşeni
SPR Afinite Sensörü - Yüksek Kapasiteli Amin	Sierra Sensors GmbH/Bruker Daltonics	SPR-AS-HCA	SPR çip
SPR-2/4 Yüzey Plazmonu Rezonans Analizörü	Sierra Sensors GmbH/Bruker Daltonics	n/a	SPR cihazı
SSM3	Stuart	10034264	Mini Gyro-rocker
Isıtmalı kap, 20 L	Clatronic	n/a	Ağartma haznesi
Steril şırıngalar, 2 mL	B. Braun	4606027V	Şırıngalar Şırınga
adpter (Union Luer F)	GE Helthcare	181112-51	Şırınga adaptörü
TE6101	Sartorius	TE6101	Hassas terazi
Tween-20 (Polisorbat)	Merck	8170721000	Tampon bileşeni
Unicorn 6.4	GE Helthcare	29056102	Kromatografi yazılımı
Vakum torbaları	Ikea	203.392.84	Bitki depolama
VelaPad 60	Pall	VP60G03KNH4	Filtre muhafazası
Vortex-Genie 2	Bilimsel endüstriler	SI-0236	Vortex
XK-26/20 sütun muhafazası	GE Helthcare	28-9889-48	Kromotografi sütunu