Kloroplastlar, bitkileri tanımlayanorganellerdir 1. Birçok diğer metabolik, gelişimsel ve sinyal işleviyle birlikte, kloroplastlar fotosentezden sorumludur – bu süreç güneş ışığı enerjisinin hücresel aktiviteleri için kullanıldığı süreçtir. Sonuç olarak, kloroplastlar sadece bitkiler için değil, bitkilere bağlı olan sayısız ekosistem ve tarım için de gereklidir. Kloroplastlar, çoğu çekirdek kodlanıp sitosolden ithal edildikten sonra içten olarak açıkça ayrılan intraorganeller bölmelerden birine yönlendirilerek1. Kloroplast gelişimi ve işlevleri hakkında daha kapsamlı bir anlayış elde etmek ve gıda güvenliği veya biyoenerjiyle bağlantılı küresel zorlukları ele alan kloroplast manipülasyonunu içeren biyoteknolojik stratejileri mümkün kılmak için, önemli kloroplast proteinlerinin hedeflenmesi, lokalizasyonu ve etkileşimlerinin belirlenmesi hayati olacaktır. Bu yöntem koleksiyonu, bu hedeflere ulaşmak için kullanılabilecek kritik öneme sahip ve tamamlayıcı teknikler setini tanımlar. Koleksiyon çoğunlukla yaygın kullanılan model bitki Arabidopsis thaliana (thale tereki) üzerine odaklanır, ancak yöntemler diğer organizmalara da uyarlanabilir ve uygulanabilir.
Koleksiyon, çekirdek kodlu proteinlerin çift zarlı zarf boyunca kloroplastlara ithalatını analiz etmek için iki farklı tekniğin tanımlarını içermektedir. Ling veJarvis 2 tarafından yazılmış makale, izole kloroplastların radyoaktif olarak işaretlenmiş öncü protein ile kuluçka edildiği in vitro yöntemi tanımlar. Kloroplastların öncü proteini ne kadar aldığı, geçiş peptid (hedeflenen lider dizisi) bölünmesi sonucu oluşan protein boyutu değişikliğinin SDS-PAGE ve fosfor-görüntüleme kullanılarak izlenmesiyle belirlenir. Sunulan yöntem, on yıllardır in vitro kloroplast protein ithalatını incelemek için kullanılan bir yaklaşımıngeliştirilmesidir 3,4 ve tesisin yaşadığı stres koşullarına ithalat makinelerinin yanıt vermesini değerlendiren ek adımları içerir5. Öte yandan, Lee ve ark.6 tarafından yapılan makale, sağlam hücrelerde (protoplastlarda) floresan protein alanı taşıyan kimerik öncü proteinin geçici ekspresyonuna dayanan in vivo bir yöntemi tanımlar. Bu testte, kloroplast protein ithalatının kapsamı iki farklı şekilde takip edilebilir: floresan sinyalinin lokalizasyonu ve yoğunluğu floresan mikroskopisi kullanılarak izlenerek; ve geçiş peptid bölünmesi sonucu oluşan protein boyut değişimini immünoblotlama kullanarak analiz eder. Bu iki yöntem oldukça tamamlayıcıdır ve paralel olarak birlikte kullanıldığında etkileyicisonuçlar verebilirler 5.
Bir protein zarfın üzerinden kloroplasta ithal edildikten ve geçiş peptidi çıkarıldıktan sonra, ya stromada (organelin ana iç sulu bölmesi) nihai konformasyonunu alabilir ya da birçok iç sıralama yolundan biriniişe alabilir 1. Çok bol bulunan fotosentetik komplekslerin bulunduğu yer olarak, tilakoid zarlar bu tür içsel sıralama için önemli bir destinasyondur; Aslında, tilakoid protein hedefleme, birden fazla mekanik olarak farklı yolu içerir. Asher ve ark.7 tarafından yazılmış makale, farklı tilakoid protein translokasyon yollarının incelenmesini sağlayan bir dizi in vitro yöntemi tanımlar. Bu yöntemler, izole tilakoidlerin radyoaktif olarak işaretlenmiş öncül protein ve bazı durumlarda konsantre stromal ekstraktla kuluçkasını içerir. Proteinin tilakoidler tarafından ne kadar alındığı, hedef sinyalin bölünmesi ve proteinin dışsal uygulanan termolizin proteazdan korunması ile SDS-PAGE ve fosfor görüntüleme kullanılarak izlenir. Elbette, thylakoidler kloroplastın tek alt bölümü değildir ve genellikle diğer bölmeleri de değerlendirme yeteneğine sahip olmak istenir. Bu bağlamda, Bouchnak ve ark.8'in makalesi özellikle önemlidir; çünkü kloroplastların alt fraksiyonasyonu yöntemlerini açıklayarak zarf zarlarına, stromaya ve tilakoidlere karşılık gelen yüksek saf örnekler elde etmeyi açıklar. Hazırlandıktan sonra, bu fraksiyonlar immünoblotlama ve/veya kütle spektrometrisi ile analiz edilebilir; böylece kloroplast proteinlerinin suborganeller lokalizasyonu hakkında zengin bilgisağlanabilir9.
Protein-protein etkileşimleri ve çoklu protein kompleks montajlarının analizi açısından koleksiyonda iki farklı metodoloji tanımlanmıştır. Shanmugabalaji ve ark.10 tarafından yazılmış makale, kloroplast multiprotein komplekslerinin afinite saflaştırılması için bir yöntem sunmaktadır. Bu teknik, ilgi alanındaki kompleksin bir bileşenini ifade eden transgenik bitkilerin bir bileşenini (tandem affinity arındırma etiketi veya TAP etiketi) taşımak üzere tasarlanmış bir bileşenin analizini içerir. Bu etiketin aksi takdirde hareketsiz bir matrise güçlü şekilde bağlanma yeteneği, arındırma stratejisinin bir parçası olarak kullanılıyor. Sunulan yöntem özellikle kloroplast protein ithalat mekanizmasının saflaştırılmasına odaklanır (bu, zarf membranlarına gömülü TOC ve TIC adlı çoklu proteinkomplekslerini içerir 1), ancak prensipte kloroplastlarda bulunan diğer multiprotein yapılarını incelemek içinuyarlanabilir 11. Rantala ve ark.12'nin makalesi, doğal koşullarda elektroforeze dayalı karmaşık karakterizasyona tamamlayıcı bir yaklaşımı tanımlar. Burada sunulduğu gibi, fotosentetik komplekslerin saflaştırılmış tilakoidlerden hafif, iyon olmayan deterjan kullanılarak serbest bırakılmasını ve ardından mavi yerli (BN)-PAGE kullanılarak ayrılmasını içerir. Komplekslerin birincil çözünürlüğünü, denatürleme koşullarında elektroforezin ikinci boyutu takip edebilir ve bu, birinci boyutta tanımlanan her kompleksin bireysel bileşenlerinin görselleştirilmesini sağlar. TAP yönteminde olduğu gibi, bu doğal PAGE yaklaşımı organel13,14 içindeki diğer protein komplekslerini de çalışmak için başarıyla uyarlanabilir. Her iki yaklaşımda da, saflaştırılmış kompleksler immünoblotlama ve kütle spektrometrisi dahil olmak üzere çeşitli şekillerde analiz edilebilir.
Bu yöntem koleksiyonuna dahil edilen makaleler, mevcut kaynaklarla birlikte güçlü bir tamamlayıcı teknikler seti sunar ve bunlar mevcutkaynaklarla birlikte, özellikle organeller proteomla yakından bağlantılı olan kloroplast biyogenezi ve fonksiyonunun çeşitli yönlerini anlamamızı büyük ölçüde geliştirebilir. Kloroplastlar, karasal fotosentetik birincil üretimin büyük kısmından sorumlu ve ayrıca bitkilerin çevreye verdiği yanıtlarda (hem biyotik hem de abiyotik stresler dahil) hayati rollere sahip oldukları için, bu olağanüstü organeller kaçınılmaz olarak yıllarca dünya genelinde temel ve uygulamalı araştırmaların ana odağı olmaya devam edecektir.