Paw ve digit yörüngeleri 3 boyutlu yeniden yapılanma ile ulaşan otomatik Rat tek Pellet

Özet

Kemirgen yetenekli ulaşan yaygın becerikli becerileri çalışmak için kullanılır, ama önemli zaman ve çaba görevi uygulamak ve davranışı analiz gerektirir. Biz hareket izleme ve erişim yörüngeleri üç boyutlu yeniden yapılanma ile yetenekli ulaşmanın otomatik bir sürümünü tarif.

Özet

Kemirgen yetenekli ulaşan yaygın becerikli becerileri çalışmak için kullanılır, ama önemli zaman ve çaba görevi uygulamak ve davranışı analiz gerektirir. Yetenekli ulaşmanın birkaç otomatik sürümleri son zamanlarda geliştirilmiştir. Burada, yüksek kare oranlarında (300 fps) çoklu açılardan yüksek çözünürlüklü video kaydederken otomatik olarak fareler için Pelet sunan bir sürümü tarif ediyoruz. Paw ve bireysel basamak ile izlenir deeplabcut, bir makine öğrenme algoritması için işaretsizdir poz tahmini. Bu sistem ayrıca fizyolojik kayıtlarla senkronize edilebilir veya fizyopatolojik müdahaleleri (örn. elektrik veya optik stimülasyon) tetiklemek için kullanılabilir.

Giriş

İnsanlar tam olarak koordine çok eklem ve basamak hareketleri gerektiren hareketler olarak tanımlanan, becerikli beceri üzerinde ağır bağlıdır. Bu beceriler, yapısal lezyonlar (örneğin inme, tümör, demyelasyon lezyonları), nörodejeneratif hastalık (örneğin Parkinson hastalığı) ve motor fonksiyonel anomalileri de dahil olmak üzere bir dizi ortak merkezi sinir sistemi patolojilerinden etkilenir (örn. dystonia). Merkezi motor devreleri tarafından nasıl becerikli becerileri öğrendiklerini ve uygulandığını anlamak, bu nedenle büyük bir nüfus için yaşam kalitesini artırma potansiyeline sahiptir. Ayrıca, bu tür anlayış eğitim ve rehabilitasyon stratejileri optimize ederek sağlıklı insanlarda motor performansını artırmak olasıdır.

İnsanlarda becerikli beceri temelindeki nöral devrelerin kesilmesi, hayvan modellerinin kullanımını gerektiren teknolojik ve etik hususlar ile sınırlıdır. İnsan dışı primatlar genellikle onların motor sistemlerinin benzerlik ve insanlara davranışsal repertuar verilen becerikli ekstremite hareketleri çalışmak için kullanılır¹. Ancak, insan olmayan primatlar uzun nesil kez pahalı, çalışma konuları ve genetik müdahalelerin sayısını sınırlandırmak. Ayrıca, insan dışı primatlar için geçerli olan nörobilimsel Toolbox insanlar için daha büyükse, birçok son teknolojik gelişmeler ya kullanılamıyor ya da önemli ölçüde primatlarda sınırlıdır.

Kemirgen yetenekli ulaşmak, becerikli motor kontrolünü incelemek için tamamlayıcı bir yaklaşımdır. Rats ve fareler için ulaşmak için eğitimli olabilir, kavramak, ve insan ulaşan desenler²homolog hareketlerin bir klişe dizi bir şeker pelet almak. Nispeten kısa nesil zaman ve düşük konut maliyetleri nedeniyle, yanı sıra yeteneklerini haftalara gün içinde ulaşan yetenekli elde etmek için, hem öğrenme ve beceri konsolidasyon aşamaları sırasında konuların çok sayıda çalışmak mümkündür. Kemirgenlerin kullanımı, özellikle fareler, ayrıca güçlü modern nörooscientifik araçların kullanımını kolaylaştırır (örn., optogenetik, kalsiyum görüntüleme, hastalığın genetik modelleri) becerikli beceri çalışması için.

Kemirgen yetenekli ulaşan normal motor kontrolü ve nasıl inme ve Parkinson hastalığı³gibi belirli patolojiler tarafından etkilenir çalışmak için onlarca yıldır kullanılmıştır. Ancak, bu görevin çoğu sürümleri emek ve zaman yoğundur, kemirgenler eğitim yararları Azaltıcı. Tipik uygulamalar, kemirgenin ulaşması gereken dar bir yuvanın önünde bir raf ile bir erişim odasına kemirgenler yerleştirerek içerir. Bir araştırmacı elle rafta şeker Pellet yerleştirir, hayvan ulaşmak için bekler, ve sonra başka bir yere yerleştirir. Ulaşır başarı veya başarısızlıklar ya gerçek zamanlı olarak veya video İnceleme⁴olarak puan vardır. Ancak, başarılar ya da arızalar, sadece ulaşmanın bozulduğu şekilde nasıl (aksine) nasıl bilgi sağlayabilirler zengin kinematik verileri yoksayar olarak sadece Puanlama ulaşır. Bu sorun, tanımlamak ve yarı-nicematif puan erişim alt hareketleri⁵ulaşmak için videolar ulaşmak ayrıntılı inceleme uygulayarak giderildi. Bu erişim kinematikleri ile ilgili bazı veriler ekledi iken, aynı zamanda önemli ölçüde deney zaman ve çaba arttı. Ayrıca, yüksek düzeyde deney katılımı metodoloji ve veri analizi, aynı laboratuar içinde bile tutarsızlıklara yol açabilir.

Daha Geçenlerde, yetenekli ulaşmanın birkaç otomatik sürümleri geliştirilmiştir. Bazı ev kafesi^6,7, hayvanları aktarmak için ihtiyaç ortadan kaldırmak ekleyin. Bu hem hayvanların stres azaltır ve özel bir ulaşan odasına onları gelmesini ihtiyacını ortadan kaldırır. Diğer sürümler, böylece belirli müdahaleler altında kinematik değişiklikler⁸,^9,10, veya otomatik olarak Pellet raf¹¹gitti olup olmadığını belirlemek için mekanizmalar var, böylece Paw izleme sağlar. Otomatik vasıflı ulaşmak görevleri özellikle yüksek yoğunluklu eğitim için yararlıdır, bir yaralanma sonra rehabilitasyon için gerekli olabilir¹². Otomatik sistemler, hayvanların uzun süreler boyunca yoğun araştırmacı tutulumu gerektirmeden çok sayıda ulaşmasına olanak sağlar. Ayrıca, Paw izleme ve otomatik sonuç Puanlama izin sistemleri araştırmacı zaman veri analizi gerçekleştirmek için harcanan azaltır.

Biz çeşitli uzmanlaşmış özellikleri ile otomatik bir sıçan yetenekli ulaşan sistemi geliştirdi. İlk olarak, aşağıda "ulaşmak konumuna" içine Pelet getirmek için hareketli bir kaide kullanarak, biz forelimb neredeyse kesintisiz bir görünüm elde. İkinci olarak, bir ayna sistemi, yüksek çözünürlüklü, yüksek hızlı (300 fps) kamera kullanarak erişim yörüngeleri üç boyutlu (3-D) yeniden yapılanma sağlayan, tek bir kamera ile erişim birden fazla eşzamanlı görünümleri sağlar. İşaretsizdir hareket izleme¹³için sağlam makine öğrenme algoritmaları son gelişimi ile, şimdi sadece pençe ama bireysel Knuckles ayrıntılı erişim ayıklamak ve kinematik kavramak için takip. Üçüncü olarak, basit video işleme gerçekleştiren bir Frame-Grabber farklı ulaşan aşamaların gerçek zamanlı tanımlaması sağlar. Bu bilgiler video edinme tetiklemek için kullanılır (sürekli video edinme dosya boyutu nedeniyle pratik değildir), ve aynı zamanda kesin anlarda müdahaleleri (örn. optogenetiği) tetiklemek için kullanılabilir. Son olarak, tekil video çerçeveleri transistör-transistör mantığı (TTL) darbeleri ile tetiklenir ve videonun sinir kayıtlarıyla (örn. Elektrofizyoloji veya fotometri) tam olarak senkronize edilmesini sağlar. Burada, bu sistemin nasıl inşa edildiğini, görevi gerçekleştirmek için fareler eğitmesini, cihazı harici sistemlerle senkronize etmeyi ve 3-D erişim yörüngeleri yeniden inşa etmeyi tarif ediyoruz.

Protokol

Burada tarif edilen hayvan kullanımı ile ilgili tüm yöntemler Michigan Üniversitesi 'nin kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi (ıAYUC) tarafından onaylanmıştır.

1. ulaşan odanın ayarlanması

Not: Cihazın detayları ve diyagramları için Ellens ve al.¹⁴ ' e bakın. Parça numaraları Şekil 1' e bakın.

1. Bağlantılı oda oluşturmak için akrilik çimento ile Bond açık Polikarbonat paneller (15 cm genişliğinde 40 cm uzun 40 cm uzunluğunda) (parça #1). Bir yan panel (parça #2) bir kilitler ile (18 cm genişliğinde 15 cm yüksekliğinde) menteşeli bir kapı vardır. Sıçan bir kabloya bağlı olacak ise, (Bölüm #12) yerleştirmek için oda tavana bir yarık (5 cm genişliğinde 36 cm uzunluğunda) kesti. Zemin panelinde 18 delik (1,75 cm çap) (parça #13) içine kesilmiş ve odanın geri kalanı için bağlanmış değildir.
2. Yan panellerdeki kızılötesi sensörleri (parça #3), odanın arkasına 4,5 cm ve yerden 3,8 cm 'ye monte edin ve hizalayın. Davranışsal yazılım, kızılötesi ışın bozulduğunda ve kiriş kırılırken kırmızı olduğunda yeşil olan bir göstergeye (' IR Back ') sahiptir. Yazılım kurulduktan sonra, bu sensör hizalamasını kontrol etmek için kullanılabilir.
3. Bir ayna (15 cm x 5 cm, parça #4) 10 cm (parça #14) ulaşan yuvaya monte edin. Ayna açısı, Pelet teslimat çubuğu kamera tarafından görülebilir.
4. Odası sanitable destek kutusuna yerleştirin (59 cm genişliğinde 67,3 cm uzunluğunda 30,5 cm boyunda, parça #5). Oda (12 cm genişliğinde 25 cm uzunluğunda) destek kutusunda bir delik üzerinde kalan çöp zemin delikleri (parça #13) ve ulaşan oda dışında düşmek sağlar. İkinci bir deliği (7 cm genişliğinde, 6 cm uzunluğunda, parça #15), bir Pelet teslimat çubuğunun ulaşılabilen yuvasına granül getirmesini sağlayan, ulaşan yuvanın önündeki destek kutusuna keser.
5. İki aynalar Mount (8,5 cm genişliğinde x 18,5 cm uzunluğunda, parça #6) Oda her iki tarafında mıknatıslar ile zemin böylece ayna uzun kenarı bağlı kutunun önündeki yan panel 3 cm dokunuyor. Kamera kutuya ve Pelet teslim edilecektir ulaşan yuvasının önünde alan görebilirsiniz böylece aynalar açı.
6. Yüksek çözünürlüklü kamerayı (parça #7) 17 cm 'ye ulaşan yuvaya takın ve kutuya bakar şekilde takın.
7. Kameranın iki tarafında siyah kağıt (parça #18) monte edin, böylece yan aynalar arka planda karanlık. Bu gerçek zamanlı ve off-line Paw algılama geliştirmek için kontrast geliştirir.
8. Lineer aktüatörü (parça #16) temizleyici bir çerçeveye monte edin (25 cm genişliğinde, 55 cm uzunluğunda, 24 cm boyunda, parça #8) vidalarla. Aktüatör, Pelet tozunun pozisyon algılama potansiyometresinin içinde birikmesini önlemek için ters şekilde monte edilir.
9. Montajda tozun birikmesini önlemek için Pelet rezervuar (huni) (parça #9) boynuna bir köpük O-Ring takın. Karenin üst kısmındaki üç vidanın üstündeki huni kenarlarını kayarak çerçevenin üst kısmındaki bir delik (~ 6 cm çapı, parça #17) altında huni takın. Kılavuz tüpünü (parça #10) hunin boynuna takın.
10. Plastik T konektörünü aktüatörün çelik çubuğunun sonuna takın. Pelet teslimat çubuğunun konik ucunu konnektörün üst kısmına ve kılavuz tüpünden kapanmış ucunu Pelet rezervuatına takın.
11. Doğrusal aktüatör montajını, Pelet teslim çubuğun, ulaşan yuvanın önünde yer alan delikten (parça #15) uzatabilmesi için yetenekli ulaşan Odaya yerleştirin.
12. Tüm ulaşılan aparatı (121 cm x 119 cm x 50 cm) tekerlekli bir kabineye yerleştirin (iç mekan iyi aydınlatıldığında sıcak olur) ve akustik köpükle kaplıdır.
13. 25,4 cm destek panelleri ile 20,3 cm LED ışık şeritler yapışarak beş ışık panelleri (parça #11) inşa. Işık şeritler üzerinde Mount difüzör film. Pelet teslimat çubuğu alanının üzerinde tavana bir ışık paneli monte edin. Diğer dördü kabinin yan tarafına ulaşan oda boyunca monte edin.
    Not: gerçek zamanlı pençe tanımlaması için ulaşan yuva ve Pelet teslimat çubuğunun çevresindeki bölgeyi aydınlatmak önemlidir.

2. bilgisayar ve donanımı ayarlama

1. Üreticinin talimatlarına göre FPGA çerçeve yakalayıcı ve dijital uzatma kartlarını yükleyin ( malzeme tablosunabakın).
   Not: en az 16 GB RAM ve veri depolama için dahili bir katı hal sabit sürücü öneririz, akış gibi yüksek hızda video önemli tampon kapasitesi gerektirir.
2. Yüksek çözünürlüklü kamera sürücülerini yükleyin ve FPGA framegrabber bağlayın. Davranış yazılımı kamera ile ilişkili yazılımı kullanmak için kamera ile çalışan ve arabirim olmalıdır.
   Not: dahil edilen kod (ek dosyalara bakın) kameradan programlanabilir kayıtlarla erişir ve diğer markalarla uyumlu olmayabilir. En az 300 kare/sn (fps) cinsinden kayıt yapmanızı öneririz; At 150 fps biz Paw duruş önemli değişiklikler genellikle cevapsız bulundu.
3. Dahil kod (proje) "SR Automation_dig_ext_card_64bit" bilgisayara kopyalayın.

3. davranışsal eğitim

1. Eğitimden önce fareler hazırlayın.
   1. House Long-Evans fareler (erkek veya kadın, yaşları 10 – 20 hafta) gruplar halinde 2-3 kafes başına bir ters ışık/karanlık döngüsü. Eğitimden üç gün önce, vücut ağırlığı 10 –% 20 ' nin altında tutmak için gıda kısıtlaması üzerine fareler yerleştirin.
   2. En az 5 gün boyunca gün başına birkaç dakika boyunca fareler ele. Ele aldıktan sonra, yeni gıda tanıtmak için her ev kafesi sıçan başına 4 – 5 şeker peletlerin yerleştirin.
2. Fare (1-3 gün) ulaşan odasına habituate
   1. LED ışıkları açın ve ön ve arka odanın 3 şeker peletleri yerleştirin.
   2. Fare odasına yerleştirin ve sıçan 15 dakika keşfetmek için izin. Eğer peleteler yediğinde monitör. Bu aşaması, sıçan bütün Pelet zemininden yemene kadar tekrarlayın.
   3. Fareler arasında etanol ile Oda temizleyin.
      Not: karanlık aşamada eğitim ve test gerçekleştirin. Her gün aynı zamanda tren fareler.
3. Pençe tercihi (1 – 3 gün) ulaşmak ve gözlemlemek için sıçan tren.
   1. Işıkları açın ve yetenekli ulaşan odasına sıçan yerleştirin.
   2. Forseps kullanarak, kutunun ön kısmında bulunan yuva üzerinden bir Pelet tutun (Şekil 1, Şekil 2). Sıçan forseps 3 Pellet yemek izin verin.
   3. Bir dahaki sefere sıçan forseps gelen Pelet yemeye çalıştığında, Pelet geri çekin. Sonunda, sıçan pençe ile Pelet için ulaşmaya çalışacaktır.
   4. Bu 11 kez tekrarlayın. Sıçan 11 girişimleri en çok kullandığı pençe sıçan "pençe tercihi" olduğunu.
      Not: bir girişimde Paw ulaşan yuva geçmiş ulaşan olarak tanımlanır. Sıçan başarıyla elde etmek ve Pellet yemek gerekmez.
4. Sıçan Pelet teslimat çubuğu (1 – 3 gün) ulaşmak için tren
   1. Pelet teslimat çubuğunu, fare tercih edilen pençeye ulaşan yuvanın yan tarafına hizalayın (ulaşılacak odanın önünde tutarlı bir yerleştirme 1,5 cm 'yi sağlamak için bir rehber kullanın). Teslimat çubuğunun üst kısmı, ulaşan yuvanın alt kısmına hizalanmalıdır (Şekil 2B). Teslim çubuğa bir Pelet yerleştirin.
      Not: fare tercih edilen pençe karşısında teslimat çubuğu konumlandırma zor sıçan için tercih edilmeyen pençe ile Pelet elde etmek için yapar. Biz onların tercih edilmeyen pençe kullanarak fareler ile ilgili sorunlar olmadı. Ancak, belirli modellerde (örneğin, inme) bu hala ortaya çıkabilir ve tercih edilmeyen ulaşabilen ekstremite üzerinde bir kısıtlama eklenebilir.
   2. Forseps kullanılarak düzenlenen bir Pelet ile sıçan yem, ama onun pençe çubuk üzerinde Pelet Hits böylece teslim çubuk doğru sıçan. Sıçan, çubuğun üzerindeki Pelet 'i vursa, yerine takın. Bazı fareler başlangıçta yeterince uzağa ulaşamayabilir. Bu durumda, Pelet teslimat çubuğunu ulaşan yuvaya yaklaştırın ve sıçan geliştikçe yavaşça daha uzağa taşıyın.
   3. Yaklaşık 5-15 baited sonra fare teslim çubuk üzerinde kendiliğinden bir Pelet için ulaşmaya başlayacaktır ulaşır. Bir kez sıçan 10 giriştiği olmadan teslimat çubuğa ulaştığında, bir sonraki aşamaya ilerlemek olabilir.
5. Bir Pelet istemek için sıçan tren (2 – 8 gün).
   Not: Biz 100% başarı eğitim fareler Pelet için ulaşmak zorunda olmasına rağmen, fareler yaklaşık% 10 odanın arkasına hareket ettirerek bir pelat talep öğrenmek için başarısız.
   1. Pelet teslimat çubuğunu, sıçan pençe tercihine göre konumlandırın ve 2 konumuna ayarlayın (Şekil 2a). Aktüatör kumandasını kullanarak Pelet teslimat çubuğunun yükseklik konumlarını ayarlayın. Tutma düğmeleri 1 ve 2 aynı anda teslimat çubuğunu yukarı taşır, düğmeler 3 ve 2 tutarak teslimat çubuğunu aşağı taşır. Teslimat çubuğu doğru yükseklikte olduğunda, ışık kırmızı renkte yanıp sönene kadar istediğiniz numarayı basılı tutun.
   2. Sıçan odasına yerleştirin ve bir pellet ile geri sıçan yem. Fare, otomatik versiyon çalışıyorsa, Pelet teslimat çubuğunu 3 (Şekil 2B) konumuna taşıdığınızda, kızılötesi ışını kıracak olan odanın arkasına kadar yeterince hareket ettiğinde.
   3. Sıçan için Pelet ulaşmak için bekleyin ve sonra geri pozisyon 2 (Şekil 2a) Pelet teslimat çubuğu taşıyın. Teslim çubuğun üzerine yeni bir Pelet yerleştirin.
   4. Bu adımları yineleyin, fare daha az ve daha az yavaş sıçratır, sıçan başlayana kadar: (i) geri hareket etmeden bir Pelet istemek için, ve (ii) hemen önden bir Pelet talep ettikten sonra hareket. Sıçan bu 10 kez yaptıktan sonra, otomatik görev üzerinde eğitim için hazırdır.

4. otomatik sistemi kullanarak eğitim fareler

1. Otomatik sistemi ayarlayın.
   1. Odanın ışıkları açın ve gerekirse Pelet rezervuar doldurun.
   2. Sıçan pençe tercihine göre Pelet teslimat çubuğunu konumlandırın. Aktüatör pozisyonlarının doğru ayarlandığından emin olun ( Şekil 2agibi).
   3. Bilgisayarı açın ve yetenekli erişme programı (SR_dig_extension_card_64bit_ (ana bilgisayar) _ 3. VI) açın. Konu altında sıçan kimlik numarasını girin ve el açılır menüsünden Paw tercihi seçin. Videolar için Kaydet yolunu belirtin.
   4. Oturum süresini ve Maksimum videoları (oturumun sona ereceği video sayısı) ayarlayın. Program hangi sınıra ilk ulaşıldığında çalışmasını durdurur.
   5. Pelet Lift süresini ayarlayın (teslim çubuğunun, sıçan bir Pelet istediğinde "3" pozisyonunda kaldığı süre). Etkinleştirmek veya devre dışı erken Reach ceza (teslim çubuk sıfırlar konumuna "1" ve sonra geri "2" fare bir Pelet isteme önce ulaştığında).
2. Kalibrasyon görüntülerini alın. 3-b yörünge yeniden yapılanma, her görünümde eşleşen noktaları tanımlamanın gerektirdiği uygun dönüşüm matrislerini belirlemek için bir bilgisayar görme araç kutusu kullanır. Bunu yapmak için, her tarafta dama tahtası desenleri olan küçük bir küp kullanın (Şekil 3).
   1. Yardım elini ulaşan odanın içine yerleştirin ve timsah klibini ulaşan yuvaya takın. Küpü timsah klipsiyle birlikte ulaşan yuvanın önünde tutun.
   2. Küp, kırmızı tarafı üst aynada, sol aynaya yeşil tarafı ve sağ aynaya mavi tarafı görünür böylece konumlandırın. Her üç tarafın tüm yüzü aynalarda görünür olmalıdır (Şekil 3).
   3. Davranış programında ROI Threshold 'un çok büyük bir değere ayarlandığından emin olun (örn. 60000). Çalıştır düğmesini (beyaz ok) tıklatın. Kamera başlatıldı düğmesi yeşile döndüğünde Başlattuşuna basın. Videonun elde edildiğini unutmayın.
   4. Cal modu'nu tıklatın. Ardından, Cal görüntüsü al'ı tıklatarak bir görüntü alın. Görüntü dizini yolu artık ". png yolu" altında "GridCalibration_YYYYMMDD_img #. png" olarak biçimlendirilmiş. png dosyaadı ile görünür.
   5. Küpü hafifçe taşıyın ve başka bir görüntü alın. Toplam 3 görüntü için tekrar tekrarlayın.
   6. Durdur ve sonra Dur işareti düğmesini tıklatarak programı durdurun. Yardım el ve küp kutusundan çıkarın.
   7. Kalibrasyon görüntüleri o gün çekildiği sonra davranış odasında bir şey Bump değil dikkatli olun. Bir şey hareket ederse, yeni kalibrasyon görüntüleri alınması gerekir.
3. Otomatikleştirilmiş sistemi çalıştırın.
   Not: gerçek veri edinme için fareler çalıştırmadan önce her ayna için "YG Threshold" ayarlarını (aşağıda açıklanmıştır) belirleyin. Bu ayarlar belirlendikten sonra, programa başlamadan önce onları önceden ayarlayın ve gerekirse satın alma sırasında ayarlayın.
   1. Yetenekli ulaşan odasına sıçan yerleştirin. Programı çalıştırmak için beyaz oka tıklayın.
   2. Başlat' ı tıklatmadan önce, x-ofset (YG dikdörtgeninin sol üst köşesinin x-koordinatı), y-ofset (YG 'nin sol üst köşesinin y koordinatı), Roi Width ve ROI yüksekliği.
   3. YG 'yi, doğrudan ulaşan yuvanın önünde, pençe dorsum gösteren yan aynada konumlandırın (Şekil 2C). Pelet teslimat çubuğu YG giremez ve YG, sıçan ulaşmaz bir video tetiklemek Pelet veya sıçan kürk önlemek için kutuya uzatmaz emin olun.
   4. Programı başlatmak Için Başlat 'ı tıklatın.
   5. "Canlı YG tetikleyici değeri", "0" ve "1" (sıçan ulaşıldığında) arasında salınan kadar "düşük YG Threshold" değerini ayarlayın. Bu değer, eşik aralığındaki yoğunluk değerlerine sahip YG içindeki piksel sayısıdır.
   6. ROI eşikdeğerini ayarlayın. Sıçan burun YG 'ye ve sıçan Pellet için ulaştığında, canlı YG tetik değeri gözlemlemek. ROı eşiğinin, burun dürtleri sırasında "canlı YG tetikleyici değeri" nden önemli ölçüde daha büyük olmasını ve fare ulaştığında "canlı YG tetikleyici değeri" nden daha düşük olmasını ayarlayın. Fare geldiğinde, video sürekli olarak tetiklenene kadar ayarlayın ama o yuvadan burnuna sıçır
      Not: bu pençe daha hafif burun daha renkli olduğunu varsayar; pençe burun daha koyu ise ayarlamalar ters olacaktır.
   7. Her şeyin düzgün çalıştığından emin olmak için ilk birkaç denemeleri izleyin. Bir sıçan bir Pelet ("2" konumunda teslim çubuğu) talep etmeden önce ulaştığında, "erken ulaşır" sayı artar. Bir sıçan bir Pelet talep ettikten sonra ulaştığında ("3" pozisyonunda teslimat çubuğu), "Videolar" numarası artar ve bir video "RXXXX_YYYYMMDD_HH_MM_SS_trial #" adıyla. bin dosyası olarak kaydedilir.
      Not: varsayılan video 300 çerçeveleri (örneğin, 1 s) önce ve 1000 kare tetikleyici olay sonra (Bu yazılım yapılandırılabilir), hangi tüm erişim-to-kavrama hareketi dahil etmek için yeterli uzun olan Paw retraksiyon içerir.
   8. Oturum saati veya maksimum video ulaşıldığında, program durur. Dur işareti düğmesine basın.
   9. Etanol ile Oda temiz ve başka bir sıçan ile tekrar, ya da gün için yapılan video dönüştürme devam ederseniz.
4. . Bin dosyaları. avi dosyalarına dönüştürün.
   Not: alma sırasında videoları sıkıştırmak bırakılan çerçeveler neden olur, bu nedenle ikili dosyalar alma sırasında diske akış (yüksek veri aktarım hızları nedeniyle bir katı hal sürücüsü kullanın). Bu ikili dosyalar sıkıştırılmış kapalı-satır olmalıdır veya depolama gereksinimleri yasak büyük.
   1. "Bin2avi-color_1473R_noEncode. vi" programını açın.
   2. "Dosya yolu kontrolü" altında, dönüştürmek istediğiniz oturumu (örn. R0235_20180119a) seçmek için klasör düğmesini tıklatın. Her oturum için tekrarlayın (en fazla altı).
   3. Başlatmak için beyaz oku (Çalıştır) ve sonra "Başlat" ı tıklatın. "Genel Ilerleme (%)" içinde video sıkıştırmasını izleyebilirsiniz Bar. Programın bir gecede çalışmasını sağlar.
   4. Ertesi gün hayvanları eğitmek başlamadan önce, videoların dönüştürüldüğünü kontrol edin ve yeni videolar elde etmek için yeterli alan olması için. bin dosyalarını silin.

5. DeepLabCut ile videoları analiz etme

Not: farklı ağlar her Paw tercihi (sağ pençe ve sol pençe) için eğitimli ve her görünüm için (sağ pawed fareler için doğrudan görünüm ve sol ayna görünümü, sol piyonlu fareler için doğrudan görünüm ve sağ ayna görünümü). Üst ayna görünümü 3D yeniden yapılanma için kullanılmaz-sadece burun yuva girdiğinde algılamak için, hangi girişimler tetiklemek için yararlı olabilir (örn., optogenetiği). Her ağ daha sonra ilgili pençe ve görünüm için kırpılmış video bir dizi analiz etmek için kullanılır.

1. DeepLabCut ağları eğitmek (ayrıntılı talimatlar https://github.com/AlexEMG/DeepLabCut üzerinde DeepLabCut belgelerinde sağlanır).
   1. Oluşturmak ve yeni bir proje deeplabcut, bir makine öğrenme algoritması işaretsizdir poz tahmini¹³için yapılandırın.
   2. Program arayüzünde (doğrudan veya ayna görünümü) dahil etmek için görünüme yetenekli ulaşan videolar ve kırpma görüntüleri çerçeveleri ayıklamak için programı kullanın. Kırpma çerçeveleri yeterince büyük, böylece sıçan ve her iki ön pençeleri görünür.
      Not: ağlar genellikle 100 – 150 eğitim çerçevesi gerektirir. Daha fazla eğitim çerçeveleri pençe içinde olduğu gibi aydınlatma nedeniyle odanın dışında karşılaştırıldığında gereklidir. Sıkı kırpma işlem süresini azaltır, ancak kırpılmış bölgeler her sıçan için pençe tam yörünge algılamak için yeterince büyük olduğunu dikkatli olun. Bu sıçan tüm vücut için çerçeve (doğrudan görünüm) sığacak kadar geniş olmalıdır ve mümkün olduğunca geri odasına ve teslim çubuk (ayna görünümü) önünde görmek için.
   3. Vücut parçaları etiket için program GUI kullanın. Her çerçevede etiket 16 puan: 4 Metakarpofalangeal (MCP) eklemler, 4 proksimal interfalgeal (PIP) eklem, 4 haneli ipuçları, ulaşan pençe dorsum, burun, olmayan ulaşan pençe dorsum, ve Pelet (Şekil 4).
   4. Eğitim veri kümesini oluşturmak, ağı eğitmek ve eğitimli ağı değerlendirmek için DeepLabCut (DLC gibi kısaltılmış) yönergelerini izleyin.
2. Videoları analiz edin ve ağı hassaslaştırın.
   1. Yeni eğitimli bir ağ ile tüm videoları analiz etmeden önce, ağın performansını değerlendirmek için 10 videoyu analiz edin. Belirli pozlar içinde tutarlı hatalar varsa, bu pozları içeren ek eğitim çerçeveleri ayıklamak ve ağ yeniden eğitmek.
   2. Videoları analiz ederken, 3D yörünge yeniden yapılanma için koda beslenir. csv dosyaları, çıktı emin olun.

6. kutu kalibrasyonu

Not: Bu yönergeler, 3-b koordinatları doğrudan ve yansıtma görünümlerinde tanımlanan noktaları dönüştürmek için dönüştürme matrisleri belirlemek için kullanılır. En güncel sürüm ve boxCalibration paketinin nasıl kullanılacağı hakkında daha fazla ayrıntı için, kullanım için adım adım yönergeler içeren Leventhal Lab GitHub: https://github.com/LeventhalLab/boxCalibration konusuna bakın.

1. Tüm kalibrasyon görüntülerini aynı klasörde toplayın.
2. Imagej/Fiji kullanarak, her kalibrasyon görüntüsü için dama tahtası noktalarını manuel olarak işaretleyin. Bu görüntüyü "GridCalibration_YYYYMMDD_ #. tif" olarak kaydedin, burada ' YYYYMMDD ', kalibrasyon görüntüsünün karşılık geldiği tarih ve ' # ' Bu tarih için görüntü numarasıdır.
   1. Imagej 'de ölçüm fonksiyonunu kullanın (araç çubuğunda, analiz et | Ölçü). Bu, işaretlenmiş tüm noktalar için koordinatlar içeren bir tablo görüntüler. Bu dosyayı, tarih ve görüntü numarasının karşılık gelen. tif dosyasıyla aynı olduğu "GridCalibration_YYYYMMDD_ #. csv" adıyla kaydedin.
3. Boxcalibration paketinde ' setparams. m ' dosyasını açın. Bu dosya tüm gerekli değişkenleri ve bunların açıklamasını içerir. Projenin belirtimlerini sığdırmak için gerektiğinde değişkenleri düzenleyin.
4. Calibrateboxes işlevini çalıştırın. Komut penceresinde birkaç istem görünecektir. İlk istem, klasördeki tüm görüntüleri çözümlemek isteyip istemediğinizi sorar. Y yazarak istekleri sona erecek ve tüm tarihler için tüm görüntüler analiz edilecektir. N yazarak çözümlemek için tarihleri girmek için kullanıcıya sorar.
   Not: kalibrasyon görüntüleri klasöründe Iki yeni dizinler oluşturulur: ' Markedımages ', kalibrasyon görüntüsünde Kullanıcı tanımlı dama tahtası işaretleri içeren. png dosyaları içerir. ' BoxCalibration ' klasörü, kutu kalibrasyon parametrelerine sahip. mat dosyaları içerir.
5. Checkboxcalibration işlevini çalıştırın. Bu, ' boxCalibration ' klasöründe ' checkCalibration ' yeni bir klasör oluşturacaktır. Her tarihin görüntüleri içeren bir alt klasör ve kutu kalibrasyonunun doğru şekilde tamamlanmasını doğrulamak için kullanılan birkaç. fig dosyası olacaktır.

7.3D yörüngeleri yeniden inşa etme

1. Öğrenme programı çıktısını içeren. csv dosyalarını reconstruct3Dtrajectories komut dosyasında açıklanan dizin yapısına birleştirin.
2. Reconstruct3Dtrajectoriesçalıştırın. Bu komut dosyası, dizin yapısını arar ve doğrudan/ayna noktalarını (her iki görünümdeki aynı gövde parçası adlarını kullanmak önemlidir) öne çıktığı programda adlarına göre eşleştirecektir.
3. Calculatekinematicsçalıştırın. Bu script 3-b yörünge rekonstrüksiyonları, belirli ihtiyaçlarına uyarlanmış olabilir basit kinematik özellikleri ayıklar.
   Not: yazılım, komşularına ve tamamlayıcı görünümdeki konumlarına dayalı olarak okcluded gövde parçalarının konumunu tahmin eder (örn., doğrudan kamera görünümündeki bir gövde parçasının konumu, olası konumlarını ayna görünümünde sınırlar). O yuvadan geçerken Paw ayna görünümünde okcluded zamanlar için, Paw koordinatları komşu çerçevelere göre interpolasyonlu.

Sonuçlar

Rats, 1 – 2 hafta (Şekil 5) üzerinde her iki sayı ve doğruluğu açısından performans platolaşmasının ile, bir kez cihaz acclimated hızla yetenekli ulaşan görev elde. Şekil 6 , DeepLabCut tarafından tanımlanan yapıları gösteren örnek video çerçevelerini gösterir ve Şekil 7 ' de tek bir oturumdan gelen bireysel erişim yörüngeleri gösterilir. Son olarak, Şekil 8' de, Paw algılama tetikleyicisi (Steps 4.3.4 ...

Tartışma

Kemirgen yetenekli ulaşmak motor sistemi fizyolojisi ve patofizyolojisi incelemek için standart bir araç haline gelmiştir. Biz sağlayan otomatik bir sıçan yetenekli ulaşmak görev nasıl uygulanacağını tarif ettik: eğitim ve minimal gözetim ile test, 3-D pençe ve basamak yörünge yeniden yapılanma (ulaşan sırasında, açgözlü, ve Paw retraksiyon), gerçek zamanlı kimlik ulaşmak sırasında pençe ve dış elektronik ile senkronizasyon. Forelimb kinematikleri fizyolojiyle ilişkilendirmek ya da hareketlere ulaşırken tam zamanlı giriş...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
şeffaf polikarbonat paneller	TAP Plastikler		siparişe göre kesilmiş (kutu tasarımına bakın)
kızılötesi kaynak/dedektör	Med Associates	ENV-253SD	30" menzilli
kamera	Basler	acA2000-340kc	2046 x 1086 CMV2000 340 fps Renkli Kamera Bağlantısı
kamera lensi	Megapiksel (bilgisayar)	M0814-MP2	2/3" 8mm f1.4 w/ kilitleme İris & Odak
kamera kabloları	Basler	#2000031083	Kablo PoCL Kamera Bağlantısı SDR/MDR Tam, 5 m - Veri Kabloları
aynalar	Amazon
lineer aktüatör	Konsantrikler	LACT6P	Lineer Aktüatör 6" Strok (nominal), 110 Lb Kuvvet, 12 VDC, Potansiyometre
ile pelet rezervuarı/hunisi	Amico (Amazon)	a12073000ux0890	6" huni
kılavuz tüp	ePlastics	ACREXT.500X.250	1/2 "OD x 1/4" ID Açık. Ekstrüde Pleksiglas Akrilik Tüp x 6ft uzun
pelet dağıtım çubuğu	ePlastics	ACRCAR.250	0.250 "DIA. Dökme Akrilik Çubuk (2 'uzunluk)
plastik T konektörü	Amerika Birleşik Devletleri Plastik Corp	# 62065	3/8 "x 3/8" x 3/8 "Hortum Kimliği Siyah HDPE Tee
LED ışıklar	Aydınlatma HİÇ	4100066-DW-F	12V Esnek Su Geçirmez LED Işık Şeridi, LED Bant, Gün Işığı Beyazı, Süper Parlak 300 Birim 5050 LED, 16.4Ft 5 M Makara
Işık desteği	ePlastics	ACTLNAT0.125X12X36	0.125 "x 12" x 36 "Doğal Asetal Levha
Işık difüzör filmleri	icatlar	23114-01.007x8.5x11	", mat iki taraflı
dolap ve özel çerçeve malzemeleri	çeşitli (Home Depot, vb.)		3/4" fiber levha (her yapının boyutları için protokole bakın)
akustik köpük	Akustik Birinci		FireFlex Kama Akustik Köpük (2" Kalınlığında)
havalandırma fanları	Cooler Master (Amazon)	B002R9RBO0	Tüfek Yatağı Bilgisayar Kasaları ve CPU Soğutucuları için 80mm Sessiz Soğutma Fanı
dolap kapısı menteşeleri	Everbilt (Home Depot	# 14609	sürekli çelik menteşe (1.4" x 48 inç)
dolap tekerlekleri	Everbilt (Home	Depot # 49509	90 lb yük değeri ve yan fren dolap kapı kolu ile yumuşak kauçuk döner plaka tekerleği
	Everbilt (Home	Depot # 15094	Beyaz hafif hizmet tipi kapı çekme (4.5 ")
bilgisayar	Hewlett Packard	Z620	HP Z620 Masaüstü İş İstasyonu
Kamera Bağlantı Çerçevesi Yakalayıcı	Ulusal Enstrümanlar	# 781585-01	PCIe-1473 Virtex-5 LX50 Kamera Bağlantısı - Tam
Çok İşlevli RIO Kartı	Ulusal Aletler	# 781100-01	PCIe-17841R
Analog RIO Kart Kablosu	Ulusal Aletler	SCH68M-68F-RMIO	Çok İşlevli Kablo
Dijital RIO Kurulu Kablosu	Ulusal Aletler	# 191667-01	SHC68-68-RDIO R Serisi Analog Terminal Bloğu için Dijital Kablo
	Ulusal Aletler	# 782536-01	SCB-68A Gürültü Reddetme, Korumalı G / Ç Konektör Bloğu
Dijital Terminal Bloğu	Ulusal Aletler	# 782536-01	SCB-68A Gürültü Reddetme, Korumalı G / Ç Konektör Bloğu
24 konumlu röle rafı	Ölçüm Computing Corp.	SSR-RACK24	Katı hal röle arka paneli (Gordos / OPTO-22 tipi röleler), 24 kanallı
DC anahtarı	Measurement Computing Corp.	SSR-ODC-05	Katı hal röle modülü, tek, DC anahtarı, 3 ila 60 VDC @ 3.5 A
DC Sense	Measurement Computing Corp.	SSR-IDC-05	katı hal röle modülü, tek, DC duyarlı, 3 ila 32 VDC
DC Güç Kaynağı	BK Precision	1671A	Üçlü Çıkışlı 30V, 5A Dijital Ekran DC Güç Kaynağı
şeker peletleri	Bio Serv	F0023	Tozsuz Hassas Peletler, 45 mg, Sükroz (Tatlandırılmamış)
LabVIEW	National Instruments	LabVIEW 2014 SP1, 64 ve 32 bit sürümleri	Video akışı için yeterli belleğe erişmek için 64 bit LabVIEW gereklidir, ancak FPGA kodlaması 32 bit LabVIEW MATLAB'da gerçekleştirilmelidir
	Mathworks	Matlab R2019a	kutu kalibrasyonu ve yörünge yeniden yapılandırma yazılımı Matlab'da yazılmıştır ve Computer Vision araç kutusu gerektirir