Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Disanated primer hipokampal kültürlerde glutamat reseptör kaçakçılığı çalışması için antikor beslenme yaklaşımı

5.6K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/59982

⸱

2 Ağustos 2019

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 2Department of Cellular Neurophysiology, Institute of Physiology CAS

Bu makalede

Özet

Bu makalede, ayrılmış primer hipokampal kültürlerde glutamat reseptörü (GluR) kaçakçılığı çalışması için bir yöntem sunulur. Endojen veya aşırı ifade reseptörlerinin farmakolojik yaklaşımlar ile birlikte etiketlenmesi için antikor beslemeli bir yaklaşım kullanarak, bu yöntem, GluR yüzey ifadesini düzenleyen moleküler mekanizmaların belirlenmesi için izin verir veya geri dönüşüm süreçleri.

Özet

Harici uyaranlara hücresel tepkiler ağır belirli bir anda hücre yüzeyinde ifade reseptörleri kümesine güveniyor. Buna göre, yüzey tarafından ifade edilen reseptörlerin nüfusu sürekli uyarlama ve sıkı düzenleme mekanizmalarına tabidir. Paradigma örneği ve biyolojideki en çok araştırılan kaçakçılık olaylarından biri de glutamat reseptörlerinin (GluRs) sinaptik ifadesinin denetlendiği kontrolidir. GluRs, sinaptik ve nöronal düzeylerde (örneğin, sinaptik plastisite), merkezi sinir sisteminde uyarıcı nörotransmisyon büyük çoğunluğu arabulucu ve fizyolojik aktivite bağımlı fonksiyonel ve yapısal değişiklikler kontrol. Yüzeydeki sayı, konum ve alt birim bileşiminde yapılan değişiklikler, GluRs 'un nöronal fonksiyonları derinden etkilediğini ve aslında bu faktörlerde yapılan değişiklikler farklı nöropati ile ilişkilidir. Burada sunulan, disanated hipokampal primer nöronlar GluR ticareti incelemek için bir yöntemdir. "Antikor-besleme" yaklaşımı, yüzey ve iç membranlarda ifade edilen GluR nüfusunun farklılaşarak görselleştirilmesi için kullanılır. Yüzey reseptörlerini canlı hücrelerde etiketleme ve reseptörlere endositoz ve/veya geri dönüşüm için izin vermek için farklı zamanlarda sabitleme, bu kaçakçılık süreçleri değerlendirilebilir ve seçici olarak incelenebilir. Bu, GluR kaçakçılığı etkileyen uyarıcı ve moleküler mekanizmalar hakkında değerli bilgiler elde etmek için değiştirilmiş reseptörlerin farmakolojik yaklaşımlar veya aşırı ifade edilmesi ile birlikte kullanılabilecek çok yönlü bir protokoldür. Benzer şekilde, diğer reseptörleri veya yüzey ifade proteinleri çalışmak için kolayca adapte edilebilir.

Giriş

Hücreler, proteinleri belirli alt hücresel lokalize olarak seferber etmek ve fonksiyonları1üzerinde sıkı bir mekan düzenlemesi yapmak için aktif ticaretini kullanır. Bu süreç özellikle transmembran reseptörleri için önemlidir, farklı çevresel uyaranlara hücresel tepkiler reseptör aktivasyonu ile tetiklenen hücre içi Cascades güveniyor gibi. Hücreler reseptör hücre altı ticareti düzenleme2ile hücre yüzeyinde ifade edilen reseptörlerin yoğunluğu, lokalizasyonu ve alt birim bileşimi değiştirerek bu yanıtları değiştirebilir. Yeni sentezlenmiş reseptörlerin plazma membranı içine yerleştirilmesi, endositoz ve mevcut reseptörlerin geri dönüşümünün yanı sıra yüzey-ifade reseptörlerinin net havuzunu belirleyen kaçakçılık süreçlerine örnektir2. Protein kaçakçılığı düzenleyen birçok Moleküler mekanizma işbirliği, proteinli protein etkileşimleri ve fosforilasyon, ubiquitination gibi posttranslasyonel modifikasyonlar, veya palmitoyasyon2.

Reseptör kaçakçılığının düzenlenmesi özellikle çok özel yapılarla güçlü polarize hücrelerde gereklidir. Paradigmatik örnek glutamat reseptörleri (glurs)3,4düzenlenmiş ticareti ile nöronal fonksiyon kontrolü. Glutamat, ana uyarıcı nörotransmitter, bağlar ve yüzey-ifade GluRs sinaptik nörotransmisyon ve sinaptik plastisite gibi temel fizyolojik nöronal fonksiyonları kontrol etmek için etkinleştirir. Nöro-gelişimsel bozukluklardan nörodejeneratif hastalıklara kadar uzanan geniş bir nöropati yelpazesinde GluR kaçakçılığı değiştirildiği gerçeğini bu sürecin5' in önemini vurgulamaktadır. Böylece, GluR kaçakçılığı kontrol eden moleküler olayların anlaşılması araştırma birçok alanda ilgi olduğunu.

Bu protokolde, primer hipokampal nöronların yüzey seviyesinin ölçülmesi için antikor beslemeli bir yöntem kullanılır, aynı zamanda ınterpralization ve geri dönüşümdeki değişikliklerin gözlenen net yüzey ifadesinde nasıl sonuçlanduğunu değerlendirebilirsiniz. Spesifik mutasyonları kullanan eksojen reseptörlerin farmakolojisinin ve/veya aşırı ifadesinin kullanımı, bu protokol, farklı çevresel uyaranlara nöronal adaptasyon temelindeki moleküler mekanizmaları incelemek için özellikle güçlü bir yaklaşım sağlar. Bu protokolün son örneği, ortamda (örneğin, bir hastalık modelinde), bu tür modellerde yüzey ifadesinin incelenmesi yoluyla GluR kaçakçılığı etkilemesi konusunda ne kadar multifokal değişiklikler yapılacağını okuyor.

Belirli örnekler kullanarak, başlangıçta fizyolojik sinaptik stimülasyon taklit bir farmakolojik manipülasyon nasıl gösterilmiştir [kimyasal LTP (cltp)] AMPA-glurs tipi (ampars) endojen GluA1 altbirim yüzey ifadesi artar 6. NMDA-türü glurs (nmdars) GluN2B altbirim bir aşırı ifade fosho-mimetic formu ticareti de bu protokol belirli posttranslasyonel tarafından Glur kaçakçılığı düzenlenmesi çalışmak için nasıl kullanılabilirler örnek olarak analiz edilir Değişiklik. Bu özel örnekler kullanılsa da, bu protokol diğer GluRs ve diğer reseptörlere ve antijenik hücre dışı alanlara sahip olan proteinler için kolayca uygulanabilir. Hücre dışı alanlar için mevcut antikorlar olmadığı durumda, ekstrelüler epitope etiketli (örn., bayrak-, MYC-, GFP-Tagged, vb.) proteinleri protein etiketlemeye yardımcı olabilir.

Geçerli protokol, spesifik antikorlar kullanarak belirli GluR alt tipi yoğunluğunu ve kaçakçılığı ölçmek için yönergeler sağlar. Bu protokol 1) Toplam GluR yüzey ifadesi, 2) GluR etilleştirme ve 3) GluR geri dönüşümü için kullanılabilir. Her bir işlemi bireysel olarak incelemek için 1 ve 2 bölümlerle başlamak ve 3, 4 veya 5 bölümüne devam etmeniz önerilir. Her durumda, 6 ve 8 bölümlerle bitir (Şekil 1).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Hipokampal İlköğretim kültürü hazırlığı ile ilgili çalışmalar Northwestern Üniversitesi hayvan bakımı ve kullanım Komitesi (protokol #IS00001151) tarafından incelendi ve onaylanmıştır.

1. etiketleme öncesi hazırlık

  1. Primer hipokampal kültürlerin hazırlanması ve Bakımı
    1. Primer hipokampal kültürlerini Poly-D-lizin kaplı (0,1 mg/mL) 18 mm kapak gözlüklerinde kaplama 150.000 hücrelerin yoğunluğunda hazırlayın. Dissosyated nöronal kültür hazırlığı için mükemmel kılavuzlar7,8mevcuttur.
      Not: Gerekirse, kültürler, hazırlıkta glial proliferasyonu önlemek için sitosin arabinozid (ara-C, Div1 kullanılmaktadır den 10 mm) ile tedavi edilebilir.
      Not: Poli-D-lizin yerine fibronektin (1 mg/mL) veya laminin (5 mg/mL) gibi alternatif kaplama reaktifler kullanılabilir.
    2. 37 °C ve 5% CO2 ' de 2 ml/iyi neurobazal medyanın, B27 ve 2 mm L-glutamin ile takviye edilen bir hücre inkükokosu kültürlerini koruyun.
      Not: L-glutamin yerine (örneğin, Glutamax) istenirse kullanılabilir.
    3. Haftalık bazda, ortamın yarı hacmini kaldırın ve aynı hacimli nörobazal medya ile değiştirin.
  2. OPSIYONEL: mutasyona uğramış ve/veya epitope etiketli reseptörlerin transfeksiyon
    Not:     nöronlar reseptör ifadesi için izin vermek için analiz zaman noktasından en az 3 – 4 gün önce transfitleştirilebilir. Genç nöronların kullanımı [Days In vitro 6 – 9 (DIV6)] daha eski daha iyi transfeksiyon verimliliği sonuçlanır (DIV15 – 20) nöronlar, ama transfekte hücrelerin yeterli sayıda (> 20) ne olursa olsun DIV istihdam elde edilebilir.
    1. Her iyi için bir 12-kuyu plaka, seyreltme 1,5 μg Plasmid ile ilgili yapı içeren 100 μL yeni nörobasal medya içinde B27 veya glutamin takviyesi olmadan bir mikrosantrifüjden tüp ve karışımı ile hızlı bir şekilde vortekslenir.
      Not: Başarılı transfeksiyon için, kullanılan nörobazal medyanın mümkün olduğunca taze, şişe açıldıktan sonra 1 haftadan daha az olması önemlidir.
    2. İkinci bir mikrosantrifüj tüpte, 100 μL 'de uygun bir lipofeksiyon reakajının 1 μL değerini taze nörobazal medya ile karıştırın ve nazikçe karıştırın.
      Not: Lipofeksiyon reakajının karışımına girdap yapmayın. Taze lipofeksiyon reaktiflerin kullanımı transfeksiyon verimliliğini artırabilir.
    3. Tüplerin oda sıcaklığında (RT) 5 dakika süreyle inküytir.
    4. DNA karışımı için lipofection reaktif karışımı dropwise ekleyin, hafifçe karıştırın ve RT 20 dakika boyunca inküye.
    5. Ortamın hacmini her iyi 1 mL 'ye kadar ayarlanabilir medya olarak ayarlayın.
    6. Lipofection reakajı ekleyin-DNA karışımı kuymaya dropwise.
    7. Hücreleri inkükule dönün ve protein ifadesi için en az 3 – 4 gün izin verin.
      Not: Aşağıda özetlenen ınterevalizasyon ve geri dönüşüm protokollerinin amaçları için, hipokampal nöronlar DIV11 – 12 ' de transfidat edildi ve DIV15 – 16 ' da görüntülenmiş, GluN2B ' de GFP ile etiketlenen (GFP-GluN2B)
  3. OPSIYONEL: sabitlenme kadar, şartlý medyada ilaçlar (kronik veya acutely) ile hücrelerin Inkübasyon.
    Not:     akut tedavi için, etiketleme öncesinde hücreleri tedavi etmeye başlayın. Kullanılan ilaç tedavi protokolüne bağlı olarak, hücreler Bölüm 2 ' de ilaç içeren medyada muhafaza edilebilir. Bizim örneğimizde, DIV21 hücreler yüzey ifade AMPAR9artırmak Için bir cltp protokolüne tabi.
    1. Ekstrellüler çözüm (ECS) için Döviz şartında medya.
    2. RT 'de 3 dakika boyunca ECS 'de 300 μM gcine ile hücreleri tedavi edin. Bir kontrol olarak, ECS ile bir kardeş lamel magazini tedavi (glisiye olmadan).
    3. 37 °C ECS ile hücreleri 3x yıkayın ve Bölüm 2 ile devam etmeden önce 20 dakika boyunca hücre kuluçkan (Glycine olmadan) ECS hücreleri döndürür.
      Not: ECS (mm cinsinden): 150 NaCl, 2 CAcl2, 5 KCl, 10 HEPES, 30 GLIKOZ, 0,001 TTX, 0,01 Strychnine, ve 0,03 picrotoksin pH 7,4.

2. yüzey etiketleme canlı-ifade reseptörleri

  1. Etiketleme için coverfiş hazırlamak
    1. Reaktifler kaydetmek ve manipülasyon kolaylaştırmak için, Transfer Cover, hücre tarafı kadar bir parafin film kaplı tepsi.
      Not: Numunelerin kurumasına asla izin vermek önemlidir.
    2. 37 °C ' de inkübasyon ve yıkama basamakları için şartlama ortamını kaydedin ve koruyun.
      Not: 18 mm 'lik coverslip için, antikor etiketleme için 75 – 100 μL medyaya sahip inkübasyon ve ıntermerasyon/geri dönüşüm için 120 – 150 μL önerilir.
  2. Primer antikor ile yüzey reseptörlerinin etiketlenmesi
    1. RT 'de 15 dakika boyunca, şartların bulunduğu ortamlarda seyreltilmiş primer antikor hücrelerine sahip hücreler.
      Not: GFP-Tagged reseptörleri için, 1:1000 bir seyreltme tavşan Anti-GFP antikor kullanıldı. Endojen GluA1 için, fare Anti-GluA1 bir 1:200 seyreltme kullanılmıştır.
    2. Bir vakum pipet kullanarak antikor içeren medyayı dikkatle Aspire ve hücrelerle üç kez yıkayın.
      Not: Şartlanmış medya kullanılamıyorsa, tüm yıkama adımları 1 mM MgCl2 ve 0,1 mm CAcl2] içeren PBS + [fosfat TAMPONLU tuz (PBS) kullanılarak gerçekleştirilebilir. Yumuşak vakum aspirasyonu mevcut değilse bir mikropipet kullanarak manuel aspirasyon yapılabilir.

3. yüzey Ifadesi (Şekil 2)

  1. Yüzey-ifade reseptörleri ikincil antikor etiketleme
    1. PBS + ile bir kez yıkayın.
    2. % 4 paraformaldehit (PFA) ve 7 ila 8 dakika PBS 'de% 4 sukroz ile inküperasyon hücreleri düzeltin.
      Not: Metanol inkübasyon gibi diğer sabitleme yöntemlerinin aksine, PFA plazma membranı geçirmez ve bu nedenle yüzey ifade analizi için uygundur. Optimum sonuçlar için taze hazırlanmış PFA kullanın. PFA 'nın 4 °C ' de veya uzun süreli (30 gün kadar) depolama alanı-20 °C ' de kısa süreli depolanması, yeterli sabitleme için uygundur.
      Dikkat: PFA bilinen bir kanserojen olduğunu. Kullanım sırasında uygun kişisel koruyucu ekipman ve güvenlik kapağı kullanın.
    3. Hücreleri normal PBS ile üç kez yıkayın.
      Not: Alternatif olarak, 0,1 M gcine, PBS yerine PFA yıkamak için kullanılabilir, çünkü glisin hazırlanmasında arka plan artırabilir herhangi bir geri kalan fikfatif giderecek.
    4. RT 'de 30 dakika boyunca PBS 'de% 10 normal keçi serumu (NGS) ile inkükleme yaparak nonspesifik bağlayıcı siteleri engelleyin.
      Not: Engelleme süresi etiketleme üzerinde olumsuz etkileri olmadan uzatılabilir.
    5. Primer antikor etiketli reseptörlere (örn. yüzey ifade) etiket eklemek için PBS 'de% 3 NGS 'de% 1 h olarak floresan etiketli ikincil antikor ile inküye yapın.
      Not: Bu örneklerde, Alexa 555-konjuze ikincil antikorların bir 1:500 seyreltme: GFP etiketli reseptörleri için keçi Anti-tavşan ve GluA1 için keçi Anti-Mouse kullanıldı.
    6. Hücreleri PBS 3x ile yıkayın.
  2. Hücre içi reseptörlerin etiketlenmesi
    1. PBS 'de% 0,25 Triton X-100 ile hücreleri RT 'de 5 – 10 dakika boyunca geçirgen.
      Not: Antikor etiketleme ilk turda tüm yüzey epitopes kaplar kontrol etmek için, bu geçirgen adım bir kardeş kültüründe atılabilir. Bu durumda, hücre içi reseptörleri için hiçbir sinyal elde edilmelidir. Ayrıca, önceki bölüm 2 ' de hiçbir iç reseptörlerin etiketlenmemiş olduğunu kontrol etmek için (yani, kültürde plazma membranlarının bütünlüğünü gösteren), bir kardeş kültüründe geçirgen adım atılabilir ve bir ana antikor hücre içi protein (örn., PSD-95 veya MAP2) adım 2.2.1 ' de kullanılabilir. Bu koşullar altında bu birincil gelen sinyal alınamıyor. Bu durumda, bir tavşan Anti-PSD-95 antikor (1:500) kullanıldı.
    2. RT 'de 30 dakika boyunca PBS 'de% 10 NGS ile engelle.
    3. Etiket hücre içi reseptörleri, 1 h RT 'de PBS 'de% 3 NGS 'de seyreltilmiş, Bölüm 2,2 kullanılan aynı primer antikor ile geçirgenleştirilmiş hücreleri inküt ederek.
      Not: Hücre içi reseptörleri etiketleme için antikor seyreltme yüzey ifade reseptörleri etiketleme için gerekli olandan farklı olabilir. GluA1 örneğinde aynı antikor seyreltme (1:200) kullanılmıştır.
    4. Hücreleri 3x PBS ile yıkayın.
    5. İkinci floresan etiketli ikincil antikor ile etiket, RT 'de 1 h için PBS 'de% 3 NGS 'de seyreltilmiş.
      Not: Bu örneklerde, keçi Anti-fare Alexa 647-konjudi ikincil antikor (GluA1 için) bir 1:500 seyreltme kullanıldı.
    6. Hücreleri 3x PBS ile yıkayın.

4. ınterilasyon (Şekil 3)

  1. Antikor etiketli yüzey reseptörlerinin içselleştirilmesi
    1. Yüzey-ifade reseptörleri ve antikor yıkama (Bölüm 2,2) etiketlemeden sonra, antikor olmadan şartsız medyada hücreleri korumak ve inkübe (37 °C) geri atıkları için izin vermek.
      Not: NMDA reseptörleri için, 30 dk. Bir kontrol olarak, bir kız kardeş kültürü, staj sürecinde 4 °C ' de şartla medya ile korunabilir. Bu koşullarda minimal reseptör ıntertralization gerçekleşmelidir.
  2. Yüzey reseptörlerinin etiketlenmesi
    1. PBS + ile bir kez hücreleri yıkayın.
    2. PBS 'de% 4 PFA ve% 4 sukroz olan hücreleri 7 – 8 dakika boyunca düzeltin.
      Dikkat: PFA 'yı ele aldığınızda uygun kişisel koruyucu ekipman ve güvenlik kapağı kullanın.
    3. Normal PBS ile 3x hücreleri yıkayın.
    4. PBS 'de% 10 NGS ile Block, nonspesifik bağlayıcılığı önlemek için 30 dk.
    5. Primer antikor etiketli reseptörlerin etiketlenmesi için PBS 'de% 3 NGS 'de 1 h olarak seyreltilmiş floresan etiketli ikincil antikor ile numuneleri inkük (örn.
      Not: Bu örnekte, Alexa 555-Conjugated keçi Anti-tavşan ikincil antikor (1:500) etiketleme için kullanıldı.
    6. Hücreleri 3x PBS ile yıkayın.
  3. Interselleştirilmiş reseptörlerin etiketleme
    1. PBS 'de% 0,25 Triton X-100 ile hücreleri 5 – 10 dakika boyunca geçirgen.
    2. RT 'de 30 dakika boyunca PBS 'de% 10 NGS ile inkübasyon ile nonspesifik bağlayıcılığı engelleyin.
    3. Örneklenmiş antikor etiketli reseptörlerin etiketlenmesi için RT 'de 1 h için PBS 'de% 3 NGS 'de seyreltilmiş floresan etiketli ikincil antikor ile numuneleri kulbin.
      Not: Bu örnekte, Alexa 647-Conjugated keçi Anti-tavşan ikincil antikor (1:500) etiketleme için kullanılır.
    4. Hücreleri 3x PBS ile yıkayın.

5. geri dönüşüm (Şekil 4)

  1. Antikor etiketli yüzey reseptörlerinin içselleştirilmesi
    1. Yüzey-ifade reseptörleri ve antikor yıkama (Bölüm 2,2) etiketlemeden sonra, antikor olmadan şartsız medyada hücreleri korumak ve inkübe (37 °C) geri atıkları için izin vermek.
      Not: NMDA reseptörleri için, 30 dk.
  2. İstikrarlı yüzey bloke reseptörleri ifade
    1. Birincil antikor üzerinde epitopları engellemek için yüzey bağlı-inküslenmemiş reseptörleri ifade, bilirubinin fab Anti-IgG (H + L) antikor parçaları ile hücreleri kuluzlar (Bölüm 2,2 kullanılan birincil karşı) şartsız medyada seyreltilmiş ( 20 μg/mL) RT 'de 20 dk. Bu tedavi ikincil antikorlarla gelecekteki etkileşimi önler.
      Not: Bu örnekte, keçi Anti-tavşan fab parçaları kullanıldı.
      Not: Kontrol deneyi: yüzeyi ifade eden reseptörlerin tam olarak engellendiğinden emin olmak için, kardeş coverfları fab olmadan ve birlikte inkübe edilebilir. Kültürler fab tedavisinden hemen sonra düzeltilmelidir ve her iki kültür Alexa 555-konjued ikincil antikor ile inkübe edilir. Hiçbir Alexa 555 fab-inkübe hücrelerinde sinyal uygun antikor engelleme gösterir.
    2. 3x hücreleri, Klima ortamıyla yıkayın.
    3. 80 μM dynasore içeren ve daha fazla inküvatör (37 ° c) ' ye geri dönüşlerini önlemek için, ıntereralize reseptörlerin geri dönüşümüne izin vermek üzere hücreler, Dynasore, Dynamin 'i inhibe eden ve bu nedenle ınferalizasyonu engelleyen bir GTPase inhibitörü.
      Not: 45 MIN NMDAR geri dönüşümü için tavsiye edilir. Dynasore 'un Dynamin 'e bağımlı olan (örneğin, NMDARs) Ancak, diğer sinaptik protein (Dynamin-bağımsız), Disseleştirme hala Dynasore varlığında ortaya çıkabilir.
  3. Geri dönüşümlü reseptörlerin etiketleme
    1. PBS + ile bir kez hücreleri yıkayın.
    2. PBS 'de% 4 PFA ve% 4 sukroz olan hücreleri 7 – 8 dakika boyunca düzeltin.
      Dikkat: PFA 'yı ele aldığınızda uygun kişisel koruyucu ekipman ve güvenlik kapağı kullanın.
    3. Hücreleri 3x PBS ile yıkayın.
    4. PBS 'de% 10 NGS ile Block, nonspesifik bağlayıcılığı önlemek için 30 dk.
    5. İlk floresan etiketli ikincil antikor ile etiket hücreleri, RT 'de 1 h için PBS 'de% 3 NGS 'de seyreltilir.
      Not: Bu örnekte, Alexa 555-Conjugated keçi Anti-tavşan antikor (1:500) etiketleme için kullanıldı.
    6. Hücreleri 3x PBS ile yıkayın.
      Not: PBS (5 – 10 dk) ile daha uzun yıkanabilir preparat arka plan azaltmak için yardımcı olabilir.
  4. Interselleştirilmiş reseptörlerin etiketleme
    1. PBS 'de% 0,25 Triton X-100 ile hücreleri 5 – 10 dakika boyunca geçirgen.
    2. RT 'de 30 dakika boyunca PBS 'de% 10 NGS ile engelle.
    3. İkinci floresan etiketli ikincil antikor ile etiket, RT 'de 1 h için PBS 'de% 3 NGS 'de seyreltilmiş.
      Not: Bu örnekte, Alexa 647-Conjugated keçi Anti-tavşan antikor (1:500) etiketleme için kullanıldı.
    4. Hücreleri 3x PBS ile yıkayın.

6. numunelerin montajı ve görüntülenmesi

  1. Cover kuponları hücre tarafını yavaşça 12 – 15 mL 'ye uygun montaj ortamına yerleştirerek hücreleri bağlayın.
    Not: Aşırı montaj ortamının aspirasyonu görüntülerin kalitesini artıracaktır.
  2. Uygun bir Konfokal mikroskop üzerinde görüntü hücreleri.
    Not: 0,35 μm basamaklarla 60x büyümede z-yığını görüntü için tavsiye edilir, nöronun tüm kalınlığını kapsayan.

7. zaman hususlar

  1. Bu, çeşitli noktalarda durdurulabilir uzun bir protokoldür. İstenirse, nemli bir odada bir gecede 4 °C ' de engelleme ve primer antikor inkübasyon adımlarını gerçekleştirin.
  2. Alternatif olarak, istenirse, büyük ölçüde sonrası sabitleme kuluçlan süreleri hızlandırmak için bir mikrodalga doku işlemci kullanın. Tüm adımlar için, "on" ayarları için 30 °C ' de W 150 kullanın.
    1. Engellemek için 2 dk "açık", 1 dk "kapalı" ve 2 dk "açık" işlemciyi çalıştırın.
    2. Primer ve ikincil antikor inkübasyon adımları için, 3 dk "açık", 2 dk "kapalı" ve 3 dk "on" işlemci çalıştırın.
      Not: Biz protokole yukarıdaki değişiklikleri yaparak kalite hiçbir fark gözlemlemek.

8. görüntü analizi

  1. Birden çok dosya formatı ile uyumlu olduğu için, resim analizi yapmak için FIJI < https:/fıji.SC/> kullanmanız önerilir. Verilerimiz için, Nikon ND2 dosya formatında görüntüler elde edildi.
  2. FIJI tarafından önceden seçilmiş farklı parametrelerin kolay toplu ölçülmesini sağlamak için bir makro komut dosyası sağlanır. Aşağıdaki adımlar makroda yer alır:
    Not: Bu örnekler için "entegre yoğunluk" ölçülmüştür.
  3. FIJI ve ayrı kanallar görüntü dosyalarını açın.
  4. Z-her kanal yığınını maksimum yoğunluk projeksiyon olarak proje.
  5. Her kanal için daha düşük bir eşik ayarlayın.
    Not: Eşikleri her deneysel veri kümesi için ampirik olarak belirlenmelidir. Her kanal ayrı bir alt eşik değerine sahip olsa da, kanal eşik değerlerinin aynı veri kümesinin tüm görüntüleri için tutarlı bir şekilde korunduğu önemlidir.
  6. Üç ila beş ikincil veya üçüncül dendritler seçin ve ilgi bölgeleri (roıs) olarak kaydedin.
  7. Yüzey ve hücre içi kanallarda her YG 'nin entegre yoğunluğunu ölçün.
  8. Yüzey kanalının Tümleşik yoğunluk değerini hücre içi kanalla bölerek her YG için sinyali normalleştirin.
  9. Tüm kontrol ve deneysel görüntüler için ölçümleri tekrarlayın ve değerleri kontrol etmek için deneysel değerleri normalleştirmek (örn. GluN2B WT veya No-Glycine koşulları).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Glutamat reseptör kaçakçılığı incelemek için bu protokol hücre yüzeyinde ifade reseptörleri diferansiyel etiketleme dayanmaktadır ve bu iç membranlarda ifade. Ayrım önce ve membran geçirmezlik sonra reseptörleri etiketleme tarafından elde edilir, aynı primer antikor ancak farklı bir fluorophore konjuate ikincil bir antikor kullanarak. Protokol dahil isteğe bağlı adımlarla özetlendiği gibi, bu, farklı reseptör kaçakçılığı süreçleri sorgulamak için çok yönlü bir yöntemdir, gibi idarlaştırma...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bir hücre ile çevre arasındaki etkileşim (örn. diğer hücrelerle iletişim, farklı uyaranlara yanıt vb.), hücre yüzeyinde reseptörlerin doğru ifadesine ağır dayanır. Yüzeydeki hızlı ve ince ayarlı düzenleme reseptör içeriği sürekli değişen bir ortama uygun hücresel yanıt sağlar. Nöronlar belirli durumda, sayı, yerelleştirme ve synaptically ifade reseptörlerinin alt bileşiminde değişiklikler ağır sinaptik iletişim etkiler, sinaptik plastisite, synaptogenit, ve sinaptik budama3,

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Teşekkürler

Nikon a1 Confocal mikroskop ve deneyler planlama ve analiz yardım onların kullanımı için Northwestern gelişmiş Microkopi merkezi teşekkür ederiz. Bu araştırma (T32GM008061) (A. M. C), ve NIA (R00AG041225) ve Brain & davranış Araştırma Vakfı (#24133) (A. S.-C.) bir NARSAD genç araştırmacı Grant tarafından desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
18 mm çap # 1.5 kalın gözlükNeuvitroGG181.5
Alexa 555 konjuge keçi anti-fare ikincilYaşam TeknolojileriA21424
Alexa 555 konjuge keçi anti-tavşan ikincilYaşam TeknolojileriA21429
Alexa 647-konjuge keçi anti-fare ikincilYaşam TeknolojileriA21236
Alexa 647-konjuge keçi anti-tavşan ikincilYaşam TeknolojileriA21245
B27Gibco17504044
CaCl2SigmaC7902
Corning Costar Düz Tabanlı Hücre Kültürü PlakalarıCorning3513
DynasoreTocris2897
GlikozSigmaG8270
GlisinTocris0219
Keçi anti-tavşan Fab parçalarıSigmaSAB3700970
HEPESSigmaH7006
KClSigmaP9541
L-GlutaminSigmaG7513
Lipofektamin 2000Invitrogen11668019
Fare anti-GluA1 antikoruMilliporeMAB2263
NaClSigmaS6546
Nörobazal MedyaGibco21103049
NGSAbcamAb7481
ParafilmBemisPM999
PBSGibco10010023
Pelco BioWaveTed Pella36500
PFAAlfa Aesar43368
PikrotoksinTocris1128
Poli-D-lizin hidrobromürSigmaP7280
ProLong Altın Antifade MountantYaşam TeknolojileriP36934
Tavşan anti-GFP antikoruInvitrogenA11122
Tavşan anti-PSD-95 antikoruHücre Sinyali2507
StrikninTocris2785
SükrozSigmaS0389
Superfrost plus mikroskop slaytlarıFisher12-550-15
Triton X-100SigmaX100
TTXTocris1078

Kaynaklar

  1. Enns, C. Overview of protein trafficking in the secretory and endocytic pathways. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 15, Unit 15 11 (2001).
  2. Bedford, F. K. Encyclopedia of Neuroscience. Binder, M. D., Hirokawa, N., Windhorst, U. , Springer Berlin Heidelberg. 3385-3389 (2009).
  3. Diering, G. H., Huganir, R. L. The AMPA Receptor Code of Synaptic Plasticity. Neuron. 100 (2), 314-329 (2018).
  4. Lussier, M. P., Sanz-Clemente, A., Roche, K. W. Dynamic Regulation of N-Methyl-d-aspartate (NMDA) and alpha-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic Acid (AMPA) Receptors by Posttranslational Modifications. The Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28596-28603 (2015).
  5. Traynelis, S. F., et al. Glutamate receptor ion channels: structure, regulation, and function. Pharmacological Reviews. 62 (3), 405-496 (2010).
  6. Molnar, E. Long-term potentiation in cultured hippocampal neurons. Seminars in Cell & Developmental Biology. 22 (5), 506-513 (2011).
  7. Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
  8. Nunez, J. Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats. Journal of Visualized Experiments. (19), (2008).
  9. Lu, W., et al. Activation of synaptic NMDA receptors induces membrane insertion of new AMPA receptors and LTP in cultured hippocampal neurons. Neuron. 29 (1), 243-254 (2001).
  10. Sanz-Clemente, A., Nicoll, R. A., Roche, K. W. Diversity in NMDA Receptor Composition: Many Regulators, Many Consequences. The Neuroscientist: A Review Journal Bringing Neurobiology, Neurology and Psychiatry. 19 (1), 62-75 (2013).
  11. Tham, D. K. L., Moukhles, H. Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation. Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).
  12. Bermejo, M. K., Milenkovic, M., Salahpour, A., Ramsey, A. J. Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient. Journal of Visualized Experiments. (91), e51896(2014).
  13. Makino, H., Malinow, R. AMPA receptor incorporation into synapses during LTP: the role of lateral movement and exocytosis. Neuron. 64 (3), 381-390 (2009).
  14. Bailey, D. M., Kovtun, O., Rosenthal, S. J. Antibody-Conjugated Single Quantum Dot Tracking of Membrane Neurotransmitter Transporters in Primary Neuronal Cultures. Methods in Molecular Biology. 1570, 165-177 (2017).
  15. Trussell, L. Recording and analyzing synaptic currents and synaptic potentials. Current Protocols in Neuroscience. Chapter 6, Unit. , Chapter 6, Unit 6 10 (2001).
  16. Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM. Journal of Visualized Experiments. (23), e1067(2009).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Disosiye Hipokampal KültürlerYüzey Reseptörü İşaretlemeReseptör İnternalizasyonuReseptör Geri DönüşümüKonfokal Mikroskopi GörüntülemePrimer Antikor İnkübasyonuFab Bloklama ProtokolüPFA Fiksasyon Yöntemi
Disanated primer hipokampal kültürlerde glutamat reseptör kaçakçılığı çalışması için antikor beslenme yaklaşımı
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.