Yöntem makalesi

Otoimmün Diyabet Modelinde Fonksiyonel Testler için Antijene Özgü Primer Fare Sitotoksik T Hücrelerinin Yüksek Verimli Üretimi

DOI:

10.3791/59985

⸱

16 Ağustos 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Barbara Davis Center for Childhood Diabetes, University of Colorado Denver, 2Department of Medicine, Endocrinology, Diabetes & Metabolism, Baylor College of Medicine, 3Scientific Center, Shandong Provincial Hospital affiliated to Shandong University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makalede, in vitro ve in vivo kullanılmak üzere fonksiyonel T hücrelerinin yüksek sayıda verim amacı ile, antijene özgü CD8 T hücrelerinin üretimi ve bunların in vitro genişlemesi için bir protokol açıklanmaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tip 1 Diyabet (T1D) beta hücre yıkımı ve insülin üretiminin mutlak kaybına yol açan adacık spesifik otoimmünite ile karakterizedir. Spontan obez olmayan diyabet (NOD) fare modelinde, insülin birincil hedeftir ve tek bir anahtar insülin epitop kaldırmak için bu hayvanların genetik manipülasyon hastalığı önler. Bu nedenle, bu patojenik epitop taşıyan profesyonel antijen sunan hücrelerin seçici ortadan kaldırılması (AKO'lar) istenmeyen insülin spesifik otoimmün yanıtları inhibe etmek için bir yaklaşımdır, ve büyük olasılıkla daha büyük çeviri potansiyeline sahiptir.

Şimerik antijen reseptörleri (CAR) seçici hastalık neden antijenleri hedef T hücreleri yönlendirebilirsiniz. Bu teknik, birden fazla kanser tedavisinde benimseyen hücre tedavisi için hücresel mühendislik kullanmak için son girişimleri için temeldir. Bu protokolde, düşük sayıda naif hücreden başlayarak yüksek sayıda fonksiyonel antijene özgü CD8 CAR-T hücresi üreten optimize edilmiş bir T-hücre retrovirüsü (RV) transdüksiyonu ve in vitro genleşme protokolünü açıklıyoruz. Daha önce birden fazla CAR-T hücre protokolü tanımlanmıştır, ancak genellikle transdüksiyon sonrası nispeten düşük transdüksiyon verimliliği ve hücre canlılığı ile. Buna karşılık, protokolümüz %90'a kadar transdüksiyon verimliliği sağlar ve üretilen hücreler iki haftadan fazla invivo hayatta kalabilir ve tek bir infüzyon dan sonra hastalığı önemli ölçüde geciktirebilir. Kritik adımların kolayca izleilebilmeleri için hücre bakım ve transdüksiyon protokolünün ayrıntılı bir açıklamasını salıyoruz. Birincil hücre yalıtımından CAR ifadesine kadar tüm işlem 14 gün içinde gerçekleştirilebilir. Genel yöntem, hedefin bilindiği herhangi bir fare hastalığı modeline uygulanabilir. Benzer şekilde, spesifik uygulama (patojenik peptid/MHC sınıf II kompleksini hedeflemek) önemli bir kompleksin tanımlandığı diğer otoimmün hastalık modelleri için de geçerlidir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İstenmeyen hedef dışı etkilerin olası azaltılmış risk göz önüne alındığında, antijene özgü immün tedaviler (ASI) T1D gibi otoimmün hastalıklar için umut verici tedaviler vardır. Kanıt birikmesi( prepro)insülin immün yanıtların T1D 1'de özellikle önemli olabileceğini düşündürmektedir. Son on yılda, bizimki de dahil olmak üzere birden fazla gruptan yapılan çalışmalar, belirli MHC sınıf II molekülleri (B:9-23/MHCII) tarafından 9 ila 23 arasında insülin B zinciri amino asitleriçeren bir epitopun sunumunun T1D'nin gelişiminde önemli bir rol oynadığını kuvvetle göstermektedir. fareler ve insanlar2,3,4,5. Seçici B:9-23/MHCII kompleksi hedef için, biz bir monoklonal antikor üretti, mAb287 adlı, hormon insülin veya kompleksleri diğer peptidler içeren çapraz reaktivite vardır6. MAb287 bloklar antijen sunum in vitro, ve pre-diyabetik NOD fareler için mAb287 haftalık uygulama tedavi farelerin% 35 T1D gelişimini geciktirdi6. In vivo antijen sunumengellemek için, sık enjeksiyonları genellikle yüksek sirkülasyon konsantrasyonu korumak için gereklidir. Biz t hücreleri yeniden programlamak için Ab287 yüksek özgüllük yararlanarak bu zorluğun üstesinden gelebilir hipotez, böylece T1D için geliştirilmiş bir antijen-spesifik T hücre tedavisi sağlayan7.

Sitotoksik T hücrelerinin biliş likörlerinin tek bir kopyası bile8,9,10olarak ifade edilirse hedeflerini öldürebildiği bildirilir. Böylece, B:9-23/MHCII spesifik CD8 T hücrelerinin, etkisini uygulamak için aynı APC'de birden fazla komplekse bağlanması gereken ana antikordan daha istenmeyen antijen sunumunu ortadan kaldırmada daha yüksek verimliliğe sahip olması beklenmektedir. CAR T hücreleri birden fazla insan kanseri tedavisinde kullanılmıştır11,12,13, ve aynı zamanda otoimmünite etkili olabilir14. Ancak, patojenik peptid-MHC kompleksleri için özgüllüğü olan CAR-T hücreleri şimdiye kadar T1D ilerlemesini değiştirmek için kullanılmamıştır. Aşağıda açıklanan en iyi şekilde optimize edilmiş CD8 T hücre transdüksiyon tekniğini kullanarak, son zamanlarda bunun gerçekten uygulanabilir bir yaklaşımı temsil ettiğini nispatinin kanıtını gösterdik7.

Bu protokolde, verimli ve modern bir transdüksiyon ve genişletme yöntemini özetliyoruz. Protokolümüz yüksek verimlilikte fare CD8 CAR T hücrelerinin oluşumunu gerektiren diğer çalışmalar için geçerlidir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fareler transgenik fare tesisinde belirli patojensiz koşullar altında muhafaza edildi ve tüm hayvan deneyleri Baylor Tıp Fakültesi hayvan bakım ve kullanım komitesi tarafından onaylanan protokollere uygun olarak yapıldı.

NOT: Deney, virüs ve T hücrelerinin paralel olarak hazırlanmasını gerektirir. Tablo 1 protokolü özetler. Anahtar reaktifler ve arabellekler MalzemelerTablosunda listelenir. Bu protokoldeki belirli ADC popülasyonlarını hedefleyen CAR-T hücrelerinin üretimi ve genişlemesi üzerinde odaklanıyoruz.

1. Nesil ve tek zincir Fab antikor (scFab)-CARs doğrulama.

NOT: CARs genellikle 3 kritik etki alanı içerir-bir antijen hedefleme etki alanı, bir spacer / transmembran etki alanı ve bir sitoplazmik sinyal etki alanı. Her OTOMOBILIN kesin tasarımı amaçlanan hedefe bağlıdır ve bu nedenle, retrovirüs üretimiyle ilgili yapının temel özelliklerinin dışında, bu protokolde ayrıntılı olarak açıklanmayacaktır. Aşağıda açıklanan çalışmalarda kullanılan CAR'lerin genel tasarımı Şekil1'de gösterilmiştir. Kısacası, hedefleme etki alanı, yarı-rijit bir bağlayıcı ile birbirine bağlanan üst monoklonal antikordan ağır zincirin tüm hafif zincir ve değişken ve CH1 etki alanını kapsar. Spacer/transmembran etki alanı fare CD28'den, sinyal etki alanı ise CD28, CD137 (4-1BB) ve CD247'den (CD30) elemanlar içeren bir füzyondur. Bu elementler, splice örtüşen polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) veya uygun bir "gen bloğu" sentezi gibi standart moleküler biyoloji prosedürleri ile birleştirilir. mAB287 CAR üretimi ayrıntıları Zhang ve ark.7yer almaktadır. CDNA dizileri istek üzerine yazarlardan alınabilir.

  1. ARAÇ yapısının montajı
    1. Hedefleme tek zincir Fab antikor (scFab) ve kombine spacer/sinyal etki alanlarını ayrı ayrı sentezle ve son yapıyı birleştirmek için"3 noktalı" ligasyon tekniği15 kullanın (Şekil 1).
      NOT: ARAÇ inserti için temel gereksinim, retroviral ekspresyon vektörü pMSCV-IRES-GFP II (pMIG II) içine ligasyon sağlayan yan kısıtlama ensoneklease siteleri içermelidir veya ilgili türev15 de vardır Uygun.
  2. ARAÇ yüzey ifadesinin doğrulanması
    1. Standart bir protokol tarafından oluşturulan pMIG II kaynaklı retroviral partikülleri kullanarak hibridoma hücrelerinin aktarılması (örneğin, Holst ve ark.16).
    2. CAR vektör17 GFP ifadesini algılamak için akışsitometri analizi çalıştırın.
    3. Fare κ zincirine karşı etiketli antikorlar kullanarak transdükssonucu hibridomların CAR leke yüzey ekspresyonu (örneğin, klon RMK-45)17.
      NOT: 18.
  3. CAR özgüllüğünün doğrulanması
    1. Uygun plaka bağlı veya hücresel antijenler ile transdükse hibridoma hücreleri uyarmak. Bir gecede co-kültür supernatants ve salgılanan sitokinler toplamak sonra, ve enzim bağlı immünosorbent tsay tarafından titretilir (ELISA)7.
      NOT: İdeal olarak, her ARAÇ transdüksiyon için kullanılmadan önce bağımsız olarak doğrulanmalıdır. Bu adımda, deneme duraklatılmış ve daha sonra yeniden başlatılabilir.

2. Viral üretici hücrelerinin transfeksiyonu (gün -4 gün 3)

NOT: Retrovirüs Phoenix-ECO hücreleri kullanılarak üretilir (Bkz. Malzemeler Tablosu)19,20. Potansiyel olarak enfeksiyöz ajanların üretimi için uygun önlemleri alın (tercihen belirlenmiş bir BSL-2 kabinesi ve transfektörlü/transdükse hücrelerin kültüre alınması için ayrı kuvöz dahil).

  1. Zümrüdüanka hücrelerini eritme (Gün -4)
    1. Çözülme 2 x 106 Phoenix-Eco hücreleri. Birden fazla transdüksiyon planlanıyorsa Phoenix hücrelerinin sayısını ölçeklendirin.
    2. 10 cm'lik bir doku kültür kabına 10 mL orta (Dulbecco'nun modifiye Kartal ortası (DMEM) içeren %10 fetal baldır serumu (FCS)) ile kaplayın.
  2. Passage Phoenix hücreleri (Gün -3)
    1. Orta yıkın ve 5 mL Dulbecco fosfat tamponlu salin (DPBS) ile yıkayın.
    2. 3 dakika boyunca %0,25 tripsin ve 37 °C'de %10 CO2 atmosferin altında kuluçkaya yatırın.
    3. Hasat hücreleri daha sonra 200 x g3 dk için santrifüj tarafından pelet . 10 mL taze orta ve 37 °C'de kuluçkaya yatan hücreleri yeniden plakalayın.
  3. Phoenix hücrelerinin Işınlama (Gün -1 öğledensonra)
    1. Daha fazla hücre bölünmesini en aza indirmek için, adım 2.2'de açıklandığı gibi Phoenix hücrelerini toplayın, 5 mL orta alanda yeniden askıya alın ve buzdaki hücreleri ışınlayın (1000 rad).
      NOT: Personelmaruziyetini önlemek için radyasyon çalışmalarında dikkatli olunmalıdır.
    2. Isınıyan hücreleri santrifüj edin, taze ortamda yeniden askıya alın, 2 x 106 hücrede plaka (10 mL orta/CAR'da) ve kuluçka.
  4. Transfeksiyon (Gün 0 - sabah)
    1. Phoenix hücrelerinden süpernatant aspirate, fosfat tamponlu salin 5 mL ile yıkayın (PBS), ve dikkatle azaltılmış serum orta 7 mL ekleyin (örneğin, Opti-MEM) tek katmanlı rahatsız önlemek için plakanın yanak damla. Hücreleri kuvöze aktarın.
    2. İki adet 14 mL yuvarlak alt polipropilen tüp alın ve her birine 1,5 mL azaltılmış serum ortası ekleyin. Bir tüpe 40 μL transfeksiyon reaktifi ekleyin (Bkz. MalzemelerTablosu).
    3. Diğer tüpe 15 g Ab-CAR-plazmid (adım 1'de üretilen) ve 5 g zarf ve ambalaj plazmidi (5 μg pCL-Eco) ekleyin. 5 dakika oda sıcaklığında tüpler inkübasyon.
    4. Transfeksiyon reaktif karışımını 2.4.2 adımdan tüp kenarlarına temas etmeden ikinci tüpe damla olarak ekleyin ve çözeltiyi 3 kez yukarı ve aşağı boruile karıştırarak karıştırın. En az 20 dakika oda sıcaklığında kuluçka.
    5. Phoenix hücrelerine damla akıllıca karışımın 3 mL ekleyin ve bir doku kültürü kuluçka yerleştirin.
    6. 4-5 saat sonra FCS 1 mL ekleyin. Kültür hücreleri bir gecede 37 °C'de.
  5. Orta değişim (Gün 1)
    1. Plazmid/transfeksiyon reaktif komplekslerini içeren süpernatantı çıkarın ve enfeksiyöz malzemenin taşınması için kurumsal prosedürlere uygun olarak atın. Hücrelere 4 mL taze, önceden ısıtılmış kültür ortamı ekleyin.
  6. Transdüksiyon için Hasat virüsü (Gün 2)
    1. Bir steril şırınga ile Phoenix hücrelerinden virüs içeren orta toplamak, filtre (0.45 μm) artık hücre enkaz kaldırmak için, ve yeni bir tüp toplamak.
    2. RhIL-2 stoğunu 200 IU/mL'lik son konsantrasyona ekleyin. Virüsü hemen transdüksiyon için kullanın (adım 5.3). Phoenix hücrelerine 4 mL taze orta ekleyin ve kuvözde yerleştirin.
  7. Virüs koleksiyonunu yineleme (Gün 3)
    1. Adım 2.6 tekrarlayın, ancak phoenix hücrelerini taze ortam eklemek yerine bulaşıcı atık olarak atın. Bu supernatant adım 5.4 kullanılır.

3. Birincil CD8 T hücre izolasyonu ve aktivasyonu (gün -1 gün 0)

NOT: Daha önce, 4-5 hafta kadın NOD farelerden CD8 T hücreleri toplamak, adacık iltihabı başlamadan önce bir zaman noktası21,22. IACUC onaylı protokolleri takip eden tüm fareleri ele alın. CD8 T hücreleri ticari negatif seçim kiti kullanılarak splenositlerden zenginleştirilmiştir.

  1. CD3/CD28 antikorlu kaplama plakaları (Gün -1)
    1. 24 kuyulu plakanın her kuyusuna fare karşıtlığı CD3 ve CD28 antikorlarının karışımından 1 mL (her ikisi de PBS'de 1 μg/mL) ekleyin ve bir gecede 4 °C'de kuluçkaya yatırın.
    2. Ertesi gün, murine CD8 T hücrelerini eklemeden önce plakaları 1 mL steril PBS ile 3 kez yıkayın (adım 4.1).
      NOT: Kaplanacak kuyu sayısı, gerekli toplam aktif CD8 T hücresi sayısına bağlı olarak her deney için değişir.
  2. Splenosit koleksiyonu (Gün 0)
    1. 4-5 haftalık iki NOD dişi farenin ökötemi, CO2 inhalasyonu ve ardından decapitation kullanılarak. Hasat dalak ve buz üzerinde bir hücre kültürü çanak 10 mL PBS sırılsıklam bir hücre süzgeci üzerine koyun.
    2. Bir hücre kültürü başlık, 3-5 adet halinde her dalak kesilmiş, dalak parçaları ayrı zorlamak ve hücrelerin tel örgü geçmesine izin vermek için 3 veya 5 mL şırınga steril bir piston ile dokulara basın.
    3. Splenositleri 1:4 seyreltilmiş kırmızı hücre lisis tamponunda (bir dalak için 3 mL PBS'de 1 mL lysis tamponu) yeniden sulandırarak ve oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatırarak kırmızı kan hücrelerini nazikçe çıkarın.
    4. Daha sonra, hemositometreile hücreleri saymak için trypan mavi boya çözeltisi ile hücre süspansiyonunun 10 μL'sini seyreltin ve 7 dk için 350 x g'de santrifüj ile hücrelerin geri kalanını peletleyin.
  3. CD8 T hücrelerinin zenginleşmesi (Gün 0)
    1. Üreticinin yönergelerini izleyerek, fare CD8 T hücre izolasyon kitini kullanarak CD8 T hücrelerini negatif seçimle zenginleştirin.
      NOT: Yüksek saflığın her zaman eklenecek biyotinylated-antikor hacmihesaplanırken hücre numaralarını yuvarlamasını sağlamak için (örneğin, hesaplanan 9.1 x 107 hücre için 108 hücre için önerilen reaktif hacmini kullanın).
    2. Hücre peletlerini 400 μL tampon ve 1 x 108 hücre başına 100 μL biotin-antikor kokteyli ile askıya alın, iyi karıştırın ve 5 dakika boyunca buzdolabında (4 °C) antikor bağlanmasını bekleyin.
    3. 1 x 108 hücre başına 300 μL etiketleme tamponu ve 200 μL anti-biotin mikro-boncuk ekleyin, iyi karıştırın ve 4 °C'de 10 dakika kuluçkaya yatırın.
    4. Mikro boncuk bağlamayı beklerken, ayırma sütununu ayırıcıya ayarlayın. 3 mL etiketleme arabelleği ile durulayarak sütunu yıkayın.
    5. Hücre agregalarını çıkarmak için ayırma sütununa yüklemeden önce 1000 μL boncuk/hücre karışımını 40 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirin. Önceden soğutulmuş 15 mL tüp içine sütun akışı toplamak.
    6. Tüm atıkları aynı tüpe toplayarak kolonu üreticinin talimatıyla yıkayın. Hücre numarasını (adım 3.2.4 ile aynı) belirleyin ve 5 dk için 350 x g'de santrifüj ile toplayın. Tam T hücre ortamının 2 mL'inde (FCS, 2-mercaptoethanol, rhIL-2 (200 U/mL), mIL-7 (0,5 ng/mL), ITS , HEPES ve penisilin-streptomisin) ve 5 dk için 350 x g santrifüj.
    7. Önceden ısıtılmış (37 °C) tam T hücre li ortasındaki hücreleri 0,25-0,5 x 10 6/mL konsantrasyonda yeniden askıya alın.

4. T hücre aktivasyonu (Gün 0-2)

  1. CD3/CD28 antikor kaplı 24 kuyulu plakanın3.1.2 adımdan kaplanmış her kuyuya hücre süspansiyonunun 2 mL'sini (0.25-0.5 x 10 6/mL) ekleyin. Hücreleri eşit dağıtmak için dönen bir hareket kullanın.
    NOT: Hücreleri eşit olarak dağıtmak ve kenar efektlerini en aza indirmek için dönen bir hareket kullanarak ekleyin. Hücreler kuyuların kenarı boyunca kümelenirse, hem transdüksiyon hızı hem de hücre canlılığı azalır.
  2. Bir kontrol olarak, plaka nın tek bir kaplamasız kuyu içine CD8 T hücreleri aynı sayıda plaka. Hücreleri 37 °C'de %10 CO2 gazlı inkübatör kullanarak 48 saat kuluçkaya yatırın.
    NOT: 48 saat sonra aktivasyon mikroskop kullanılarak doğrulanabilir; aktive hücreler anti-CD3/CD28 antikorları karşılaşmadı hücrelerden daha büyük olacaktır.

[yer şekil 2 burada]

5. Aktive CD8 T hücrelerinin transdüksiyonu (1-3 gün)

NOT: Bu protokol bir spin-transdüksiyon yöntemi kullanır. 37 °C'lik bir iç sıcaklığı koruyabilen bir salınımlı rotor ve doku kültürü plaka adaptörleri ile bir santrifüj gereklidir. Maksimum verimi sağlamak için, transdüksiyon gününde virüsü toplamadan önce santrifüjü 37 °C'ye ısıtın.

  1. Hazırlık insan fibronektin parçası kaplı plakalar (Gün 1 gün 2)
    1. 1. günde, 24 kuyulu bir plakanın kuyularına 0,5 mL fibronektin (PBS'de 50 g/mL) ekleyin ve gece boyunca 4 °C'de kuluçkaya yatırın.
      NOT: Tipik olarak, transfected Phoenix hücrelerinin plaka başına iki fibronektin kaplı kuyugereklidir.
    2. 2. günde fibronektin solüsyonu çıkarın ve PBS'de %2 büyükbaş serum albumininin (BSA) 1 mL'si ile değiştirin. 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübat "blok" non-spesifik bağlama siteleri.
    3. Tedavi edilen kuyuları 1 mL steril PBS ile yıkayın. Yıkama çözeltisi çıkardıktan sonra, plaka kullanıma hazırdır; veya 4 °C'de bir haftaya kadar mühürlenebilir ve saklanabilir.
  2. Aktif CD8 T hücrelerinin toplanması (Gün 2)
    1. Aktif CD8 T hücrelerini hasat edin, trypan mavisi veya uygun bir otomatik alet kullanarak hücre canlılığını sayın ve hesaplayın.
    2. Hücreleri santrifüj ile toplayın ve transdüksiyon için 5 x 106 canlı hücre/mL'de yeniden askıya alın. Transduced hücrelerin sonraki floresan aktif hücre sıralama için bir kontrol sağlamak için CO2 inkübatör tam T hücre orta kültür hücrelerinin küçük bir aliquot korumak (adım 6).
      NOT: 48 saat aktivasyondan sonra toplam hücre sayısı nın yaklaşık 1,5 kat artmış olması ve %95'ten fazla canlılığa sahip olması gerekir.
  3. Transdüksiyon (Gün 2)
    1. Fibronektin kaplı tablaya kuyu başına 100 μL aktif CD8 hücre süspansiyonu (0,5 x 106 hücre) ekleyin. Daha sonra her kuyuya virüs içeren ortam (adım 2,6'dan) 1,5-2 mL ekleyin. Hücreleri eşit olarak dağıtmak için dönen bir hareket kullanarak karıştırın (Şekil 2).
    2. Plakayı fermuarlı plastik bir torbaya yerleştirin ve mühürleyin (ikincil çevreleme sağlamak için). Santrifüj 2000 x g 90 dk için 37 °C'de.
    3. Plakayı santrifüjden çıkarın. Biyolojik güvenlikte, dolap plastik torbayı dikkatlice çıkarın ve plakanın dışının herhangi bir ortamla kirlenmediğinden emin olun.
    4. Daha sonra plakayı 37 °C CO2 kuluçka makinesine aktarın. 4 saat sonra, her kuyudan 1 mL orta çıkarın ve önceden ısıtılmış tam T hücreli orta 1 mL ile değiştirin. CO2 kuluçka makinesindeki plakayı değiştirin.
      NOT: Transekte edilen hücrelerden gelen tüm ortamları bulaşıcı atık olarak ele alın.
  4. İkinci transdüksiyon (Gün 3)
    1. Özel biyolojik güvenlik kabininde, kapak üzerinde durarak transdükse hücreleri içeren plakayı takın ve ortamın çoğunu dikkatlice çıkarın (100-200 μL bırakarak) kuyunun altındaki hücrelere temas etmemeyi unutmayın.
    2. Adım 2.7'de toplanan virüs içeren ortamı ekleyin ve 5.3.2-5.3.4 adımlarını yineleyin.
      NOT: Deneyimlerimize göre, üçüncü bir transdüksiyon nadiren genel verimliliği artırır. Buna ek olarak, üçüncü bir transdüksiyon kullanılırsa hücre canlılığı büyük olasılıkla önemli ölçüde düşecektir. Hücreler 0,5 x 10 6/well'dendaha yüksek bir konsantrasyonda kaplanırsa, T hücreleri ikinci transdüksiyon adımını takiben gece kuluçkadan sonra biraraya gelebilir. Bu durumda, 3.
  5. Yıkama hücreleri (Gün 4)
    1. Her kuyudan 1 mL orta çıkarın, kalan ortamdaki hücreleri yeniden askıya alın ve 15 mL'lik bir tüpe aktarın. Kuyuları 1 mL tam T hücreli orta ile yıkayın ve her transdüksiyondan havuzlanmış hücreleri içeren tüpe ekleyin.
    2. 7 dk için 350 x g santrifüj, sonra tam T hücreli orta ve peletleme 2 mL resuspend tarafından iki kez yıkayın. Son olarak 2 mL orta alanda yeniden askıya alın ve hücre numarasını belirleyin.
      NOT: 1 x 106 hücre ilk olarak transe edildiyse, bu aşamada verim ~3 x 106olmalıdır.
  6. Transfer
    1. 2 mL tam T hücreli ortamda 0.5-1 x 106 hücreden oluşan aliquotları 24 kuyulu yeni bir plakanın kuyularına aktarın ve 37 °C'de kuluçkaya yatırın. Yaklaşık 48-72 saat transdüksiyon sonrası hücreler CAR ifade analizi ve hücre sıralama için hazırdır.
      NOT: CAR-T hücrelerinin sayısı genellikle bu aşamada her 24 saat iki katına çıkar. Büyümelerine asla izin vermemek çok önemlidir. Yoğunluk 2 x 106/mL'den yüksekse (veya ortam parlak sarıya dönüşürse) hücreleri hemen bölün. Deneyimlerimize göre CAR-T hücreleri 24 kuyulu ve 12 kuyulu plakalarda daha büyük bir gemiye aktarılandan daha sağlam bir şekilde çoğalır.

6. Floresan aktive hücre sıralama (FACS) (gün 5 veya gün 6) tarafından transdükse hücrelerin saflaştırılması

  1. Hücreleri toplayın.
    1. Hücreleri birden çok kez yukarı ve aşağı borular ile yeniden askıya alın (köpüklenme neden değil dikkat), 15 mL tüpler ve santrifüj 350 x g 5 dakika aktarın.
    2. 1 x 106 hücre/mL'de tamponun (gentamisin içeren steril PBS'de %2 BSA) yeniden askıya alınması. Ayrıca 5.2 adımdan kontrol (transegeçirilmemiş) CD8 T hücrelerini hasat edin.
      NOT: 2. günde 1 x 106 hücreden bu noktada ~2 x 107 transduced hücre verimi beklenmektedir.
  2. Hücreleri 350 x g'de 5 dk'da santrifüj ederek ayırarak hücreleri bir kez yıkayın ve arabelleği sıralamada 1 x 107 hücre/mL'de yeniden askıya alın. Foxp3GFP telafi kontrolü için küçük bir aliquot çıkarın (adım 6.4.1 kullanılacak) ve etiketli anti-fare CD8 ile kalan leke (klon 53-6.7; antikor 0.2 μg/5 x 106 hücreleri) 4 °C'de 20 dakika kuluçkaya yatırarak.
    1. Benzer şekilde, anti-CD8 antikor etiketleme florofor için bir tazminat kontrolü sağlamak için transe non-transdüksed CD8 T hücrelerinin bir aliquot leke.
      NOT: Bu hücreler için toksik olduğu gibi, herhangi bir tampon sodyum azit ekleyerek kaçının.
  3. Etiketli hücreleri sıralama arabelleği ile iki kez yıkayın, 1 x 107 hücre/mL'de soğuk sıralama arabelleğinde yeniden askıya alın.
  4. Hücreleri sıralayın.
    1. CD8 GFP+ pozitif hücreleri önceden soğutulmuş tam T hücre ortamına sıralayın (Şekil3B). Saflığı belirlemek için sıralama sonrası analiz için küçük bir aliquot alın.
      NOT: Sıralanmış hücrelerin saflığını en üst düzeye çıkarmak için sıkı kapılar kullanılmalıdır. Yüksek hücre canlılığı sağlamak için 100 μm'lik bir nozul kullanın. Sıralanmış hücrelerin buzda tutulduğu süreyi en aza indirin. 3 saatten fazla buzda tutulan T hücrelerinin iyileşmesi, 2 saatten daha az soğutulmuş hücrelerden çok daha uzun sürer. Bu nedenle, 3 transduced hücre hattı sıralamak gerekiyorsa, toplamak ve ilk sıralanır ken ikinci satırı etiketve böylece ikinci ve üçüncü satır0 °C'de uzun bir süre harcamak zorunda kalmadan. CD28 ve CD3 gibi diğer T hücre işaretleyicilerinin ifadesi de izlenebilir (Şekil3C)ancak sıralama amacıyla gerekli değildir.
    2. (Alternatif sıralama stratejisi) Toplu popülasyonu boyamadan önce, transetlenmiş T hücrelerinin küçük bir popülasyonunun CD8 ifadesini analiz edin. Saflık >% 99 ise, o zaman toplu nüfus güvenle gfp ifade temelinde sadece sıralanabilir.

7. Sıralanmış CAR-T hücrelerinin genişletilmesi (Gün 5-10)

  1. CAR-T hücre genişlemesi
    1. Sıralanmış CAR-T hücrelerini bir kez yıkayın, ardından önceden ısıtılmış tam T hücre li orta sında 2,5-5 x 105 hücre/mL ve 24 kuyulu plakalarda 2 mL aliquots plakayı yeniden askıya alın.
    2. Hücreleri her 1-2 günde bir sayın ve bölün. Genellikle hücre sayısı ~ gün 10 kadar her gün iki katına çıkar, canlılık% 95 üzerinde kalan.
      NOT: Yeniden uyarılma olmadan, CAR-T hücreleri 10. Bu nedenle, T hücre fonksiyonel tahliller ve benimseyen transferler buna göre planlanmalıdır.
  2. Alternatif genişleme stratejisi
    1. Sıralamadan sonra, 200 U/mL yerine 100 U/mL'de rhIL-2 içeren tam T hücreli ortamdaCAR-T hücrelerini kültürlendirin.
      NOT: CAR-T hücreleri bu ortamda biraz daha yavaş bir hızda çoğalır. Ancak, genellikle yeniden uyarılma olmadan gün 11-13 kadar çoğalmaya devam edecektir. Bu nedenle, bu alternatif genişletme stratejisi daha fazla sayıda hücre oluşturmasa da, akış aşağı tahlillerinin gerçekleştirilmesi için biraz daha uzun bir zaman penceresi sağlar.

8. CAR T hücrelerinin antijen özgüllüğünün ve işlevselliğinin doğrulanması.

NOT: Peptit/MHC komplekslerini hedefleyen CAR T hücrelerinin bağlayıcı özgüllüğü tetramer boyama7,23ile doğrulanabilir. Benzer şekilde, onların işlevselliği onların cognate ligands tarafından stimülasyon aşağıdaki sitokin salgısı veya sitotoksisite ölçerek teyit edilebilir. Emory Üniversitesi'ndeki NIH Tetramer Çekirdek Tesisi (TCF), tavsiye edilen bir "tetramer" ve ilgili boyama protokolleri kaynağıdır.

  1. Peptit-MHC Tetramer boyama.
    1. 2 x 105 transduced CAR-T hücrelerinin 100 μL'lik sıralama tamponunda , ~0,6 g floresan olarak etiketlenmiş antijene özgü antijen ve kontrol tetramerleri ile kuluçkaya yatırılarak 2 saat boyunca 37 °C'de etiketleme.
    2. 350 x g5 dakika santrifüj ile hücreleri pelet , sonra tampon ve yeniden santrifüj sıralama 0,5 mL resuspend tarafından iki kez yıkayın. Son olarak, 300 μL'lik sıralama tamponundaki hücreleri yeniden askıya alın ve akış sitometrisi ile analiz edin (Şekil 4).
      NOT: Bu çalışmalarda genellikle BV421 etiketli IAg7-B:9-23(RE) (test) ve IAg7-HEL (kontrol) tetramerleri kullanırız. Ancak, araştırılan CAR(lar) için uygun olan herhangi bir florofor/tetramer kombinasyonu kullanılabilir. Bu durumda, kullanılan her tetramer için konsantrasyon ve boyama süresi optimize edilmelidir. Tetramer boyama için hem sıralanmış hem de sıralanmamış CAR-T hücreleri kullanılabilir.
  2. Ligand stimülasyon ile özgüllük ölçümü.
    1. Uygun plaka bağlı veya hücresel ligandlar ile 200 μL sitokin içermeyen T hücre orta 2 x 105 sıralanmış CAR-T hücreleri incubate.
    2. 6-24 saat sonra elisa veya üreticiprotokolleri kullanarak hücre içi boyama ile sitokin üretimini ölçmek.
      NOT: IAg7-B:9-23 yönlendirilmiş T hücreleri ile ilgili çalışmalarımız için, hücreleri bir gecede M12C3 murine B-hücreli lenfoma hücreleri ile kültüre sokan IAg7-B:R3 veya "boş" IAg724,25, sonra supernatants toplamak ve ELISA26 (Şekil 5) tarafından gizlifare interferon gama (IFN-γ) ölçmek.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genellikle, bu protokolü kullanarak transdüksiyon verimliliği ~ 60-90%. Şekil3'te gösterilen deneyde, sıralamadan önce, CD8 T hücrelerinin yaklaşık p'i GFP ile birlikte ifade edilir. Ayrıca CD28 ve CD3 (Şekil3C)ile birlikte ifade edilirler. Daha da önemlisi, tüm "test" GFP+ hücreleri de IAg7-B:R3 tetramer ile eş-lekeli, ancak kontrol tetramer ile değil (Şekil4). Benzer şekilde, ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol retroviral transdüksiyon ile antijene özgü CD8 CAR-T hücreleri üretmek için etkili bir yöntem açıklar. Protokolümüzün transdüksiyon verimliliği genellikle yüksektir ve CAR'ın sağlam ifadesi genellikle gözlenir. Genişletilmiş CAR T hücreleri üst-aktive T hücrelerinin temel özelliklerini korumak, ve antikor özgüllüğü, ve in vitro ve in vivo kullanım için hem uygundur. Biz NOD farelerde Tip 1 Diyabet yeniden programlanmasında Ab-CAR CD8 T hücreleri uyguladık7.

...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MAb287 ve türevleri 2014 yılında çıkarılan bir ABD patenti ile korunmaktadır.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma JDRF 1-INO-2015-74-S-B, 2-SRA-2016-238-S-B ve SRA-2-S-2018-648-S-B, Diyabet Eğitim ve Eylem Ödülü ve Baylor College of Medicine'de Moleküler Tıp Araştırma Caroline Wiess Hukuk Fonu tarafından desteklenmiştir. Hücre sıralama nih (S10RR024574 ve P30CA125123) finansmanı ile Baylor Tıp Koleji'nde Sitometri ve Hücre Sıralama Çekirdek tarafından desteklendi. Tüm peptid-MHC tetramerleri NIH Tetramer Çekirdek Tesisi'nden elde edilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
2-Merkaptoetanol (50mM)Gibco21985-02350 & mu; M
5' RACE PCRClontech634859
anti-fare CD28 antikorlarıeBioscience14-0281-861 & mikro'da son konsantrasyon; g / ml
anti-fare CD3e antikorueBioscience145-2C111 & mikro'da son konsantrasyon; g/ml
Biotin Sıçan Anti-Fare IFN-&gama;BD Biosciences5544100,5 & mikro'da çalışma konsantrasyonu; g/ml
BSASigmaA7030
Endo-free Maxi-Prep kitiQiagen12362
GentamicinGibco15750-060Final 50 & mikro; g/ml'dir.
Isı ile etkisiz hale getirilmiş FCSHycloneSH30087.03Final %10 FCS
HEPES (100X)Gibco15630-0801X
IAg7-CLIP tetramer-BV421NIH tetramer Tesisi Emory'deonay başına6 & mikro'da çalışma konsantrasyonu; g/ml
IAg7-insülin P8E tetramer-BV421NIH tetramer Tesisi,onay başınaEmory'deki Tesis, 6 & mikro'da çalışma konsantrasyonu; g / ml
İnsülin-Transferrin-Selenyum-Etanolamin (ITS 100x)ThermoFisher51500056Son konsantrasyon 1x
Lipofektamin 2000Invitrogen11668019
LS SütunlarıMiltenyi Biotec130-042-401
MACS Ayırma TamponuMiltenyi Biotec130-091-221
Fare CD8a+ T Hücre İzolasyon KitiMiletenyi Biotec Inc130-104-075
Fare CD8a+ T Hücre İzolasyon KitiMiltenyi Biotec130-104-075
Opti-MEM ortaThermoFisher31985070
Penisilin-Streptomisin (5000U/ml)ThermoFisher1507006350 U/ml
Phoenix-ECO hücreleriATCCCRL-3214
Fosfat tamponlu salin (PBS)Gibco10010-023
pMIG IIAddgene52107
pMSCV-IRES-GFP IIAddgene52107
Saflaştırılmış Sıçan Anti-Fare IFN-&gama;BD Biosciences5512163 & mikro'da çalışma konsantrasyonu; g / ml
Kırmızı hücre lizis tamponuSigmaR7767
RetroNectinTakaraT100A50 & mikro'da çalışma konsantrasyonu; PBS rhIL-2'de g / ml
(stok konsantrasyonu 105< / sup> IU / ul)Peprotech200-02200 IU / ml
rmIL-7'de nihai konsantrasyon (stok konsantrasyonu 50ng / ul)R & D407-ML-0050.5ng / ml RPM'de nihai konsantrasyon
Gibco11875-093
Steril Hücre SüzgeçleriFisher Scientific22-363-548
TrypleGibco12605-028

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. Type 1 Diabetes. Lancet. 383, 69-82 (2014).
  2. Bankovich, A. J., Girvin, A. T., Moesta, A. K., Garcia, K. C. Peptide register shifting within the MHC groove: theory becomes reality. Molecular Immunology. 40 (14-15), 1033-1039 (2004).
  3. Nakayama, M., et al. Prime role for an insulin epitope in the development of type 1 diabetes in NOD mice. Nature. 435, 220-223 (2005).
  4. Crawford, F., et al. Specificity and detection of insulin-reactive CD4+ T cells in type 1 diabetes in the nonobese diabetic (NOD) mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 16729-16734 (2011).
  5. Stadinski, B. D., et al. Diabetogenic T cells recognize insulin bound to IAg7 in an unexpected, weak binding register. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 10978-10983 (2010).
  6. Zhang, L., et al. Monoclonal antibody blocking the recognition of an insulin peptide-MHC complex modulates type 1 diabetes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2656-2661 (2014).
  7. Zhang, L., et al. Chimeric antigen receptor (CAR) T cells targeting a pathogenic MHC class II:peptide complex modulate the progression of autoimmune diabetes. Journal of Autoimmunity. 96, 50-58 (2019).
  8. Purbhoo, M. A., Irvine, D. J., Huppa, J. B., Davis, M. M. T cell killing does not require the formation of a stable mature immunological synapse. Nature Immunology. 5, 524-530 (2004).
  9. Huppa, J. B., Davis, M. M. T-cell-antigen recognition and the immunological synapse. Nature Reviews. Immunology. 3, 973-983 (2003).
  10. Irvine, D. J., Purbhoo, M. A., Krogsgaard, M., Davis, M. M. Direct observation of ligand recognition by T cells. Nature. 419, 845-849 (2002).
  11. Barrett, D. M., Singh, N., Porter, D. L., Grupp, S. A., June, C. H. Chimeric antigen receptor therapy for cancer. Annual Review of Medicine. 65, 333-347 (2014).
  12. Kochenderfer, J. N., Yu, Z., Frasheri, D., Restifo, N. P., Rosenberg, S. A. Adoptive transfer of syngeneic T cells transduced with a chimeric antigen receptor that recognizes murine CD19 can eradicate lymphoma and normal B cells. Blood. 116, 3875-3886 (2010).
  13. Kochenderfer, J. N., Rosenberg, S. A. Treating B-cell cancer with T cells expressing anti-CD19 chimeric antigen receptors. Nature Reviews Clinical Oncology. 10, 267-276 (2013).
  14. Fishman, S., et al. Adoptive Transfer of mRNA-Transfected T Cells Redirected against Diabetogenic CD8 T Cells Can Prevent Diabetes. Molecular Therapy. 25 (2), 456-464 (2017).
  15. Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor. N.Y. (1982).
  16. Holst, J., et al. Generation of T-cell receptor retrogenic mice. Nature Protocols. 1 (1), 406-417 (2006).
  17. Johnstone, A., Thorpe, R. Immunochemistry in practice. , 3rd edn, Blackwell Science. Cambridge, MA. (1996).
  18. Rowland-Jones, S. L., McMichael, A. J. Lymphocytes: a practical approach. , 2nd ed, Practical approach series. New York. (2000).
  19. Pear, W. S., Nolan, G. P., Scott, M. L., Baltimore, D. Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (18), 8392-8396 (1993).
  20. Sena-Esteves, M., Saeki, Y., Camp, S. M., Chiocca, E. A., Breakefield, X. O. Single-step conversion of cells to retrovirus vector producers with herpes simplex virus-Epstein-Barr virus hybrid amplicons. Journal of Virology. 73 (12), 10426-10439 (1999).
  21. Carrero, J. A., Calderon, B., Towfic, F., Artyomov, M. N., Unanue, E. R. Defining the transcriptional and cellular landscape of type 1 diabetes in the NOD mouse. PLoS One. 8 (3), e59701(2013).
  22. Jansen, A., et al. Immunohistochemical characterization of monocytes-macrophages and dendritic cells involved in the initiation of the insulitis and beta-cell destruction in NOD mice. Diabetes. 43 (5), 667-675 (1994).
  23. Corbett, A. J., et al. T-cell activation by transitory neo-antigens derived from distinct microbial pathways. Nature. 509 (7500), 361-365 (2014).
  24. Griffith, I. J., et al. Structural mutation affecting intracellular transport and cell surface expression of murine class II molecules. Journal of Experimental Medicine. 167 (2), 541-555 (1988).
  25. Kozono, H., White, J., Clements, J., Marrack, P., Kappler, J. Production of soluble MHC class II proteins with covalently bound single peptides. Nature. 369 (6476), 151-154 (1994).
  26. Allicotti, G., Borras, E., Pinilla, C. A time-resolved fluorescence immunoassay (DELFIA) increases the sensitivity of antigen-driven cytokine detection. Journal of Immunoassay & Immunochemistry. 24 (4), 345-358 (2003).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Antijen Spesifik T H creleriCAR T H cre TedavisiRetrovir s Transd ksiyonuPrimer H cre zolasyonuAk Sitometrik AnalizTip 1 Diyabet ModeliOtoimm n Hastal k TedavisiKimera Antijen Resept rleriT H cresi Ekspansiyonu

İlgili makaleler