Bu protokol, Drosophila'nın embriyodan yetişkine kadar her gelişim aşamasındaki canlılığını değerlendirmek için tasarlanmıştır. Yöntem, farklı genotiplerin veya büyüme koşullarının canlılığını belirlemek ve karşılaştırmak için kullanılabilir.
Yöntem makalesi
Drosophila Melanogaster'In Embriyodan Yetişkine Canlılığını Değerlendirmek Için Doğrudan ve Basit Bir Yöntem
Bu makalede
Özet
Özet
Drosophila melanogasterolarak , canlılık tahlilleri bazı genetik arka planlar fitness belirlemek için kullanılır. Allelic varyasyonları, gelişimin farklı aşamalarında kısmi veya tam canlılık kaybına neden olabilir. Laboratuvarımız, Drosophila'da embriyodan tamamen olgun bir yetişkine kadar canlılığı değerlendirmek için bir yöntem geliştirmiştir. Yöntem, yumurtadan çıkan embriyolardan başlayarak, gelişim sırasında farklı aşamalarda bulunan singen sayısının ölçülmeye dayanır. Embriyolar sayısallaştıktan sonra, L1/L2, pupa ve olgun yetişkinler de dahil olmak üzere ek evreler sayılır. Tüm aşamalar incelendikten sonra, ki-kare testi gibi istatistiksel bir analiz, başlangıç sayısı ile erişkinlerin gözlenen sayısıyla sonuçlanan başlangıç sayısı (yumurtadan embriyolar) ile daha sonraki evreler arasında anlamlı bir fark olup olmadığını belirlemek için kullanılır, bu nedenle geçersiz hipotezi reddetmek veya kabul etmek (yumurtadan çıkan embriyo larınva, pupa ve yetişkinlerin gelişim aşamaları boyunca kaydedilen sayısına eşit olacaktır). Bu savarın birincil avantajı sadeliği ve doğruluğudur, çünkü teknik hatalardan kaynaklanan kayıpları önleyerek, onları gıda şişesine aktarmak için bir embriyo durulama gerektirmez. Burada açıklanan protokol doğrudan L2/L3 larvalarını incelemese de, bunların hesabını vermek için ek adımlar eklenebilir. Yumurtadan çıkan embriyo, L1, pupa ve yetişkinlerin sayısının karşılaştırılması, l2/L3 evrelerinde daha ileri çalışmalar için canlılığın tehlikeye girip girmemiş olduğunu belirlemeye yardımcı olabilir (renkli gıda larınvanın görsel olarak tanımlanmasına yardımcı olur). Genel olarak, bu yöntem Drosophila araştırmacılar ve eğitimciler ne zaman canlılık sinek yaşam döngüsü sırasında tehlikeye belirlemek yardımcı olabilir. Bu tetkik kullanarak stokların rutin değerlendirilmesi, özellikle orijinal mutasyonlar kondisyonu etkiliyorsa, başlangıçta izole edilmiş mutantın fenotipini etkileyebilecek ikincil mutasyonların birikmesini önleyebilir. Bu nedenle laboratuvarımız, Dm ime4 alellerimizin her birinin birden fazla kopyasını muhafaza eder ve diğer moleküler analizlere ek olarak bu yöntemle her stoğun saflığını rutin olarak kontrol eder.
Giriş
Yaşam süresi genetik ve genetik olmayan faktörlerden etkilenir. Oda sıcaklığında standart laboratuvar büyüme koşullarında, laboratuarımız aynı koşullarda yetiştirilen farklı Dm ime4 alelleri arasında fitness ve canlılık önemli bir varyasyon gözlemledi (Şekil1 ve Ek Rakamlar). Canlılık çalışmaları sıklıkla popülasyon genetik çalışmalarda belirli bir alel kombinasyonu veya büyüme durumunun etkilerini araştırmak için yapılır1,2,3,4. Ancak, tamamlayıcı olmayan bir mutasyon grubu içinde canlılık analizini bilimsel literatürde bulmak zordur. Araştırmacı dengeli stok evler gıda şişeiçinde bu alel için birkaç kişi homozigot bulursa bir alel genellikle "gerekli olmayan" olarak etiketlenir5,6. Ancak, doğru Ki-kare analizleri bu homozigotlar beklenen Mendelian oranları nda ortaya olup olmadığını değerlendirmek için5,6. Herhangi bir Drosophila stok için en müsamahakar sıcaklık oda sıcaklığı (22-23 °C) ve uygun besin ile, yabani sineklerin yaşam döngüsü tamamlamak için yaklaşık on iki gün sürer7,8. Yabani tip Drosophila her gelişim evresinin süresi bilindiği gibi7,8, Bu raporda açıklanan yöntem çalışma altında Drosophila zorlanma her aşamada uygun olup olmadığını incelemek için kullanılabilir genetik arka plan için uygun bir kontrol ile karşılaştırıldığında test edilmiştir. Geliştirme9 belirli bir yönü üzerinde durulançalışmaların aksine, bu protokol farklı gelişim aşamalarında canlılığı değerlendirmek için pratik bir yol sağlar.
Laboratuvarımızda, bu protokol, Meyoz4 Drosophila Inducer(Dm ime4)için eksik olan stokların canlılığını değerlendirmek için kullanılır. Dm ime4, Drosophila ve diğer çok hücreli organizmalarda RNA metabolizmasında kritik rolleri olan bir RNA metiltransferaz kodlayan önemli bir gen10, 6,10, 11.11.20 , 12.000.0 , 13.000 , 14.000 . CRISPR/Cas9 (EkRakamlar)ile oluşturulan Dm ime4'ün yeni alellerini hızlı bir şekilde değerlendirmek için, sadece dengeli stokların şişeleri içinde üretilen erişkin singenin sayıldığı bir uç nokta canlılık titresi yapılmıştır ( Şekil1). Kullanılan hisse senetlerinin bazıları önceki Dm ime4 raporlarında5,6olarak tanımlanmıştır. Homozigot mutantlar, ki-kare analizleri ile belirlenen alt-Mendelian düzeylerde ortaya çıkmıştır (Şekil 1 ve Tamamlayıcı Malzemeler). Bu beklenenden daha düşük sayıların daha az embriyo döşenmesinden mi yoksa daha az yumurtadan çıkan embriyodan mı yoksa L1/L2 veya pupalarda canlılık kaybından mı kaynaklandığını değerlendirmek için, izlemeyi bu gelişim evrelerinin her birinde sayımları içerecek şekilde genişlettik (Şekil 2, Şekil 3, Şekil 4, Şekil 5, Şekil 6, Şekil 7, Şekil 8, ve Şekil 9).
Burada, yabani tip (OreR) sinekler kullanarak yöntemi açıklar. Bu yöntemi diğer genetik geçmişler veya Drosophila türleri ile kullanılmak üzere ampirik olarak test etmek için, OreR'ı referans olarak kullanmanızı ve zaman noktalarını deneysel organizmaya göre ayarlamanızı öneririz. Protokol daha heterozigot Dm ime4 mutant stok5,6 (Şekil 4) erkekler ile bakire yabani tip kadıngeçerek oluşturulan singeny canlılığını değerlendirmek için değerlendirildi.
Protokol
1. Medya Hazırlama
- Üretici talimatlarına göre üzüm agarı hazırlayın (Bkz. MalzemeTablosu) ve 35mm'lik Petri kabına yarı dolu dökün (Şekil 5). Yaklaşık 1 saat katılaşmaya izin verin. Üzüm agarı katıladıktan sonra hemen 4 °C'de kullanın veya saklayın.
- Hafifçe küçük bir plastik bıçak kullanarak agar plaka üzerinde çizikler yapmak (pürüzlü yüzeylerde yatıyordu gibisinekler) çizikler olmadan plakanın ortasında bırakarak (Şekil 5). Az miktarda maya macunu (taze yapılmış; bkz. MalzemelerTablosu) plakanın ortasına yerleştirin (Şekil 5).
2. Embriyo Toplama Mini Kafes Kurmak
- Maya macunu ile desteklenen üzüm agar plakası içeren embriyo toplama kafesi içinde iki bakire kadın ve bir genç erkek kullanarak bir haç kurmak (Şekil5).
- 24 saat sonra, agar plakanın altına bakarak kafesi açmadan döşenmiş embriyolar için kafesleri inceleyin. Embriyolar döşenmişse, agar plakasını hazneden çıkarın ve mikroskobik gözlemiçin nemli bir odanın içine yerleştirin (Şekil 6). Birkaç gün döşenmesi (örneğin, doğurganlık/ uzun ömürlü tahliller) puanlanırsa, üreme anne tutmak ve açıklandığı gibi hazırlanan taze bir plaka ile plaka değiştirin. 24 saatten daha az erken koleksiyon yapılabilir, ancak bakire dişileri kullanırken pupa durumundan çıktıktan sonra 48 saate kadar yatmayacaklarının farkında olun.
- Dehidratasyondan kaçınmak ve hemen nemli bir odanın içine yerleştirmek için embriyo içerenagar plakasını Petri kabı kapağı ile kapatın (Şekil 7). Bir diseksiyon mikroskop altında gözlemlemek ve yumurtadan embriyolar ve L1 kayıt. Tüm embriyolar yumurtadan çıkıp L1 larvalarına dönüşene kadar kapağı ve odasıcaklığında nemli odada depolayın (Şekil 6).
3. Embriyo ve Larvaların Sayma
- 48 saat sonra, diseksiyon mikroskobu altındaki plakaları gözlemleyin ve agar diskinin gıda şişesine aktarılmasından önce sayıları son bir kez kaydedin. Döllenmiş/canlı embriyolar o zamana kadar L1 haline gelmelidir. Transferden önce daha uzun kuluçka süreleri mümkündür ancak tabakların nem kaybetmeye başlayıp agarın gıdaşişelerine temiz bir aktarım dan ödün vermeden çatlayabildiğini unutmayın (Şekil 7). Plakaların sulu kalmasını ve embriyonun sayılırken canlılığını tehlikeye atmamasını sağlamak için, agar yüzeyi üzerinde doğrudan kaz yaka ışığı kullanmaktan kaçının (Şekil7E uygun bir mesafe gösterir).
- Saydıktan sonra, plakakapağı ve transfer hazır olana kadar nemli odada saklayın. Bulguları kaydet.
4. Geliştirme Sırasında Canlılığı izlemek için Üzüm Agar Diski'ni Bir Gıda Viral'ına Aktarın
- Sayılar kaydedildikten sonra (yumurtadan çıkan embriyolar/L1/L2), üzüm agar diskini üreticinin talimatlarına göre hazırlanan Drosophila gıda ortamını içeren 35 mm'lik bir diski barındıracak kadar büyük bir şişeye dikkatlice aktarmak için bir spatula kullanın ( reaktifler). Üzüm agar diskl1-yan gıda (Şekil7) aşağı yerleştirin. Agar diskini larvalı gıda şişesine aktardıktan sonra, boş Petri kabını geride kalan larvalar için dikkatlice inceleyin (Şekil7E).
- L2/L3 larvalarının şişedeki gıdaya doğru yol aldığı gözlemlediğinden emin olmak için her gün, kabaca aynı saatte,günlük gıda şişelerini incelemek için bir program ayarlayın (Şekil 8).
- Pupa ve erişkin Drosophilasayısını kaydedin (Şekil 9). Daha fazla yetişkin gözlemlenene kadar saymaya devam edin ve sonraki nesli saymaktan kaçının (ilk yetişkinleri gözlemledikten sonra son 9 günü saymayın).
- Bulguları gözlemleyin ve kaydedin. Kullanılan mutant stoka göre embriyo toplama, sayma ve kayıt zaman dilimini ayarlayın.
- Bir ki kare analizi gerçekleştirin. Null hipotezi yetişkin sayısı nın yumurtadan çıkan embriyo sayısına eşit olacağını ve L1'in başlangıçta kaydedilmiş ve gıda şişelerine aktarılabilen %100 canlılığı varsayar.
Sonuçlar
Bu yöntem doğru ve tekrarlanabilir bir ki kare analizleri birleştiğinde ortaya çıkan yetişkinler için embriyolardan canlılık ölçmek için izin verir.
İlk çalışmalarda, embriyolar ve larvalar sayıldıktan sonra, üzüm agar şişe nin yan tarafında dik içine yerleştirildi. Ne yazık ki, agar şişenin yan yerleştirildi zaman embriyo larvaları birçok yetişkinler için olgun değildi. Bu büyük olasılıkla üzüm agar disk kuruyan nedeniyle oldu (Şekil 3). Bu yerleşim sonuçları şaşırtmak olabilir bir çevresel değişken (agar disk hidrasyon) tanıttı. Yetişkinlerin sadece a'i ortaya çıktığı için döllerin yaklaşık 9'u embriyolar arasında yetişkine kaybedildi. En büyük kayıplar L1 larvaları (üzüm agar plakalarının yüzeyinde sayılan) ve pupa (gıda şişelerinin duvarlarında sayılan) sayımları arasında meydana geldi. Ancak, üzüm agarı gıda yüzeyi ile doğrudan temas halinde şişe nin içine doğru yüzaşağı yerleştirildiğinde, singeny az% 6 kayboldu (Şekil2). Tüm üzüm agar diski şişe içindeki anlık gıdanın nemi ile temas halinde kaldığı için agar sulu kalmıştır (Şekil 7, Şekil 8). Bu sonuçlar, agarın şişe içindeki konumunun güvenilir veri elde etmek ve çevresel değişkenlerin katkısını en aza indirmek için önemli olduğunu göstermektedir. Yöntemin etkinliğini destekleyen diğer veriler, ilk yöntem doğrulamada kullanılan yabani tip döller ve bakire yabani tip dişilerin dengeli bir Dm ime4 mutant stoğundan erkeklere geçişi yle üretilen soyundan gelen ler karşılaştırılarak toplanmıştır ( Ek Şekil 2, ime4Δnull/TM3sb
Tartışma
Özetle, bu yöntem Drosophilacanlılık doğru ve basit bir değerlendirme sağlar. Tüm protokolün tamamlanması yaklaşık 14 gün sürer. Prosedür uzman teknik beceri gerektirmez; ancak, uygun zamanlama, günlük gözlemler bir program ve dikkatli agar transferi doğruluk ve tekrarlanabilirlik için önemlidir.
Üzüm-agar disk embriyo tarafının gıda şişesine yerleştirilmesine ek olarak, işlemdeki bir diğer önemli adım da, agar diskini en geç 48 saat sonra üzüm agar plakasını embriyo toplama mini kafeslerinden çıkardıktan sonra bir gıda şişesine aktarmaktır. 48 saat sonra agar transferi embriyo ve larva kaybı ile sonuçlandı, muhtemelen agar diskin dehidratasyon nedeniyle. L2/L3 geçişlerini saymak için plakanın 72 saat kuluçkaya yatırılması gerekir. Bu aşamada çok önemli ise, üzüm agar plakaları kalın dökülür ve kurumasını önlemek için nemli bir oda kullanılmalıdır. Haçlar 35 mm plakabarındıran embriyo toplama kafeslerinde kuruldu; ancak bu işlem, 60 mm veya 100 mm Petri plakası barındıran daha büyük embriyo toplama kafesleri kullanılarak da yapılabilir. Gıda şişeleri daha sonra bu boyutlarda karşılamak için yeterince büyük olmalıdır.
Bu protokole eklenebilir adımlar vardır. Yukarıda belirtildiği gibi, L2/L3 geçişleri gerekli zaman ve agar potansiyel dehidratasyon nedeniyle plakalar üzerinde ölçmek için zor. Ayrıca, larvalar agar yüzeyinde son derece hareketli hale gelir, doğru onları saymak için bir meydan okuma poz. L2/L3 larvaları saymadan önce agarın yüzeyine 30 dakika boyunca tabakları buzdolabına yerleştirmek veya hafif bir anestezik (lidokain çözeltisi) damlatmak, hareketlerini daha doğru saymak için yavaşlatmaya yardımcı olabilir. Bu değişiklikler için bir uyarı değişkenler tanıtmak olabilir (soğuk hassasiyet, anestezik duyarlılık) ve canlılık sonuçları şaşırtmak. Bu adımlar olmadan bile, renkli gıda kullanarak, araştırmacılar yavru başlatmak için gıda şişeleri tarafında yerleşmek gibi dolaşan L3s / prepupae ölçebilirsiniz. Bu yöntemin bir sınırlama bu embriyo toplama kafeslerinde haçlar kurmak için fenotipleme için CO2 ile anestezi olmak hayatta kalmak için haçlar kullanılan yetişkinler gerektirir. Dm ime4 homozigot mutant erkekler iyi iyileşmezler ve CO2 tedavisinden uyandıktan birkaç saat sonra ölürler. Sıralama için yetişkinleri hareketsiz hale getirmek için birkaç dakika boyunca şişeleri buzdolabına yerleştirmek ve daha sonra şişeleri yavaş hareket etmek ve hızlı ve verimli bir şekilde sıralamak için ezilmiş buza aktarmak gibi diğer yöntemler keşfedilebilir.
Allelic güçlü ve canlılık üzerindeki etkilerini karşılaştırmanın yanı sıra, bu yöntem tanımlanan farmasötik bileşiklere karşı duyarlılık veya direnç elde etmek için kullanılabilir. Hücre kültüründe bileşik toksisiteyi ekrana alan diğer yöntemlerden farklı olarak15,16,17,18, Bu yöntem tüm organizmaları kullanır, gelişimsel etkilerin değerlendirilmesini analiz etmeyi kolaylaştırır. Özetle, bu protokol ve burada yapılan değişiklikler kullanılarak, allelik güçlü yanlarının yanı sıra çevresel faktörlerin ve kimyasal bileşiklerin Drosophila canlılığı, fecundity, doğurganlık, yaşam süresi ve gelişim döngüsü.
Açıklamalar
Çıkar çatışması yok.
Teşekkürler
Çalışmalarımız NIH 1R15GM1131-01 tarafından CFH ve NIH PA -12-149 CFH için finanse edilmektedir.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Küf önleyici katkı maddesi | Carolina | ||
| Beher | Fisher Scentific | S76100J | Beher |
| Benchmark bilimsel dijital ocak gözü | Laboratuvar Deposu | H3760H | Sıcak tabak |
| Üzüm agar ve anında sinek yemi hazırlamak için Britta filtrelenmiş musluk suyu | Herhangi bir musluk suyu filtreleme sistemi | ||
| CO2< / sub> tabanca veya FlyNap | Yetişkin sinekleri sıralamak/saymak için Carolina Anestezik | ||
| Diseksiyon mikroskobu/stereoskop | Amscope | SM-1TSZ-V203 | Diseksiyon mikroskobu |
| Drosophila kültür şişeleri ve tıpaları | Carolina | 173120 | Büyüyen gıda şişeleri Drosophila |
| Embriyo toplama mini kafesi | Genesee Scientific | 59-105 | odası için kullanılır embriyoları toplayın |
| Erlenmeyer şişesi | Sigma-Aldrich | 70980 | Erlenmeyer şişesi |
| Formül 4-24 Anında Drosophila Orta, Mavi | Carolina | https://www.carolina.com/drosophila-fruit-fly-genetics/formula-4-24-drosophila-medium-blue/FAM_173210.pr | |
| Üzüm agar | Genesee Scientific | 47-102 | Agar plakaları için kullanılan ortam |
| Anında sinek flood | Carolina | 173210 | Gıda şişeleri |
| İnkübasyon/mikroskobik gözlem öncesi ve sonrası sırasında üzüm-agar plakalarını nemli tutmak için ıslak kağıt havlular yerleştirerek nemli bir oda olarak kullanılacak büyük Petri kabı veya herhangi bir şeffaf kap | |||
| Metal spatula (küçük) | Carolina | ||
| Mikrodalga Herhangi Üzüm | agar | ||
| Petri kabı | pişirmek için Kord-Valmark | 2901 | Üzüm agar için petri kabı |
| Karıştırma çubuğu | Laboratuvar Deposu | 58948-981-EA | Manyetik karıştırma çubuğu |
Kaynaklar
- Hartung, E. W. Some observations on the larval growth rate and viability of two tumor strains of Drosophila melanogaster. Science. 107 (2777), 296-297 (1948).
- Moree, R., King, J. R. Experimental Studies on Relative Viability in Drosophila Melanogaster. Genetics. 46 (12), 1732-1752 (1961).
- Da Costa, M. V. Viability of F1 and F2 generations of crossed Drosophila and Oregon previously adapted to 2 different nutrient media. Comptes rendus de l'Académie des Sciences. 242 (1), 177-180 (1956).
- Garcia-Dorado, A., Caballero, A. The mutational rate of Drosophila viability decline: tinkering with old data. Genome Research. 8 (2), 99-105 (2002).
- Lence, T., et al. m6A modulates neuronal functions and sex determination in Drosophila. Nature. 540 (7632), 304-318 (2016).
- Haussmann, I. U., et al. m(6)A potentiates Sxl alternative pre-mRNA splicing for robust Drosophila sex determination. Nature. 54 (7632), 301-304 (2016).
- Stockwer, H., Gallant, P. Getting started: An overview on raising and handling Drosophila. Methods in Molecular Biology. 420, 27-44 (2008).
- Hales, K. G., et al. Genetics on the Fly: A Primer on the Drosophila Model System. Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).
- Gardner, M., et al. Genetic Variation for Preadult Viability in Drosophila melanogaster. Evolution. 55 (8), 1609-1620 (2001).
- Hongay, C. F., Orr-Weaver, T. L. Drosophila Inducer of MEiosis 4 (IME4) is required for Notch signaling during oogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14855-14860 (2011).
- Zhong, S., et al. MTA Is an Arabidopsis Messenger RNA Adenosine Methylase and Interacts with a Homolog of a Sex-Specific Splicing Factor. The Plant Cell. 5, 1278-1288 (2008).
- Wang, Y., et al. N6-methyladenosine modification destabilizes developmental regulators in embryonic stem cells. Nature Cell Biology. 16, 191-198 (2014).
- Hsu, P. J., Shi, H., He, C. Epitranscriptomics influence on development and disease. Genome Biology. 18 (197), 1-9 (2017).
- Kan, L., et al. The m6A pathway facilitates sex determination in Drosophila. Nature Communications. 8, 1-16 (2017).
- Senkowski, W., et al. Three-Dimensional Cell Culture-Based Screening Identifies the Anthelmintic Drug Nitazoxanide as a Candidate for Treatment of Colorectal Cancer. Molecular Cancer Therapeutics. 14 (6), 1504-1516 (2015).
- Ramasamy, S., Bennet, D., Kim, S. Drug and bioactive molecule screening based on a bioelectrical impedance cell culture platform. International Journal of Nanomedicine. 9, 5789-5809 (2014).
- Weltin, A., et al. Cell culture monitoring for drug screening and cancer research: a transparent, microfluidic, multi-sensor microsystem. Lab on a Chip. 14 (1), 138-146 (2014).
- Astashkina, A., Mann, B., Grainger, D. W. A critical evaluation of in vitro cell culture models for high-throughput drug screening and toxicity. Pharmacology & Therapeutics. 134 (1), 82-106 (2012).
Yeniden basım ve izinler
