Method Article

Hızlandırılmış Yapılandırılmış Aydınlatma Mikroskomu için Mitokondriyal Nükleoidlerin Özel Etiketlemesi

DOI:

10.3791/60003

⸱

June 4th, 2020

 ,  , 
1Imaging Facility, Max Planck Institute of Immunobiology and Epigenetics

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokol, mitokondriyal nükleoidlerin ticari olarak kullanılabilen DNA jeli lekesi ile özel etiketlemesini, süper çözünürlüklü yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SR-SIM) ile zaman atlamalı canlı etiketli hücrelerin zaman atlamalı serilerinin edinimini ve nükleoid hareketinin otomatik olarak izlenmesini açıklar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitokondriyal nükleoidler, proteinlerle kaplanmış mitokondriyal DNA molekülleri tarafından oluşturulan kompakt parçacıklardır. Mitokondriyal DNA, tRNA'ları, rRNA'ları ve birkaç temel mitokondriyal polipeptidi kodlar. Mitokondriyal nükleoidler, fizyon/füzyon ve diğer morfolojik değişikliklerden geçen dinamik mitokondriyal ağ içinde bölünür ve dağıtır. Yüksek çözünürlüklü canlı floresan mikroskopisi bir nükleoidin konumunu ve hareketini karakterize etmek için basit bir tekniktir. Bu teknik için, nükleoidler genellikle protein bileşenlerinin floresan etiketleri ile etiketlenir, yani transkripsiyon faktörü a (TFAM). Ancak, bu strateji, eserlere (TFAM için rapor) neden olabilecek floresan protein etiketli bir yapının aşırı ifade edilmesine ihtiyaç duyar ve birçok durumda mümkün değildir. Organik DNA bağlayıcı boyalar bu dezavantajları yok. Ancak, her zaman hem nükleer hem de mitokondriyal DNA'ların boyanmasını gösterirler, böylece mitokondriyal nükleoidlere özgüllükten yoksundurlar. Bu boyaların fiziko-kimyasal özelliklerini göz önünde bulundurarak, bir nükleik asit jel lekesi (SYBR Gold) seçtik ve canlı hücrelerdeki mitokondriyal nükleoidlerin tercihli etiketlemesini sağladık. Boyanın özellikleri, özellikle DNA'ya bağlanan yüksek parlaklığı, süper çözünürlüklü yapılandırılmış aydınlatma görüntülerinin zaman serilerini kullanarak mitokondriyal nükleoid hareketinin sonraki nicelikselleştirilmesine izin verir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dairesel 16.5 kbp DNA molekülleri mitokondrigenetik malzemesini oluşturur, 22 tRNA, 2 rRNA ve 13 polipeptidleri kodlar? Mitokondriyal DNA mitokondriyal transkripsiyon faktörü a (TFAM) ve diğer bazı proteinler mitokondriyal nükleoidler1formu bağlı ,2,3,4. Mitokondriyal nükleoidler hareket ve mitokondriyal ağ bileşenleri arasında yeniden dağıtmak5,6 onun morfolojik remodeling sırasında, fisyon veya füzyon hücre döngüsü fazına bağlı olarak, stres, ve diğer faktörler (Pernas ve ark.7gözden). Buna ek olarak, mitokondriyal nükleoidlerin hareketi, sistemik lupus eritematozus hastalığı8 karıştığı ve diğer hastalıklarda rol oynayabilir. Floresan mikroskopisi organellerin canlı hücre çalışmaları için basit bir tekniktir, ancak bu teknik mitokondriyal nükleoidlerin boyutundan daha büyük olan >200 nm çözünürlüğe sahiptir (~100 nm9,10,11,12). Bu sınır, uyarılmış emisyon tükenmesi (STED) ve tek molekül lokalizasyon mikroskobu (SMLM)13,14gibi sözde "süper çözünürlüklü" teknikler tarafından atlatılmıştır. Şimdiye kadar, mitokondriyal nükleoidler ve diğer DNA'lar canlı hücrelerde doğrudan stokhastik optik rekonstrüksiyon mikroskopisi (dSTORM)15ile görüntülenmiştir. Canlı hücrelerde STED tarafından mtDNA ile ilişkili pozisyonlara sahip ince alt mitokondriyal yapılar gözlenmiştir16. Ancak, bu süper çözünürlük teknikleri canlı hücreler üzerinde fototoksik etkilere neden olan yüksek aydınlatma yoğunluğu gerektirir17. Bu nedenle, kırınım sınırının ötesinde çözünürlüğe sahip mitokondriyal nükleoidlerin zaman atlamalı görüntülemesi zordur. Bu sorunu gidermek için süper çözünürlüklü yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SR-SIM)18kullandık. SIM STED ve SMLM19daha çok daha düşük bir aydınlatma güç dozu gerektirir. Ayrıca, STED ve SMLM teknikleri aksine, SIM basit çok renkli üç boyutlu (3D) görüntüleme izin verir, ve floroforlar veya görüntüleme tampon kompozisyon belirli fotofiziksel özellikleri gerektirmez19.

Canlı hücrelerde mitokondriyal nükleoidlerin etiketlemisiyal strateji, TFAM20gibi bir mitokondriyal nükleoid proteinin floresan etiketlemesidir. Ancak, birçok durumda, bu strateji uygun değildir. Ayrıca, floresan protein etiketli TFAM aşırı ifade ciddi bir artifakıüretir 21. DNA'nın organik boyalarla etiketlemi floresan protein (FP) tabanlı bir stratejiye göre avantajlıdır. Organik boyalar FP etiketlemeile ilgili kısıtlardan arındırılır: her türlü hücre veya doku için kullanılabilir ler ve bir deneyin herhangi bir noktasında uygulanabilirler. Mitokondriyal nükleoidlerin canlı hücre görüntüleme si birkaç DNA bağlayıcı boyalar ile bildirilmiştir: DAPI22, SYBR Yeşil23, Vybrant Boya Döngüsü24, ve picoGreen15,25,26. Nükleoid etiketleme için DNA bağlayıcı boyaların çoğunun önemli bir dezavantajı hücre içindeki tüm DNA'yı lekelemeleridir. Boyayı sadece mitokondriyal DNA'ya yönlendirmek son derece arzu edilir. Bunu başarmak için, uygun fiziko-kimyasal özelliklere sahip bir boya dikkatli seçimi gereklidir. Rhodamine 123 gibi lokalize pozitif yüke sahip lipophilic boyaların, negatif membran potansiyelini koruyan canlı mitokondride biriktiği bilinmektedir. Buna ek olarak, mitokondriyal nükleoidlerin özel etiketleme için ideal bir boya yüksek afinite sahip DNA bağlamak ve DNA bağlama üzerine parlak floresan yontmak gerekir. Bu gereksinimleri göz önünde bulundurarak, bazı siyanürler umut verici (örneğin, picoGreen), ama nükleer DNA bol miktarda mitokondriyal DNA15,,25,26ile aynı anda bu boyalar tarafından lekeli . Bu protokol, canlı hücrelerdeki mitokondriyal nükleoidlerin başka bir siyanür boyası olan SYBR Gold (SG) ile özel etiketlemesini ve zaman atlamalı süper çözünürlüklü SIM videolarında nükleoidlerin takibini açıklamaktadır. Ayrıca, SG lekeli canlı hücreler, canlı hücreler için uygun ve 488 nm ışık kaynağı ile donatılmış ters floresan mikroskop (konfokal, iplik diski, epifloresan, vb) her türlü görüntülenebilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Burada bahsedilen tüm hücre hatları yüksek glikoz Dulbecco's Modifiye Kartal orta kültürlü edildi (DMEM) ile takviye 10% fetal sığır serumu (FBS), glutamin, penisilin / streptomisin, ve piruvat. Etiketleme ve görüntüleme gününde kullanılacak tüm ortam ve takviyeleri % 5 CO2olarak ayarlanmış bir kuvözde 37 °C'ye kadar ısıtarak dengeleyin. Etiketleme de dahil olmak üzere tüm hücre kültürü çalışmaları bir laminar akış başlık altında steril koşullarda gerçekleşir.

1. Canlı Hücre Etiketleme

  1. Etiketleme işleminden bir gün önce, kültür 4 x 105 HeLa hücreleri 2 mL orta 35 mm Petri çanak #1,5 cam alt ile. Çok kuyulu bölmeli slaytlar kullanılabilir, ancak hacimler kuyunun hacmine orantılı olarak ayarlanmalıdır. Hücre süspansiyonu yaklaşık 50.000 hücre/mL ve 35 mm Petri kabında hücre süspansiyonunun 2 mL tohumolacak şekilde seyreltin.
  2. SYBR Gold (SG) ticari stok çözeltisinin aşağıdaki seyreltmelerini hazırlayın: 1:5,000. Mitotracker Deep Red (çok kırmızı leke) veya Mitotracker CMXRos Kırmızı (kırmızı leke)(Malzeme Tablosu; ticari stok 1:2.000 seyreltilmiş) fenol kırmızı-free kültür orta hazırlayın. SG için olduğu gibi picoGreen aynı set seyreltme hazırlayın.
    NOT: Adım 1.2'de açıklanan çözümler 2x etiketleme çözümleridir. Floresan boyalar içeren tüm çözümleri mümkün olduğunca ışıktan koruyun.
  3. Yapışık hücreleri bir kez 2 mL PBS ile yıkayın. 35 mm Petri kabına 1 ml fenol kırmızıiçermeyen kültür ortamı ekleyin. 8 kuyulu bir kaydırma için, toplam kuyu kapasitesinin 1/2'sine eşit bir hacim kullanın (örn. toplam kuyu kapasitesi 250 μL ise 125°L ekleyin).
  4. Adım 1,2 ila 35 mm Petri kabında hazırlanan 2x etiketleme çözeltisinin 1 mL'ini ekleyin. 8 kuyulu bir kaydırma için toplam kuyu kapasitesinin 1/2'sine eşit bir hacim kullanın. Hücreleri 30 dk 37 °C'de %5 CO2'ninaltında kuluçkaya yatırın.
    NOT: Daha uzun kuluçka nükleer DNA etiketleme neden olur, çünkü 1 saat daha uzun Süre SG etiketleme çözeltisi ile hücreleri kuluçkaya yatmayın.
  5. Floresan boyaları içeren ortamı dikkatlice aspire edin ve hücreleri pbs ile bir kez yıkayın.
  6. Fenol kırmızıiçermeyen hücre kültürü ortamı ekleyin ve hücreleri 37 °C'de bir CO2 kuluçka makinesinde karanlıkta tutun.
  7. Bir kuluçka ünitesi ile donatılmış bir SR-SIM mikroskop üzerinde görüntü canlı hücreleri (aşağıya bakın).

2. SR-SIM Görüntü Edinme

  1. Mikroskop aşamasına bir sahne üstü kuluçka makinesi töşekilde. İstediğinsıcaklığı ve CO2 konsantrasyonu (örneğin, 37 °C ve memeli hücreleri için %5) ayarlayın ve görüntü edinimi başlamadan önce en az 1 saat sıcak tutun.
  2. Lazerler de dahil olmak üzere SR-SIM mikroskobun tüm bileşenlerini açın ve en az 1 saat ısınmaya bırakın.
  3. Mikroskop üreticisi tarafından SR-SIM için önerilen yüksek büyütme, yüksek sayısal diyafram (NA) daldırma hedefi (örn. 100x 1,46 NA yağı) seçin.
  4. Kuluçka mikroskop aşamasına etiketli hücrelerle (adım 1.6'dan) odacıklı bir slayt veya 35 mm çanak tökerim.
  5. Tercihen oküler ile, örnek üzerinde ilgi alanı bulun. En iyi SR-SIM görüntüleme kalitesini elde etmek için, cama iyi bağlanmış hücreleri seçin.
  6. SR-SIM görüntüleri elde etmek için arkadan renkli üst düzey elektron çarpma yükü çiftli cihaz (EM-CCD) kamera kullanın.
  7. Görüntü edinme yazılımını kullanarak, kullanılan kamera için önerilen yüksek EM kazancını ayarlayın (örn. 300).
  8. Nükleoid izleme için zaman atlamalı seri elde etmeden önce, aynı görüş alanının iki renkli SR-SIM görüntüsünü elde edin: mitokondriyal boyama için bir kanal ve SG için başka bir kanal. Kullanılan mitokondriyal lekeye uygun ilk renk kanalını ayarlayın (örn. uzak kırmızı bir mitokondriyal leke için, uyarmayı 633 nm veya daha uzun ve 650 nm longpass emisyon filtresi olarak ayarlayın). SG sinyali için uyarma 488 nm ve 500-550 nm bandpass emisyon filtresi olarak ayarlayın.
  9. Yazılımı kullanarak, hem 488 nm hem de uzak kırmızı leke çizgileri için mümkün olan en düşük lazer gücünü ayarlayın.
    NOT: Tipik bir ayar bir acousto-optik ayarlanabilir filtre (AOTF) tarafından ayarlanmış% 1 lazer çıkış gücüdür.
  10. SIM mikroskop kanalları yalnızca sırayla (tek kameralı kurulum) elde ederse, uzak kırmızı leke algılama kanalını kapatın.
  11. Yazılımdaki Z yığını kutusunu açarak Z yığını edinisini kapatarak tek bir odak düzleminin edinimi ayarlayın.
  12. Mümkün olan en kısa EM-CCD kamera pozlama süresini ayarlayın.
  13. Beş döndürme yerine ızgaranın üç dönüşünü ayarlayın.
  14. Çerçeve hızını artırmak için, yazılımın Edinme sekmesinde, kamerayı verileri sadece kamera sensörünün merkezi alanından "Full Chip" yerine okuyacak şekilde ayarlayın.
    NOT: Örneğin, 1.000 x 1.000 piksellik bir alanın okunmasından sadece 256 x 256 pikselin okunmasına geçiş yapmak, kamera pozlama süresinin 50 ms'den 13,4 ms'e ve toplam kare süresinin 1,8 s'den 1,2 s'ye düşürülmesine olanak tanır. Kamera sensörünün yalnızca merkezi bir bölümü okunursa, görüş alanı genellikle SR-SIM için kullanılan 63x veya 100x hedefi için çok küçük olacaktır. Daha kısa bir pozlama süresi görüntülerin sinyal-gürültü oranını azaltacaktır.
  15. Lazer gücünü ve kamera maruz kalma süresini optimize edin: çeşitli lazer güç değerlerinde etiketli hücrelerin SR-SIM iki boyutlu (2D) görüntülerini edinin (örn. %0,5, %1, %1,5, %2) ve birkaç pozlama süreleri (örn. 13.4 ms, 25 ms, 50 ms).
  16. Ham SIM veri kümelerini işleme (bkz. adım 3.1).
  17. SIM işleme tarafından üretilen çok az veya hiç yapıtla mitokondride (yani nükleoidlerde) parlak noktalara sahip SIM görüntüler sağlayan lazer gücü ve kamera pozlama sürelerini seçin. Mitokondri dışındaki alanları inceleyin (örn. 488 nm katı hal lazerin %1 gücü ve EM-CCD kameranın 25 ms maruz ilerlediği).
  18. 2.15-2.17 adımlarında optimize edilen ayarları kullanarak zaman atlamalı serinin edinimini başlatın.

3. Veri İşleme ve Analizi

  1. Uygun bir yazılımın yapılandırılmış aydınlatma modülü(Tablo Malzemeler)ile ham SIM veri kümelerini işleme: SIM işleme parametreleri için Otomatik onay kutusunu seçin. Birden çok dosyanın otomatik olarak işlenmesi için toplu işleme aracını kullanın, Toplu İşlem için Akımı Kullan'ıseçin, Toplu İşİ Çalıştır'ı tıklatın ve SIM işleme için birden çok dosya seçin.
  2. SIM işlenmiş zaman serisi veri kümelerini Imaris dosya dönüştürücü yazılımı (yani Imaris yazılımının sürümüne karşılık gelen sürüm) ile IMS biçimine dönüştürün.
  3. Lineage (veya Track) modülü için lisansa sahip yazılımda (sürüm 8.4.1 veya sonraki sürüm) dönüştürülmüş bir dosya açın.
  4. Yeni Noktalar Ekle simgesini tıklatarak "Noktalar" oluşturma sihirbazını başlatın. Oluşturma sihirbazı başlatılacaktır.
  5. Sihirbazın Oluştur sekmesini seçin.
  6. Sihirbazın ilk adımında, Spotları İzleme'yi (zaman içinde) tıklatın ve sihirbazın ikinci adımına geçin.
  7. Tahmini XY Çapını 0,1-0,15 m'ye ayarlayın, Arka Plan Çıkarma'yı tıklatın ve üçüncü adıma geçin.
  8. Nükleoidlerin büyük bir kısmının "noktalar" olarak algılanması için histogramdaki dikey çizgiyi sürükleyerek filtredeki "Kalite" eşiğini ayarlayın, böylece yapılar algılanmaz (örn. algılanan noktalar görüntünün üzerine top olarak işaretlenir). Her karede böyle olup olmadığını kontrol edin ve gerekirse eşiği yeniden yeniden hazırlanın. Dördüncü ve sonra sihirbazın beşinci adıma geçin.
  9. Otomatik Regressif Hareket algoritmasını seçin. Max Mesafeyi 0,5 μm.'ye ayarlayın.
  10. Zaman serisindeki her çerçeveye bakın ve herhangi bir yanlış parça çizilip çizilmeip çizilmeip kullanılmadığını ve parçalar arasında herhangi bir boşluk açılıp kullanılmadığını kontrol edin (sihirbaz tarafından geçerli ayarlara sahip parçalar görüntünün üzerine konan çizgiler olarak anında işaretlenir). Gerekirse "Max Distance" ı ayarlayın. Büyücünün altıncı basamak devam edin. İzleme Süresi filtresini seçin ve 3-5 s'lik bir eşik ayarlayın.
  11. Şu anda algılanan noktalar veya parçalar en uygun değilse, noktalar veya parça oluşturma için herhangi bir parametreye ince ayar yapmak için gereken gezinti düğmelerini (sihirbaz penceresinin alt kısmında) kullanarak sihirbazın önceki adımlarına geri dön.
  12. İnce ayarlı parametreler yazılımın tüm noktaları algılamasına ve parçaları doğru bir şekilde oluşturmasına izin verdiğinde, parçaların oluşturulmasını onaylamak için sihirbazdaki yeşil ok gezinti düğmesini tıklatın.
  13. İstatistikler simgesi penceresini tıklatarak parçaların istatistiklerini ayıklayın. Gerekli istatistik parametrelerini (İstatistikleraltındaAyrıntılı ve Ortalama Değerler sekmeleri) seçin ve sayısallaştırma ve görselleştirme için Disket Sürücü simgesine tıklayarak değerleri csv dosyaları olarak dışa aktarın.
    NOT: Maksimum pist hızı, ortalama pist hızı, parça uzunluğu ve parça deplasmanı önemli parametrelere örnektir.
  14. Görüntü veri kümesinin sunulması veya yayınlanması gerekiyorsa, Anlık Görüntü veya Animasyon araçlarını kullanarak isteğe bağlı olarak yer alan parçalarla zaman atlamalı serisini temsil eden anlık görüntüler ve/veya video dosyaları oluşturun.

4. Konfokal Görüntü Edinimi

  1. Mikroskop aşamasına bir sahne üstü kuluçka makinesi takın, istenilen sıcaklığı ve CO2 konsantrasyonu (memeli hücreleri için 37 °C ve %5) ayarlayın ve görüntü edinmeye başlamadan önce en az 1 saat sıcak tutun.
  2. Lazerler de dahil olmak üzere bir konfokal lazer tarama mikroskobun tüm bileşenlerini açın ve en az 1 saat ısınmak için bırakın.
  3. Nyquist kriterlerine göre istenilen orta ve yüksek büyütme hedefi ve mekansal örnekleme seçin.
  4. SG kanalı için uyarma 488 nm ve 500-550 nm algılama aralığı ayarlayın. Mitokondriyal leke kanalı için, kırmızı boya için 561 nm ve 570-630 nm emisyon veya 633 nm uyarma ve uzak kırmızı boya için >650 nm emisyon ayarlayın.
  5. 700 mV PMT dedektör kazançları ile sinyallerin edinimi sağlayan mümkün olan en düşük lazer gücünü (genellikle %1 veya daha az) ayarlayın.
  6. Mitokondriyal nükleoidlerin "SG kanalında" tespit edildiği ve mitokondrilerin "kırmızı" veya "uzak kırmızı" kanalda algılandığı hücrelerin iki renkli konfokal görüntülerini edinin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Canlı hücre etiketlemesinin SG ile karakterizasyonu
İlk olarak, çeşitli seyreltmelerde boya ile kuluçka üzerine hücrelerde SG dağılımı konfokal mikroskopi ile karakterize edildi. SG veya picoGreen yüksek konsantrasyonlarda kuluçka sonra, her iki boya çoğunlukla çekirdekleri etiketli ve sitoplazmada bir punctate boyama gösterdi (Şekil 1), benzer başka bir pozitif yüklü siyanin boyası için yayınlanan veriler (yani, p...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokolün birkaç kritik bileşeni vardır: Mitokondriyal DNA'nın tercihli etiketlemesini sağlamak için, kuluçka sırasında DNA bağlayıcı boyakonsantrasyonu çok düşük tutulmalıdır (örn. tipik bir ticari stoğun 1:10.000 seyreltilmesi) ve kuluçka süresi 30 dakika olmalıdır. Kuluçka süresi asla 1 h.'yi geçmemelidir. diğer DNA bağlayıcı boyalar düşük konsantrasyonda etiketleme üzerine güçlü bir sinyal oluşturmak için yeterince parlak değildir.

Protokolümüz?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar Asifa Akhtar ve Angelika Rambold (hem Max Planck Enstitüsü İmmünobiyoloji ve Epigenetik için) HeLa hücreleri sağlamak için kabul.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Elyra PS1Carl Zeisssüper çözünürlüklü yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SR-SIM) için modül içeren çok modlu süper çözünürlüklü mikroskopYüksek
glikozlu DMEMGIBCO/ThermoFisher31966021
ibidi 35 mm çanak, cam tabanlıIbidi Gmbh81158
ibidi 8 kuyulu microSlide, cam tabanlıIbidi Gmbh80827
Imaris 8.4.1Bitplane/Oxford Instrumentsgörüntü işleme ve görselleştirme yazılım paketi
iXon 885Andor TechnologiesArkadan aydınlatmalı sensörlü EMCCD kamera
LSM880 AiryscanCarl Zeissdizi dedektörlü lazer taramalı konfokal mikroskop
Mitotracker CMXRos RedThermoFischerM7512kırmızı canlı hücreli mitokondriyal leke
Mitotracker Koyu Kırmızı FMThermoFischerM22426uzak kırmızı canlı hücre mitokondriyal leke
picoGreenThermoFischerP7581hücre permean DNA lekesi
Plan Apochromat 100x/1.46 Yağ objektifiCarl Zeiss
SYBR AltınThermoFischerS11494hücre permean DNA lekesi
Zen Black 2012 yazılımıCarl ZeissGörüntü Edinme ve İşleme Yazılımı

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kaufman, B. A., et al. The mitochondrial transcription factor TFAM coordinates the assembly of multiple DNA molecules into nucleoid-like structures. Molecular Biology of the Cell. 18 (9), 3225-3236 (2007).
  2. Farge, G., et al. Protein sliding and DNA denaturation are essential for DNA organization by human mitochondrial transcription factor A. Nature Communications. 3, 1013(2012).
  3. Bogenhagen, D. F. Mitochondrial DNA nucleoid structure. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (9-10), 914-920 (2012).
  4. Kang, D., Kim, S. H., Hamasaki, N. Mitochondrial transcription factor A (TFAM): roles in maintenance of mtDNA and cellular functions. Mitochondrion. 7 (1-2), 39-44 (2007).
  5. Tauber, J., et al. Distribution of mitochondrial nucleoids upon mitochondrial network fragmentation and network reintegration in HEPG2 cells. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (3), 593-603 (2013).
  6. Garrido, N., et al. Composition and dynamics of human mitochondrial nucleoids. Molecular Biology of the Cell. 14 (4), 1583-1596 (2003).
  7. Pernas, L., Scorrano, L. Mito-Morphosis: Mitochondrial Fusion, Fission, and Cristae Remodeling as Key Mediators of Cellular Function. Annual Review of Physiology. 78, 505-531 (2016).
  8. Caielli, S., et al. Oxidized mitochondrial nucleoids released by neutrophils drive type I interferon production in human lupus. Journal of Experimental Medicine. 213 (5), 697-713 (2016).
  9. Okayama, S., Ohta, K., Higashi, R., Nakamura, K. Correlative light and electron microscopic observation of mitochondrial DNA in mammalian cells by using focused-ion beam scanning electron microscopy. Microscopy (Oxf). 63 (Suppl 1), i35(2014).
  10. Alan, L., Spacek, T., Jezek, P. Delaunay algorithm and principal component analysis for 3D visualization of mitochondrial DNA nucleoids by Biplane FPALM/dSTORM. European Biophysics Journal. 45 (5), 443-461 (2016).
  11. Kukat, C., et al. Super-resolution microscopy reveals that mammalian mitochondrial nucleoids have a uniform size and frequently contain a single copy of mtDNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13534-13539 (2011).
  12. Kukat, C., Larsson, N. G. mtDNA makes a U-turn for the mitochondrial nucleoid. Trends in Cell Biology. 23 (9), 457-463 (2013).
  13. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  14. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  15. Benke, A., Manley, S. Live-cell dSTORM of cellular DNA based on direct DNA labeling. ChemBioChem. 13 (2), 298-301 (2012).
  16. Ishigaki, M., et al. STED super-resolution imaging of mitochondria labeled with TMRM in living cells. Mitochondrion. 28, 79-87 (2016).
  17. Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 15348(2015).
  18. Gustafsson, M. G., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).
  19. Hirano, Y., Matsuda, A., Hiraoka, Y. Recent advancements in structured-illumination microscopy toward live-cell imaging. Microscopy (Oxf). 64 (4), 237-249 (2015).
  20. Brown, T. A., et al. Superresolution fluorescence imaging of mitochondrial nucleoids reveals their spatial range, limits, and membrane interaction. Molecular and Cellular Biology. 31 (24), 4994-5010 (2011).
  21. Lewis, S. C., Uchiyama, L. F., Nunnari, J. ER-mitochondria contacts couple mtDNA synthesis with mitochondrial division in human cells. Science. 353 (6296), aaf5549(2016).
  22. Dellinger, M., Geze, M. Detection of mitochondrial DNA in living animal cells with fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 204 (Pt 3), 196-202 (2001).
  23. Ban-Ishihara, R., Ishihara, T., Sasaki, N., Mihara, K., Ishihara, N. Dynamics of nucleoid structure regulated by mitochondrial fission contributes to cristae reformation and release of cytochrome c. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11863-11868 (2013).
  24. Zurek-Biesiada, D., et al. Localization microscopy of DNA in situ using Vybrant((R)) DyeCycle Violet fluorescent probe: A new approach to study nuclear nanostructure at single molecule resolution. Experimental Cell Research. 343 (2), 97-106 (2016).
  25. He, J. Y., et al. The AAA(+) protein ATAD3 has displacement loop binding properties and is involved in mitochondrial nucleoid organization. Journal of Cell Biology. 176 (2), 141-146 (2007).
  26. Ashley, N., Harris, D., Poulton, J. Detection of mitochondrial DNA depletion in living human cells using PicoGreen staining. Experimental Cell Research. 303 (2), 432-446 (2005).
  27. Jevtic, V., Kindle, P., Avilov, S. V. SYBR Gold dye enables preferential labeling of mitochondrial nucleoids and their time-lapse imaging by structured illumination microscopy. PLoS One. 13 (9), e0203956(2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

BiyolojiSay 160mitokondriyal n kleoidmitokondriyal DNAasimetrik siyaninDNA floresan lekesiyap land r lm ayd nlatma mikroskobucanl h cre mikroskobu

Related Articles