Method Article

Dairesel bir RT-PCR tabanlı strateji kullanarak Maize mitochondrion 'da primer ve Işlenmiş transkriptlerin ayrımcılık ve haritalama

DOI:

10.3791/60019

⸱

July 29th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Conservation and Utilization of Subtropical Agro-Bioresources, South China Agricultural University, 2Guangdong Provincial Key Laboratory of Plant Molecular Breeding, College of Agriculture, South China Agricultural University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dairesel RT-PCR, nicel RT-PCR, RNA 5 ' polyphosphatase-Treatment ve Kuzey Blot 'u birleştirerek döngüsel bir RT-PCR tabanlı strateji sunuyoruz. Bu protokol dengesiz 5 ' trifosfat etkisini en aza indirmek için bir normalleştirme adım içerir, ve ayrımcılık ve, Mısır mitochondrion dengeli birikmiş birincil ve işlenmiş transkriptler haritalama için uygundur.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bitki mitokondri içinde, bazı sabit-devlet transkriptler 5 ' trifosfat transkripsiyon başlatma (primer transkript) türetilmiştir, diğerleri içeren ise 5 ' monofosfat Post-transcrip, oluşturulan (işlenmiş transkriptler). İki tür transkripti arasında ayrımcılık yapmak için çeşitli stratejiler geliştirilmiştir ve çoğu 5 ' trifosfat varlığı/yokluğunda bağlıdır. Ancak, primer 5 ' Termini 'de trifosfat kararsız, ve iki tür transkriptlerin net bir ayrımcılığı engelliyor. Mısır mitochondrion 'da stabil olarak birikmiş primer ve işlenmiş transkriptleri sistematik olarak ayırt etmek ve eşlemek için, CRT-PCR, RNA 5 ' polyphoshpatase tedavisi, nicel RT-PCR (RT-qPCR) ve Kuzey Blot. Bir gelişme olarak, bu strateji dengesiz 5 ' trifosfat etkisini en aza indirmek için bir RNA normalleştirme adımı içerir.

Bu protokolde, zenginleştirilmiş mitokondriyal RNA RNA 5 ' poliphosphataz tarafından önceden tedavi edilir, bu da 5 ' triphsophate 'yi monofosfata dönüştürür. Devre sonrası ve ters transkripsiyondan sonra, 5 ' poliphosphataz tedavi edilen ve tedavi edilmeyen Rnas 'dan türetilen iki cdnas, işlenmiş 5 ' uçtan ve 5 ' polyphosphataz 'a duyarsız olan, Mısır 26S olgun rRNA tarafından normalleştirilmiştir. Normalleştirme işleminden sonra, tedavi edilen ve işlenmeyen RNAs 'dan elde edilen cRT-PCR ve RT-qPCR ürünlerini karşılaştırarak birincil ve işlenen transkriptler ayrımcılık yapmaktadır. Transkripti Termini, cRT-PCR ürünlerinin klonlanması ve sıralanması ile belirlenir ve daha sonra Kuzey Blot tarafından doğrulanır.

Bu stratejiyi kullanarak, Mısır mitokondrion 'daki en kararlı durum transkriptleri belirlenmiştir. Bazı mitokondriyal genlerin karmaşık transkripti deseni nedeniyle, birkaç sabit devlet transkriptleri farklılaşmadı ve/veya eşleştirilmedi, ancak Kuzey Blot 'da tespit edildi. Biz bu stratejinin ayrımcılık ve diğer bitki mitokondri veya plastids sabit devlet transkriptler harita uygun olup olmadığından emin değiliz.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bitki mitokondri, birçok olgun ve habercisi Rnas birden fazla isoformlar olarak birikir ve sabit devlet transkriptler onların 5 ' uçları1,2,3farkı dayalı iki gruba bölünebilir, 4' ü yapın. Primer transkriptlerin 5 ' trifosfat sonu vardır, bu da transkripsiyon başlamasında elde edilir. Buna karşılık, işlenmiş transkriptler Post-transcriptional işleme tarafından oluşturulan 5 ' monofosfat var. İki tür transkripti ayrımcılık ve haritalama, arka plandaki moleküler mekanizmaların ortaya çıkarmak için önemlidir.

Plant ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Primer tasarım

  1. Astar tasarım17genel kurallarına dayalı PCR primer tasarım yazılımı (malzeme tablosu) kullanarak ters TRANSKRIPSIYON (RT) için gen-özel astar tasarımı.
    Not: RT astarlar hedef transkriptler için son derece özeldir, ve genellikle 5 ' (olgun mrnas ve habercisi Rnas), ya da ~ 500 – 600 NT beklenen 5 ' End (18s ve 26S rrnas) kodlama dizileri bir parçası üzerinde demirlemiş.
  2. CRT-PCR tarafından döngüsel transkriptleri yükseltmek için farklı astar çiftleri tasarım.
    Not: eşleştirilmiş farklı astarlar, döngüsel transkriptlerin 5 '-3 ' kavşağının üzerine gelmiştir ve pozisyonlar....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitokondriyal RNA döngülerleştirme verimliliğinin tahmini

Önceki bir çalışmada, Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) mitokondriyal transkript termını cRT-PCR haritalama için toplam ve mitokondriyal RNAs kullanılmıştır ve Rnas iki tür benzer haritalama sonuçları12verdi. Başlangıçta, aynı zamanda Mısır 'da mitokondriyal transkript Termini cRT-PCR haritalama için toplam RNAs .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Önceki bir çalışmada, Arabidopsis hücre süspansiyon kültüründen toplam ve mitokondrial Rnas CRT-PCR tarafından mitokondriyal transkript Termini harita için kullanılan ve benzer sonuçlar elde edildi12. Ancak, mitokondriyal transkript Termini 'nin diğer birçok çalışmada1,2,3,9eşleminde sadece zenginleştirilmiş mitokondriyal RNA kullanılmıştır. Mitokondriyal RNA 'n.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Çin Ulusal Doğal Bilim Vakfı (Grant No. 31600250, y), bilim ve teknoloji projeleri Guangzhou City (Grant No. 201804020015, H.N.) ve Çin tarımsal araştırma sistemi (Grant Hayır tarafından desteklenmektedir. ARABALAR-04-PS09, H.N.).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Asetik asitAladdin, ÇinA1128801x TAE tamponu hazırlamak için
Applied Biosystems 2720 Termal DöngüleyiciThermo Fisher Scientific, ABD4359659PCR amplifikasyonu için termal döngüleyici
Askorbik asitSigma-aldrich, ABDV900134Ekstraksiyon tamponunun hazırlanması için
Biowest AgaroseBiowest, İspanya9012-36-6PCR'yi çözmek için ürünler ve RNA'lar
Sığır serum albüminiSigma-aldrich, ABDA1933Ekstraksiyon tamponunun hazırlanması için
Bromofenol mavisiSigma-aldrich, ABDB8026Agaroz jel elektroforezi ve Northern blot DEPC için yükleme tamponunun hazırlanması için
Sigma-aldrich, ABDV900882RNase
DIG Northern başlangıç kitininRoche, ABD12039672910DIG-RNA etiketleme ve Kuzey lekesi için. Bu kit, RNA'nın DIG ve T7 RNA polimeraz ile transkripsiyon-etiketleme, hibridizasyon ve kemilüminesan tespiti için reaktifleri içerir.
EDTASigma-aldrich, ABDV900106Ekstraksiyon tamponu ve 1x TAE tamponunun hazırlanması için
EGTASigma-aldrich, ABDE3889Yıkama tamponunun hazırlanması için
Jel dokümantasyon sistemiBio-Rad, USAGel Doc XR+Agaroz jeli
GlycerolSigma-aldrich, USAG5516'yıiçin Agaroz jel elektroforezi için yükleme tamponunun hazırlanması için
Altın Görünüm II (5,000x)Solarbio,. ÇinG8142DNA boyama
Hybond-N +, Naylon membranAmersham Biosciences, ABDRPN119Northern blot
Image LabBio-Rad, USAImage Lab 3.0Image jel için ve PCR ürünlerinin bolluğunu karşılaştırın.
KH2PO4Sigma-aldrich, ABDV900041Ekstraksiyon tamponunun hazırlanması için
KOHAladdin, ÇinP112284Ekstraksiyon tamponu
L-sisteininSigma-aldrich, ABDV900399Ekstraksiyon tamponunun hazırlanması için
MillexMillipore, ABDSLHP033RBSteril ekstraksiyon ve Tamponları filtrasyon ile yıkayın
MiraclothCalbiochem, ABD475855-1RÖğütülmüş çekirdek dokularını filtrelemek için
MOPSSigma-aldrich, ABDV900306Northern blot NanoDrop için çalışma tamponunun hazırlanması için
ThermoFisher Scientific, ABD2000CRNA konsantrasyonu ve saflık testi için
NaOHSigma-aldrich, ABDV900797 Yıkama tamponunun hazırlanması
pEASY-Blunt basit klonlama vektörüTransGen Biotech, ÇinCB111Jel geri kazanılmış bandın klonlanması. Yerleştirme bölgesinin birkaç bps yukarısında bir T7 promotörü içerir.
Phanta max süper sadakatli DNA polimerazVazyme, ÇinPCR amplifikasyonu içinP505
Polivinilpirolidon 40Sigma-aldrich, ABDV900008Ekstraksiyon tamponunun hazırlanması için
Primer Premier 6.24PREMIER Biosoft, ABDPrimer Premier 6.24Ters transkripsiyon ve PCR amplifikasyonu için primerler tasarlamak PrimeScript
II ters transkriptazTakara, Japonya2690İlk iplikçik cDNA'sını sentezlemek için
PureLink RNA Mini kitiThermo Fisher Scientific, ABD12183025RNA saflaştırma
RNA 5' polifosfatazEpicentre, ABDRP8092H5' trifosfatı monofosfat
RNaz inhibitörüneNew England Biolabs, İngiltereM0314RNA kendi kendine ligasyon ve 5' polifosfataz tedavi reaksiyonlarının bir bileşenidir ve RNaz'ın aktivitesini inhibe etmek için kullanılır.
Sodyum asetatSigma-aldrich, ABDV900212çalışma tamponunun hazırlanması için
V90005820x SSC
SsoFas evaGreen süper karışımlarıBio-Rad, ABDRT-qPCR
T4 RNA Ligaz 1için 1725202 New England Biolabs, İngiltereM0437RNA daireselleştirme
için Tetrasodyum pirofosfatSigma-aldrich, ABD221368Ekstraksiyon tamponunun hazırlanması için
TIANgel midi saflaştırma kitiTiangen Biotech, ÇinDP209Agaroz jelden DNA parçalarını saflaştırmak için
TrisAladdin, ÇinT1106011x TAE tamponu
hazırlamak için TRIzol reaktifiInvitrogen, ABD15596026Mitokondiral RNA'yı çıkarmak için.
Evrensel DNA saflaştırma kitiTiangen Biotech, ÇinDP214Kısıtlama enzimi sindirim reaksiyonundan doğrusallaştırılmış plastmidleri geri kazanmak için
Ksilen siyanol FFSigma-aldrich, ABDX4126Agaroz jel elektroforezi için yükleme tamponunun hazırlanması için
devre dışı bırakılması görüntülemek hazırlanması için DNA polimeraz dönüştürmek için Northern blot Sodyum klorür Sigma-aldrich, ABD için hazırlamak için

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhang, Y., et al. Major contribution of transcription initiation to 5'-end formation of mitochondrial steady-state transcripts in maize. RNA Biology. 16 (1), 104-117 (2019).
  2. Choi, B. Y., Acero, M. M., Bonen, L.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Circular RT PCRRNA 5 PolyphosphataseMitochondrial RNA ExtractionQuantitative RT PCRNorthern BlotMaize MitochondrionTermini MappingPrimary Processed TranscriptsRNA NormalizationDivergent Primers

Related Articles