Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Dairesel bir RT-PCR tabanlı strateji kullanarak Maize mitochondrion 'da primer ve Işlenmiş transkriptlerin ayrımcılık ve haritalama

5.6K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/60019

⸱

29 Temmuz 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Conservation and Utilization of Subtropical Agro-Bioresources, South China Agricultural University, 2Guangdong Provincial Key Laboratory of Plant Molecular Breeding, College of Agriculture, South China Agricultural University

Bu makalede

Özet

Dairesel RT-PCR, nicel RT-PCR, RNA 5 ' polyphosphatase-Treatment ve Kuzey Blot 'u birleştirerek döngüsel bir RT-PCR tabanlı strateji sunuyoruz. Bu protokol dengesiz 5 ' trifosfat etkisini en aza indirmek için bir normalleştirme adım içerir, ve ayrımcılık ve, Mısır mitochondrion dengeli birikmiş birincil ve işlenmiş transkriptler haritalama için uygundur.

Özet

Bitki mitokondri içinde, bazı sabit-devlet transkriptler 5 ' trifosfat transkripsiyon başlatma (primer transkript) türetilmiştir, diğerleri içeren ise 5 ' monofosfat Post-transcrip, oluşturulan (işlenmiş transkriptler). İki tür transkripti arasında ayrımcılık yapmak için çeşitli stratejiler geliştirilmiştir ve çoğu 5 ' trifosfat varlığı/yokluğunda bağlıdır. Ancak, primer 5 ' Termini 'de trifosfat kararsız, ve iki tür transkriptlerin net bir ayrımcılığı engelliyor. Mısır mitochondrion 'da stabil olarak birikmiş primer ve işlenmiş transkriptleri sistematik olarak ayırt etmek ve eşlemek için, CRT-PCR, RNA 5 ' polyphoshpatase tedavisi, nicel RT-PCR (RT-qPCR) ve Kuzey Blot. Bir gelişme olarak, bu strateji dengesiz 5 ' trifosfat etkisini en aza indirmek için bir RNA normalleştirme adımı içerir.

Bu protokolde, zenginleştirilmiş mitokondriyal RNA RNA 5 ' poliphosphataz tarafından önceden tedavi edilir, bu da 5 ' triphsophate 'yi monofosfata dönüştürür. Devre sonrası ve ters transkripsiyondan sonra, 5 ' poliphosphataz tedavi edilen ve tedavi edilmeyen Rnas 'dan türetilen iki cdnas, işlenmiş 5 ' uçtan ve 5 ' polyphosphataz 'a duyarsız olan, Mısır 26S olgun rRNA tarafından normalleştirilmiştir. Normalleştirme işleminden sonra, tedavi edilen ve işlenmeyen RNAs 'dan elde edilen cRT-PCR ve RT-qPCR ürünlerini karşılaştırarak birincil ve işlenen transkriptler ayrımcılık yapmaktadır. Transkripti Termini, cRT-PCR ürünlerinin klonlanması ve sıralanması ile belirlenir ve daha sonra Kuzey Blot tarafından doğrulanır.

Bu stratejiyi kullanarak, Mısır mitokondrion 'daki en kararlı durum transkriptleri belirlenmiştir. Bazı mitokondriyal genlerin karmaşık transkripti deseni nedeniyle, birkaç sabit devlet transkriptleri farklılaşmadı ve/veya eşleştirilmedi, ancak Kuzey Blot 'da tespit edildi. Biz bu stratejinin ayrımcılık ve diğer bitki mitokondri veya plastids sabit devlet transkriptler harita uygun olup olmadığından emin değiliz.

Giriş

Bitki mitokondri, birçok olgun ve habercisi Rnas birden fazla isoformlar olarak birikir ve sabit devlet transkriptler onların 5 ' uçları1,2,3farkı dayalı iki gruba bölünebilir, 4' ü yapın. Primer transkriptlerin 5 ' trifosfat sonu vardır, bu da transkripsiyon başlamasında elde edilir. Buna karşılık, işlenmiş transkriptler Post-transcriptional işleme tarafından oluşturulan 5 ' monofosfat var. İki tür transkripti ayrımcılık ve haritalama, arka plandaki moleküler mekanizmaların ortaya çıkarmak için önemlidir.

Plant mitochondrion 'daki primer ve işlenmiş transkriptler arasında ayrım yapmak için dört büyük strateji geliştirilmiştir. İlk strateji mitokondriyal RNAs 'ı tütün asidi pirofosfataz (TAP) ile ön tedavi etmektir, bu da 5 ' trifosfat 'i monofosoza dönüştüren ve primer transkriptlerin RNA ligaz ile devre altında olmasını sağlar. Musluk tedavisi ve tedavi edilmeyen RNA örneklerinin transkript fazlalıkları daha sonra cDNA bitleri (yarış) veya dairesel RT-PCR (cRT-PCR)2,3,4hızlı amplifikasyon ile karşılaştırılır. İkinci stratejide, işlenen transkriptler öncelikle Terminator 5 '-fosfat bağımlı eksonükleaz (Tex) kullanarak mitokondriyal Rnas 'dan tükeniyor ve sol primer transkriptler daha sonra primer uzatma Analizi5,6 ile eşleştirilir . Üçüncü strateji Guanil transferase kullanarak birincil transkriptler ön Cap için, ve daha sonra trifosfatla 5 ' Termini konumu ile birlikte ribonükleaz veya S1 nükleaz koruma analizi ile primer uzatma tarafından belirlenir7,8 ,9. 5 ' trifosfat varlığı/yokluğunda bağlı olandan farklı, dördüncü strateji içinde vitro transkripsiyon birleştirir, site-yönlendirilmiş mutagenesis, ve primer uzatma Analizi sözde Rehberleri karakterize ve transkripsiyon belirlemek başlatma siteleri8,10,11. Bu stratejileri kullanarak, bitki mitokondri içinde birçok primer ve işlenmiş transkriptler belirlendi.

Ancak, birkaç çalışmada birincil transkriptlerin 5 ' trifosfat kararsız olduğunu bildirdi ve kolayca bilinmeyen nedeni2,4,12,13için monofosfat dönüştürülmüştür. Bu sorun, 5 ' trifosfat varlığı/yokluğunda bağlı teknikleri kullanarak transkriptler iki tür net bir ayrımcılık engeller ve önceki çabaları sistematik olarak bitki primer ve işlenmiş transkriptler arasında ayrımcılık için Mitochondri2,12başarısız oldu.

Bu protokolde, cRT-PCR, RNA 5 ' polyphosphatase tedavisi, RT-qPCR ve Kuzey leke 'ı, Mısır (Zea mays) mitokondrion (Şekil 1) ' de stabil olarak birikmiş primer ve işlenmiş transkriptleri sistematik olarak ayırt etmek için birleştiriyoruz. cRT-PCR RNA molekülü 5 ' ve 3 ' ekstremite eşzamanlı haritalama sağlar ve genellikle bitkiler2,12,14,15harita transkript Termini adapte edilir. RNA 5 ' polyphosphataz, trifosfatlar 5 ' Termini 'den iki fosfatı kaldırabilir ve bu da birincil transkriptlerin RNA ligaz tarafından Self-ligasyon için kullanılabilir olmasını sağlar. Önceki çalışmalar, Mısır 'da olgun 26S rRNA 5 ' Terminus işlenmiş olduğunu gösterdi ve RNA 5 ' polyphosphatase1,16duyarsız oldu. Primer 5 ' Termini 'de kararsız trifosfat etkisini en aza indirmek için, 5 ' poliphosphataz tedavi edilen ve tedavi edilmeyen RNAs olgun 26S rRNA tarafından normalleştirilmiş, ve birincil ve işlenmiş transkriptler daha sonra karşılaştırarak farklılaşmış iki RNA örneğinden elde edilen cRT-PCR ürünleri. CRT-PCR haritalama ve ayrımcılık sonuçları Kuzey leke ve RT-qPCR tarafından sırasıyla doğrulanır. Son olarak, alternatif astar Kuzey leke ancak cRT-PCR tarafından algılanan Bu transkriptler yükseltmek için kullanılır. Bu cRT-PCR tabanlı stratejiyi kullanarak, Mısır mitokondri en kararlı durum transkriptler ayırt edilmiş ve1eşleştirilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Primer tasarım

  1. Astar tasarım17genel kurallarına dayalı PCR primer tasarım yazılımı (malzeme tablosu) kullanarak ters TRANSKRIPSIYON (RT) için gen-özel astar tasarımı.
    Not: RT astarlar hedef transkriptler için son derece özeldir, ve genellikle 5 ' (olgun mrnas ve habercisi Rnas), ya da ~ 500 – 600 NT beklenen 5 ' End (18s ve 26S rrnas) kodlama dizileri bir parçası üzerinde demirlemiş.
  2. CRT-PCR tarafından döngüsel transkriptleri yükseltmek için farklı astar çiftleri tasarım.
    Not: eşleştirilmiş farklı astarlar, döngüsel transkriptlerin 5 '-3 ' kavşağının üzerine gelmiştir ve pozisyonları analiz edilen hedef transkriptler arasında farklılık gösterir (Şekil S1). Bazı transkriptler uzun UTRs vardır; Örneğin, nad2-1 5 ' UTR ve rps4-1 3 ' UTR, sırasıyla1, 1.985 ve 1826/1834 NT 'dir. Her iki astarlar kodlama bölgesinde bağlantılı ise, hedef transkriptleri yükseltmek zor olacaktır. Buna karşılık, bazı UTRs kısa; Örneğin, 3 ' UTRs nad2-1 ve nad4-1 34/35 ve 29 – 31 NT, sırasıyla1' dir. Eşleştirilmiş astar kodlama dizilerinden uzakta bulunuyorsa, PCR başarısız olur. Genellikle, iki çift farklı astar her hedef transkripti için tasarlanmıştır, birden fazla çifti olan transkript desenleri karmaşık ve/veya utrs çok uzun olduğunu eşlemek için gerekli olabilir.
  3. Kuzey Blot için RNA probları hazırlamak için yakınsak astar çiftleri tasarım.
    Not: Eşleştirilmiş astarlar hedef genin kodlama bölgesinde yer alır ve PCR ürününün büyüklüğü 100 ila 1.000 BP aralığında olmalıdır. Her ileri astar elde edilen problar vektör dizileri en aza indirmek için bir kısıtlama enzim sitesi içermelidir.

2. Mısır 'dan ham Mitokondrion hazırlanması çekirdekleri geliştirme

  1. Dezenfekte, havan topları, cam hunileri, tüpler ve otoklav ile ipuçları sterilize ve fırında kurutun.
  2. 4 °C ' de veya buzda tüm prosedürleri gerçekleştirin ve tüm çözümleri önceden soğutun.
  3. Hazırlamak 100 mL ekstraksiyon tampon (EB), 0,3 M sucrose, 5 mM Tetrasodyum pirofosfat, 10 mM KH2Po4, 2 mm EDTA,% 1 [w/v] polyvinylpyrrolidone 40,% 1 [w/v] Sığır serum albumin, 5 mm L-sistein ve 20 mm askorbik asit oluşur. KOH ile pH 7,3 ayarlayın ve filtrasyon ile sterilize.
  4. Hazırlamak 100 mL yıkama tampon (WB) oluşan 0,3 M sakaroz, 1 mM EGTA, ve 10 mM MOPS (3-(N-morpholino) propanesulfonik asit). NaOH ile pH 7,2 ayarlayın ve filtrasyon ile sterilize.
    Not: Bu EB ve WB hazırlamak için tavsiye edilir DEPC-tedavi deiyonize H2O kullanarak.
  5. 20 g gelişmekte olan çekirdekleri 11 – 20 gün sonra pollinasyon (DAP) bir 50-mL tüp buzun üzerine yerleştirilir ve daha sonra önceden soğutmalı havan topları için çekirdekler transfer toplayın.
    Not: Bir oranı kullanın 100 mL EB için 20 g mısır çekirdekleri.
  6. Her harç için 10 – 20 mL buz soğuk EB ekleyin ve çekirdekleri tamamen öğütün.
  7. Daha fazla EB ekleyin ve iki katman filtre bezi (malzeme tablosu) ile zemin dokularına filtre uygulayın.
  8. Süzgeci 8.000 x g 'de 10 dakika Santrifüjden çıkarın ve Pelet atın.
  9. Yeni bir tüp için süpernatant transfer ve 10 dakika için 20.000 x g santrifüj.
  10. Supernatant dökmek ve 6 ml içinde Pelet pelletini WB.
  11. Beş 1,5 mL RNase-Free borular için süspansiyon aliquot ve 5 dakika için 14.000 x g onları santrifüjler.
  12. Supernatant atın, sıvı azot mitokondriyal peleti dondurmak, ve mağaza-80 °C.

3. mitokondriyal RNA ekstraksiyonu

  1. İmalatın talimatlarına göre bir ticari reaktif (malzeme tablosu) ile mitokondriyal RNA ayıklayın.
    Dikkat: Bu reaktif fenol ve guanidin isothiocyanate içerir. Bir duman kaputu ile çalışmak ve laboratuar ceket ve eldiven giymek.
  2. Yalıtılmış mitokondriyal RNA 'nın DEPC-tedavi edilmiş deiyonize H2O 'da çözülür ve RNA konsantrasyonu ve saflığını spektrofotometre (malzeme tablosu) ile tahmin edin.
    Not: Genellikle, ~ 250 μg mitokondrial RNA 20 g 15-DAP mısır çekirdekleri elde edilir.
  3. 1 adet Tae tampondan oluşan bir agaroz jel hazırlayın (40 mm Tris, 20 mm asetik asit, 1mm EDTA), 1,5% agaroz (malzeme tablosu) ve 1x nükleer boyama boyası (malzeme tablosu).
  4. Uygun bir hacim eklemek 10X yükleme tampon (0,5% bromophenol mavi, 0,5% ksilen cyanol FF, ve 50% gliserol), ve yük mitokondrial RNA/yükleme tampon karışımı% 1,5 agaroz jel.
  5. Jeli 20 – 25 dakika boyunca 5 – 6 V/cm olarak 1x TAE tampon olarak çalıştırın ve jel dokümantasyon sistemi (malzeme tablosu) ile jelin görüntülenmesi ile mitokondriyal RNA bütünlüğünü değerlendir.
    Not: İki ayrı bandın varlığı (~ 3.510 ve ~ 1.970 NT Mısır mitokondrial 26S ve 18s rrnas için, sırasıyla) bozulmamış mitokondriyal RNA için kabul edilebilir bir standarttır. Olası bozulması dışlamak için, RNA bütünlüğü (Şekil 2) ' nin birden çok basamakları sırasında incelenmelidir.

4. RNA 5 ' Polyphosphatase tedavisi

  1. RNA 5 ' poliphosphataz (masa ve malzeme) tedavisi (Tablo 1) ayarlayın ve 37 °c ' de 30 – 60 dakika boyunca inküye yapın.
  2. Üreticinin talimatlarına uygun olarak bir RNA arıtma kiti (malzeme tablosu) ile 5 ' poliphosphataz tedavi RNA kurtar.
  3. 3,3 ile 3,5 arasındaki adımları yineleyin.

5. RNA Döngülerleştirme

  1. Aynı miktarlarda 5 ' poliphosphataz tedavi edilen ve tedavi edilmeyen mitokondriyal RNAs (Tablo 2) kullanarak iki adet döngüye reaksiyon hazırlayın ve 16 °c ' de her iki reaksiyonu 12 – 16 h için kuluçk.
  2. 4,2 adımda olduğu gibi aynı kiti kullanarak Self-birleştirilmiş RNAs iki kümesini kurtarın.
    Not: Mitokondriyal RNA 'nın sadece bir kısmını kendinden bağlanacak ve kurtarılan RNA 'nın doğrusal ve dairesel transkriptlerin karışımı olacağını unutulmamalıdır.
  3. 3,3 ile 3,5 arasındaki adımları yineleyin.

6. Ters transkripsiyon

  1. İki adet cDNAs kümesini, aynı miktardaki 5 ' poliphosphataz tedavi edilmiş ve tedavi edilmeyen RNAs (200 ng) ile sentezler.
  2. 26S-CRT ve 7 diğer RT astar eşit oranı ekleyerek bir astar karışımı hazırlayın.
    Not: Primer karışımı son konsantrasyon 1 μM olmalıdır.
  3. Tablo 3' te listelenen reaktifleri birleştirerek iki ön karışımı hazırlayın, 65 °c ' de 5 dakika boyunca Inküye yapın ve ardından 2 dakika boyunca buzda rahatlayın.
  4. İki RT reaksiyon sistemini (Tablo 4) birleştirin ve 42 °c ' de 50 dk. boyunca onları inkübe edin.
  5. 5 dakika için 70 °C ' de RT reaksiyonları ısı, ve sonra buzda onları Chill.

7. normalleştirme

  1. 5 ' poliphosphataz tedavi edilen veya tedavi edilmeyen RNAs 'dan türetilen şablon cDNAs 'ın aynı hacmini ekleyerek iki PCR reaksiyonu hazırlayın (örneğin, 26S-CF1 ve-CR1), vb. (Tablo 5), 5 '-3 ' ' ten oluşan 2,5 ' '-üç ' Kavşağı çevreliyor.
  2. Tablo 6' da açıklanan koşullar altında bir termal bisikletçi (malzeme tablosu) iki reaksiyon çalıştırın.
  3. 1 adet Tae tampondan oluşan bir agaroz jel,% 1,0 agaroz ve 1x nükleer boyama boyası hazırlayın.
  4. İki PCR ürünlerinin her biri için 2 μL 10X yükleme tamponu (% 0,5 bromophenol mavisi,% 0,5 ksilen cyanol FF ve% 50 gliserol) ekleyin ve jel üzerine yükleyin.
  5. 5 – 6 V/cm, 30 – 40 dakika için 1x TAE tampon olarak jel çalıştırın ve adım 3,5 olarak aynı jel dokümantasyon sistemi kullanarak görüntü.
  6. Bilgisayar yazılımı (malzeme tablosu, Şekil 4A) kullanarak iki PCR ürünlerinin bolluk karşılaştırın ve gerekirse şablon cdnas tutarları değiştirerek normalleştirme optimize.

8. PCR amplifikasyon

  1. Normalleştirilmiş cDNAs 'ın uygun hacmini ve hedef transkriptların 5 '-3 ' kavşağının (Tablo 7) çevrelerine göre bir çift farklı astar ekleyerek PCR reaksiyonları çiftleri hazırlayın.
    Not: Hedef transkriptlerin PCR amplifikasyonu için kullanılan şablon cDNAs miktarı, 26S rRNA normalleştirme sonuçları tarafından belirlenir.
  2. Tablo 8' de açıklanan programa göre PCR reaksiyonları gerçekleştirin.
  3. 7,3 ile 7,5 arasındaki adımları yineleyin.
  4. İç içe geçmiş farklı astarlara değiştirin ve 8,1 ve 8,2 adımları yineleyerek ilk yuvarlak PCR sonuçlarını doğrulayın.
  5. 7,3 ile 7,5 arasındaki adımları yineleyin.
  6. Bir jel DNA kurtarma kiti (malzeme tablosu) kullanılarak ıkı Tur PCR amplifikasyonunda tekrarlanabilebilen belirgin bantları kurtarın.

9. transkript Termini 'nin belirlenmesi

  1. Jel-saflaştırılmış PCR ürünlerini standart teknikleri kullanarak bir künt-End vektörüne (malzeme tablosu) klonlayın.
  2. Hedef ekler içeren pozitif klonlar seçmek için koloni PCR gerçekleştirin ve bunları ticari olarak sıralı.
    Not: Değişken büyüklükte ekler içeren pozitif klonlar genellikle tek bir kurtarılmış bant tespit edilir, çünkü bitki mitokondrial birçok istikrarlı durum transkriptler heterojen vardır 5 ' ve/veya 3 ' Ends1,12.
  3. Biyoteknoloji bilgileri (NCBı) için ulusal merkezin temel yerel hizalama arama aracını (BLAST) kullanarak sıralama verilerini Mısır mitokondriyal genomla hizalayın. Organizma "Mısır (TaxID: 4577)" ve arama veritabanı "Nüklotid koleksiyonu (NR/NT)" seçin.
  4. , 5 '-3 ' kavşağının döngüsel transkript bulmak ve 5 ' ve 3 ' transkript Termini konumlarını belirlemek.
  5. Hedef transkriptleri boyutunu hesaplayın.

10. RNA jel Blot hybridization tarafından cRT-PCR haritalama sonuçlarının doğrulanması

Not: RNA jel leke hibridizasyon, digoxigenin (DIG) ve T7 RNA polimeraz, hybridizasyon ve immünolojik algılama ile RNA 'nın transkripsiyon-etiketleme için reaktifleri içeren ticari bir Kit (malzeme tablosu) kullanılarak gerçekleştirilir. Daha fazla ayrıntı için lütfen bu kit 'te sağlanan protokollere bakın. Tüm prosedür için sadece RNase ücretsiz ekipmanların kullanıldığını emin olun.

  1. RNA prob hazırlamak için kullanılan DNA parçasını yükseltmek ve adım 9,1 gibi aynı vektör klonlama, bir T7 Organizatör içerir 17 BP ekleme sitenin upstream.
  2. Doğru kısıtlama enzim kullanarak yapı Linearize, bir DNA arıtma kiti (malzeme tablosu) ile doğrılaşmış Plasmid kurtarmak ve depc-tedavi deiyonize H2o çözülür.
  3. Üreticinin talimatlarına göre, ticari bir Kit (malzeme tablosu) ile DIG-11-UTP ' ı Ile etiket RNA probları.
  4. Hazırlamak 500 mL 10X MOPS tampon (0,2 M MOPS, 50 mM sodyum asetat, ve 10 mM EDTA) kullanarak DEPC-deiyonize H27,0 O
  5. 3.1 – 3.3 adımda hazırlanan mitokondriyal RNA 'ya 2 – 3 hacim yükleme tamponu (50% Formamid,% 6,2 formaldehit, 1x MOPS,% 10 gliserol ve% 0,1 bromophenol Mavisi) ekleyin.
  6. RNA örnek/yükleme tampon karışımını 65 °C ' de 10 dakika boyunca deninin ve sonra buz üzerinde 1 dakika dinlenin.
  7. Denatüre agaroz jel hazırlayın (% 2 formaldehit, 1,2% agaroz ve 1x Mops) ve RNA numune/yükleme tampon karışımından jel (1 – 2 μg mitokondriyal RNA başına) yükleyin.
  8. Jel 1x MOPS içinde 3 – 4 V/cm ~ 4 h için çalıştırın.
  9. Hazırlamak 2 L 20X SSC (3 M NaCl, 0,3 M sodyum sitrat, pH 7,0). Bir gecede% 0,1 DEPC ile Treat ve otoklav ile sterilize.
  10. Jeli 20X SSC 'de iki kez durulayın (her seferinde 15 dk) ve jel RNA 'sını, 10 – 16 h için 20 x SSC ile kapiller transferiyle bir naylon membranda (malzeme tablosu) aktarın.
  11. 120 °C ' de 30 dakika pişirerek RNA 'ya membran düzelt.
  12. Üreticinin talimatlarına göre, ticari bir Kit (malzeme tablosu) ile RNA hybridizasyon ve immünolojik algılama gerçekleştirin.

11. Primer ve Işlenmiş 5 ' sonların ayrımcılık

  1. Normalleştirilmiş 5 ' poliphosphataz tedavi edilen ve tedavi edilmeyen RNAs 'dan elde edilen cRT-PCR ürünlerini karşılaştırarak primer ve işlenmiş 5 ' uçları ayrımcılık yapın.
    Not: Primer transkriptler için, 5 ' poliphosphataz tedavi RNA 'dan gelen PCR ürünlerinin bolluğu, tedavi edilmemiş mevkidaşından çok daha yüksektir (Şekil 1, ' Gen A, ' ve Şekil 4A). Ancak, işlenmiş transkriptler için, benzer bir düzeyde PCR ürünleri mitokondriyal RNAs iki kümelerinden amplifikasyonu olacaktır (Şekil 1, ' gene B ').
  2. CRT-PCR eşleme sonuçlarına dayalı RT-qPCR astar tasarımları.
  3. CRT-PCR ayrımcılık sonuçlarını RT-qPCR tarafından doğrulayın.
    Not: 5 ' poliphosphataz tedavi edilen ve tedavi edilmeyen RNAs 'dan türetilen iki cDNA örneği, 26S olgun rRNA 'nın RT-qPCR ürünleri tarafından normalleştirilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Mitokondriyal RNA döngülerleştirme verimliliğinin tahmini

Önceki bir çalışmada, Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) mitokondriyal transkript termını cRT-PCR haritalama için toplam ve mitokondriyal RNAs kullanılmıştır ve Rnas iki tür benzer haritalama sonuçları12verdi. Başlangıçta, aynı zamanda Mısır 'da mitokondriyal transkript Termini cRT-PCR haritalama için toplam RNAs ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Önceki bir çalışmada, Arabidopsis hücre süspansiyon kültüründen toplam ve mitokondrial Rnas CRT-PCR tarafından mitokondriyal transkript Termini harita için kullanılan ve benzer sonuçlar elde edildi12. Ancak, mitokondriyal transkript Termini 'nin diğer birçok çalışmada1,2,3,9eşleminde sadece zenginleştirilmiş mitokondriyal RNA kullanılmıştır. Mitokondriyal RNA 'n...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Teşekkürler

Bu çalışma Çin Ulusal Doğal Bilim Vakfı (Grant No. 31600250, y), bilim ve teknoloji projeleri Guangzhou City (Grant No. 201804020015, H.N.) ve Çin tarımsal araştırma sistemi (Grant Hayır tarafından desteklenmektedir. ARABALAR-04-PS09, H.N.).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Asetik asitAladdin, ÇinA1128801x TAE tamponu hazırlamak için
Applied Biosystems 2720 Termal DöngüleyiciThermo Fisher Scientific, ABD4359659PCR amplifikasyonu için termal döngüleyici
Askorbik asitSigma-aldrich, ABDV900134Ekstraksiyon tamponunun hazırlanması için
Biowest AgaroseBiowest, İspanya9012-36-6PCR'yi çözmek için ürünler ve RNA'lar
Sığır serum albüminiSigma-aldrich, ABDA1933Ekstraksiyon tamponunun hazırlanması için
Bromofenol mavisiSigma-aldrich, ABDB8026Agaroz jel elektroforezi ve Northern blot DEPC için yükleme tamponunun hazırlanması için
Sigma-aldrich, ABDV900882RNase
DIG Northern başlangıç kitininRoche, ABD12039672910DIG-RNA etiketleme ve Kuzey lekesi için. Bu kit, RNA'nın DIG ve T7 RNA polimeraz ile transkripsiyon-etiketleme, hibridizasyon ve kemilüminesan tespiti için reaktifleri içerir.
EDTASigma-aldrich, ABDV900106Ekstraksiyon tamponu ve 1x TAE tamponunun hazırlanması için
EGTASigma-aldrich, ABDE3889Yıkama tamponunun hazırlanması için
Jel dokümantasyon sistemiBio-Rad, USAGel Doc XR+Agaroz jeli
GlycerolSigma-aldrich, USAG5516'yıiçin Agaroz jel elektroforezi için yükleme tamponunun hazırlanması için
Altın Görünüm II (5,000x)Solarbio,. ÇinG8142DNA boyama
Hybond-N +, Naylon membranAmersham Biosciences, ABDRPN119Northern blot
Image LabBio-Rad, USAImage Lab 3.0Image jel için ve PCR ürünlerinin bolluğunu karşılaştırın.
KH2PO4Sigma-aldrich, ABDV900041Ekstraksiyon tamponunun hazırlanması için
KOHAladdin, ÇinP112284Ekstraksiyon tamponu
L-sisteininSigma-aldrich, ABDV900399Ekstraksiyon tamponunun hazırlanması için
MillexMillipore, ABDSLHP033RBSteril ekstraksiyon ve Tamponları filtrasyon ile yıkayın
MiraclothCalbiochem, ABD475855-1RÖğütülmüş çekirdek dokularını filtrelemek için
MOPSSigma-aldrich, ABDV900306Northern blot NanoDrop için çalışma tamponunun hazırlanması için
ThermoFisher Scientific, ABD2000CRNA konsantrasyonu ve saflık testi için
NaOHSigma-aldrich, ABDV900797 Yıkama tamponunun hazırlanması
pEASY-Blunt basit klonlama vektörüTransGen Biotech, ÇinCB111Jel geri kazanılmış bandın klonlanması. Yerleştirme bölgesinin birkaç bps yukarısında bir T7 promotörü içerir.
Phanta max süper sadakatli DNA polimerazVazyme, ÇinPCR amplifikasyonu içinP505
Polivinilpirolidon 40Sigma-aldrich, ABDV900008Ekstraksiyon tamponunun hazırlanması için
Primer Premier 6.24PREMIER Biosoft, ABDPrimer Premier 6.24Ters transkripsiyon ve PCR amplifikasyonu için primerler tasarlamak PrimeScript
II ters transkriptazTakara, Japonya2690İlk iplikçik cDNA'sını sentezlemek için
PureLink RNA Mini kitiThermo Fisher Scientific, ABD12183025RNA saflaştırma
RNA 5' polifosfatazEpicentre, ABDRP8092H5' trifosfatı monofosfat
RNaz inhibitörüneNew England Biolabs, İngiltereM0314RNA kendi kendine ligasyon ve 5' polifosfataz tedavi reaksiyonlarının bir bileşenidir ve RNaz'ın aktivitesini inhibe etmek için kullanılır.
Sodyum asetatSigma-aldrich, ABDV900212çalışma tamponunun hazırlanması için
V90005820x SSC
SsoFas evaGreen süper karışımlarıBio-Rad, ABDRT-qPCR
T4 RNA Ligaz 1için 1725202 New England Biolabs, İngiltereM0437RNA daireselleştirme
için Tetrasodyum pirofosfatSigma-aldrich, ABD221368Ekstraksiyon tamponunun hazırlanması için
TIANgel midi saflaştırma kitiTiangen Biotech, ÇinDP209Agaroz jelden DNA parçalarını saflaştırmak için
TrisAladdin, ÇinT1106011x TAE tamponu
hazırlamak için TRIzol reaktifiInvitrogen, ABD15596026Mitokondiral RNA'yı çıkarmak için.
Evrensel DNA saflaştırma kitiTiangen Biotech, ÇinDP214Kısıtlama enzimi sindirim reaksiyonundan doğrusallaştırılmış plastmidleri geri kazanmak için
Ksilen siyanol FFSigma-aldrich, ABDX4126Agaroz jel elektroforezi için yükleme tamponunun hazırlanması için
devre dışı bırakılması görüntülemek hazırlanması için DNA polimeraz dönüştürmek için Northern blot Sodyum klorür Sigma-aldrich, ABD için hazırlamak için

Kaynaklar

  1. Zhang, Y., et al. Major contribution of transcription initiation to 5'-end formation of mitochondrial steady-state transcripts in maize. RNA Biology. 16 (1), 104-117 (2019).
  2. Choi, B. Y., Acero, M. M., Bonen, L. Mapping of wheat mitochondrial mRNA termini and comparison with breakpoints in DNA homology among plants. Plant Molecular Biology. 80 (4-5), 539-552 (2012).
  3. Calixte, S., Bonen, L. Developmentally-specific transcripts from the ccmFN-rps1 locus in wheat mitochondria. Molecular Genetics and Genomics. 280 (5), 419-426 (2008).
  4. Kuhn, K., Weihe, A., Borner, T. Multiple promoters are a common feature of mitochondrial genes in Arabidopsis. Nucleic Acids Research. 33 (1), 337-346 (2005).
  5. Jonietz, C., Forner, J., Holzle, A., Thuss, S., Binder, S. RNA PROCESSING FACTOR2 is required for 5' end processing of nad9 and cox3 mRNAs in mitochondria of Arabidopsis thaliana. ThePlant Cell. 22 (2), 443-453 (2010).
  6. Stoll, B., Stoll, K., Steinhilber, J., Jonietz, C., Binder, S. Mitochondrial transcript length polymorphisms are a widespread phenomenon in Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology. 81 (3), 221-233 (2013).
  7. Mulligan, R. M., Lau, G. T., Walbot, V. Numerous transcription initiation sites exist for the maize mitochondrial genes for subunit 9 of the ATP synthase and subunit 3 of cytochrome oxidase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (21), 7998-8002 (1988).
  8. Lupold, D. S., Caoile, A. G., Stern, D. B. The maize mitochondrial cox2 gene has five promoters in two genomic regions, including a complex promoter consisting of seven overlapping units. Journal of Biological Chemistry. 274 (6), 3897-3903 (1999).
  9. Yan, B., Pring, D. R. Transcriptional initiation sites in sorghum mitochondrial DNA indicate conserved and variable features. Current Genetics. 32 (4), 287-295 (1997).
  10. Rapp, W. D., Lupold, D. S., Mack, S., Stern, D. B. Architecture of the maize mitochondrial atp1 promoter as determined by linker-scanning and point mutagenesis. Molecular and Cellular Biology. 13 (12), 7232-7238 (1993).
  11. Rapp, W. D., Stern, D. B. A conserved 11 nucleotide sequence contains an essential promoter element of the maize mitochondrial atp1 gene. The EMBO Journal. 11 (3), 1065-1073 (1992).
  12. Forner, J., Weber, B., Thuss, S., Wildum, S., Binder, S. Mapping of mitochondrial mRNA termini in Arabidopsis thaliana: t-elements contribute to 5' and 3' end formation. Nucleic Acids Research. 35 (11), 3676-3692 (2007).
  13. Binder, S., Stoll, K., Stoll, B. Maturation of 5' ends of plant mitochondrial RNAs. Physiologia Plantarum. 157 (3), 280-288 (2016).
  14. Hang, R. L., Liu, C. Y., Ahmad, A., Zhang, Y., Lu, F. L., Cao, X. F. Arabidopsis protein arginine methyltransferase 3 is required for ribosome biogenesis by affecting precursor ribosomal RNA processing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16190-16195 (2014).
  15. Wang, H. Q., et al. Maize Urb2 protein is required for kernel development and vegetative growth by affecting pre-ribosomal RNA processing. New Phytologist. 218 (3), 1233-1246 (2018).
  16. Maloney, A. P., et al. Identification in maize mitochondrial 26S rRNA of a short 5'-end sequence possibly involved in transcription initiation and processing. Current Genetics. 15 (3), 207-212 (1989).
  17. Green, R. M., Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. New York. (2012).
  18. Canino, G., et al. Arabidopsis encodes four tRNase Z enzymes. Plant Physiology. 150 (3), 1494-1502 (2009).
  19. Gobert, A., et al. A single Arabidopsis organellar protein has RNase P activity. Nature Structural, Molecular Biology. 17, 740-744 (2010).
  20. Gutmann, B., Gobert, A., Giege, P. PRORP proteins support RNase P activity in both organelles and the nucleus in Arabidopsis. Genes & Development. 26 (10), 1022-1027 (2012).
  21. Stern, D. B., Goldschmidt-Clermont, M., Hanson, M. R. Chloroplast RNA metabolism. Annual Review of Plant Biology. 61, 125-155 (2010).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

RNA 5' PolifosfatazMitokondriyal RNA EkstraksiyonuKantitatif RT-PCRNorthern BlotTranskript Uç HaritalamaBirincil İşlenmiş TranskriptlerRNA NormalizasyonuDiverjan Primerler
Dairesel bir RT-PCR tabanlı strateji kullanarak Maize mitochondrion 'da primer ve Işlenmiş transkriptlerin ayrımcılık ve haritalama
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.