Tek Taraflı Bronşiyal Asit İnstillasyonu ile Kendi Kendine Sınırlı Akut Akciğer Hasarı Modeli

Akut solunum sıkıntısı sendromu (ARDS) akut solunumyetmezliğinin önemli bir nedenidir 1. Dünya çapında yoğun bakım ünitelerine başvuran hastaların %10'unda görülen yaygın veöldürücü veya devre dışı bırakan bir hastalıktır 2. Berlin tanımına göre³, ARDS hipoksemik solunum yetmezliği akut başlangıcı ile tanımlanır (<1 hafta) ve kardiyak yetmezlik ile açıklanamayan göğüs radyografilerinde bilateral pulmoner infiltrasyonlar⁴. Altta yatan patobiyoloji aşırı inflamatuar yanıt ile karakterizedir. Akciğer doğrudan yaralı olabilir, pnömoni gibi veya mide asidi aspirasyonu ile, ya da dolaylı olarak, sepsis gibi veya birden fazla kan transfüzyonu^{sonra 4}. İlk hakaretin ardından ARDS patogenezi üç aşamada ilerler: eksüdatif,proliferatif ve fibrotik fazlar 1. Bu evreler ARDS hastalarının prognozunu belirleyen farklı moleküler ve hücresel immün ve onarım mekanizmaları ile karakterizedir. ARDS hastalarının dayanak noktası destekleyici bakım olmaya devam etmektedir; Şu anda, ARDS için etkili bir farmakolojik tedaviler vardır, bu yüzden bu yıkıcı^durum4 yeni araştırma için acil bir ihtiyaç vardır.

Eksüdatif evrede doğuştan gelen immün yanıtın disregülasyonu ARDS'ninakut başlangıcına ve ilişkili solunum yetmezliğine katkıda bulunur 1. Güçlü pro-inflamatuar arabulucu sinyal ilk bağışıklık yanıtları yönetir, alveoler-kılcal bariyer bozulmasına yol açan, diffüz alveoler ödem, ve akciğer dokusu yaralanması siteye nötrofil infiltrasyon⁴. ARDS'de, akut inflamasyon için etkisiz frenleme sinyalleri akciğer yetmezliğine yatkınlık ve yaralı akciğer dokusunun zamanında katabasis geciktirebilir⁵. Bu amaçla ARDS'nin endojen başlangıç ve pro-çözüm mekanizmalarının klinik öncesi araştırılması yeni tedavi stratejilerini ortaya çıkarabilebilir. Bu tür bir araştırma yakından insan ARDS özelliklerine benzeyen akut akciğer hasarı kendi kendine sınırlı deneysel in vivo modelleri gerektirir, doku hasarı nın başlangıç ve çözüm aşamaları altında yatan mekanizmaların sorgulama izin.

Burada sunulan mürin modeli, eksüdatif ARDS'nin kardinal patobiyolojik süreçlerini gösteren doğrudan akut akciğer hasarı, yani alveoler-kapiller bariyer bozulması ve nötrofil infiltrasyonu üretmektedir. Yöntem sol mainstem bronş kanülasyonu yoluyla HCl selektif intra-bronşiyal instillasyon dayanır, sol akciğer yaralanma ve inflamatuar yanıt lokalizasyonu; yaralanmamış sağ akciğer doku yaralanması ve inflamasyon belirli belirlemeleri için bir iç kontrol olarak kullanılabilir. Buna ek olarak, tek taraflı akciğer hasarı öldürücü değildir ve bir çözüm programı duyurdu. Bu, endojen pro-çözümlü arabulucuların ve hücresel mekanizmaların tanımlanması ve ARDS için çözünürlük fizyolojisini vurgulayan yeni tedavi yolları açmak için kullanılabilir akciğer iltihabı çözümü içine ayrı bir pencere sunuyor ve Farmakoloji.

Aşağıdaki tüm hayvan prosedürleri Brigham ve Kadın Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (Protokol #2016N000356) tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

NOT: Tüm sağkalım işlemleri için steril teknik uygulandı. Her ameliyat için steril bir perde havlu kullanılarak steril bir alan kurulurken, cerrahlar steril cerrahi eldivenler, kapaklar, maskeler ve temiz laboratuvar paltoları giydiler. Tüm cerrahi aletler otoklav kullanılarak sterilize edildi ve boncuk sterilizatörü kullanılarak sterilite yapıldı.

1. 0,1 N HCl hazırlanması

1. Kehribar cam şişeye 11 mL ddH₂O ekleyin. Yavaş yavaş 1 N HCl çalışma stoku oluşturmak için% 37 HCl (12 N) 1 mL ekleyin.
   DİkKAT: Suya HCl eklenmiştir emin olun. Bu bir güvenlik sorunudur, çünkü doğrudan aside su eklemek asitin kaynaya ve şişeden sıçramasına neden olabilir. Konsantre HCl'yi kullanırken, asitin havalandırmalı kimyasal başlıkta tutulduğundan ve laboratuvar önlüğü, eldivenler ve güvenlik gözlükleri de dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipmanın takıldığından emin olun.
2. Daha önce seyreltilmiş HCl çalışma stokunun 4 mL'sini 50 mL konik bir tüpte 35 mL ddH₂O'ya ekleyerek 0,1 N HCl deneysel stok oluşturun.
3. Düşük pH çözeltileri kullanarak iki noktalı kalibrasyondan sonra elektronik pH probu kullanarak deneysel stoğun pH'ını ölçün. Son hacmin 40 mL olması için gerektiğinde NaOH veya HCl stok çözeltilerini kullanarak pH 1.1'e titrat.
   NOT: Düşük pH değerlerini ölçmek zor olabilir. Doğru ölçüm sağlamak için, ölçümün aşırı ekstrapolasyonunu önlemek için pH probunun düşük pH standartları kullanılarak doğru şekilde kalibre edildiğinden emin olun.
4. Deneyden hemen önce, deneysel HCl stokunun 1-2 mL'sini steril mikrosentrifüge tüpüne 0,22 m steril filtreden geçirin.

2. HCl'nin Seçki İç-bronşiyal Instillasyonu

1. Cerrahi alanın hazırlanması
   1. İntraperitoneal enjeksiyon ile ketamin (100 mg/kg) ve ksilazin (10 mg/kg) karışımı nı sağlayarak genel anesteziyi teşvik edin. Farenin, kuyruğun ucunu veya arka ayağını hafifçe sıkarak tamamen anestezi olduğundan emin olun. Bir deri kesi yapmadan önce yoksunluk yanıtı eksikliği gereklidir.  Gerekirse ek anestezi bolusları uygulayın.
   2. Boyun scruff altında deri altında buprenorfin 0.1 mg /kg teslim. Ameliyat öncesi analjezik anestezinin etkisini güçlendirecek ve işlemden kaynaklanan ameliyat öncesi ve sonrası ağrıları iyiletirecektir.
   3. Yavaş aşağı vuruş lar kullanarak farenin ventral yüzeyinde, boğazın servikal bölgesinde çenenin altında cerrahi alanı nazikçe tıraş etmek için elektrikli makasları kullanın. Altta yatan deriyi tamamen ortaya çıkarmak için gevşek kürkü çıkarın.
   4. % 10 povison-iyot çözeltisi ile tıraş site temizleyerek cerrahi alanı hazırlayın. Aseptik solüsyonu uyguladıktan sonra, %70 isopropil alkol bezi kullanarak bölgeyi temizleyin. Bu adımı 3x tekrarlayın.
2. Nefes borusunu izole etme
   1. Fareyi temiz bir cerrahi tahtaya supine yerleştirin ve cerrahi alanın maruz kalmasını sağlarken fareyi steril bir cerrahi perdeye kapatın. Perdeyi yerinde sabitle.
   2. Trakea ve tükürük bezleriüzerinde deride 0.5 cm boylamsal kesi yapın. Dikkatle deri geri çekin ve hafifçe trakeal kasları ortaya çıkarmak için tükürük bezleri nizvelemek için hafif kavisli tırtıklı forceps kullanın.
   3. Künt diseksiyon için tırtıklı forsepskullanarak, paratrakeal kasları hafifçe itin ve trakeanın kıkırdak halkaları tamamen açığa çıkana kadar trakeayı çevreleyen fasyayı uzaklaştırın.
   4. Trakeayı kaldırmak ve bağ dokusunu retro-trakea ile retro-fasya arasında ayırmak için tam kavisli tırtıklı forseps kullanın. Bağ dokusu ayrıldıktan sonra, çerkelerin ucu nefes borusuna tamamen kaymalıdır.
   5. Kavisli forceps trakea arkasında tutun ve 4-0 örgülü ipek dikiş 10-15 cm parça forceps uçları ile kavramak. Her iki tarafta eşit bir uzunluk olması için nefes borusu arkasında dikiş çekin.
   6. Dikiş yerleştirildikten sonra, sütürün kenarlarını farenin arka tarafına doğru yavaşça çekin ve kenarları yerinde tutun.
3. Seçici sol mainstem bronş cannulating ve HCl indap
   1. 24 G x 3/4" anjiyokateter alın ve iğneyi trakeanın ön bölgesine birinci ve ikinci trakeal halkalar arasına takın. Doğru yerleştirme, trakeal lümende iğne ucunun doğrudan görüntülenmesi yle doğrulandıktan sonra, sütü bırakın ve kanülü iğnenin üzerine ve kaneonun içine doğru ilerleyin, direnç ulaşıncaya kadar, sonra iğneyi geri çekin. Sol akciğeriçine selektif aşılama için sol ana kök bronş doğru ekleme yönü Açı.
   2. Kanül yerleştirildikten sonra kateterin kaymasını önlemek için enjeksiyon bağlantı noktasını sıkıca tutarak.
   3. P200 pipet ve steril P200 pipet uçları kullanarak, katetere 0,1 N HCl filtre lenmiş steril 2,5 mL/kg (20 g fare için 50°L) aşılayarak aynı hava hacmini takip edin.
   4. Kateteri hızla geri çekin ve cerrahi tahtayı 30 s için 60° açıya kaldırın.
4. Cerrahi alanın kapatılması
   1. Cerrahi tahtayı düz bir şekilde yatırın ve sütürü nefes borununun arkasından çıkarın.
   2. 2-3 dikiş kullanarak cilt kesikapatmak için 4-0 balmumu kaplı örgülü ipek dikiş kullanın.

3. Ameliyat Sonrası Bakım

1. Kesi kapatıldıktan sonra farenin sol tarafına, fare anesteziden iyileşene kadar Sıcak bir ısıtma yastığına yerleştirin. Normal gövdeye dönmeden önce fareyi ağrı ve aktivite düzeyi için izlemeye başlayın.
   NOT: Buprenorfin ilk 24 saat için her 6-12 saatte bir 0.1 mg/kg deri altı olarak uygulanmalıdır. Kalıcı atılım ağrı varsa, ağrı diner kadar analjezik rejimi uzatmak.

4. Tüm Akciğer Bronkoalveolar Lavaj (BAL) ve Lökosit İmmünofenotipleme

1. Adım 2.1.1 kullanılan ketamin / xylazine doz 3x uygulayarak fare ötenazi.
   1. Interstisyel ve intravasküler nötrofilleri ayırt etmek için, ötanaziden 5 dakika önce seçili florofor etiketli Ly6G antikorenjekte edin. Bu etiket, intravasküler nötrofillerin farklı bir florofor ile doku hazırlığı sırasında etiketlenecek olan akciğer interstisyel ve alveoler nötrofillerden ayırt etmek için akış sitometrisi ile saptanmaya uygun olmalıdır (aşağıya bakınız).
2. Bir cerrahi tahta üzerinde fare yerleştirin ve 2-0 örgülü ipek dikiş bir döngü etrafında ön kesici dişleri kanca.
3. 2.2.2-2.2.6 adımlarını izleyin. kanülasyon için trakea hazırlamak için.
   NOT: Diyafram akciğer lavaj sırasında trans-alveoler şişirme basıncı nı en üst düzeye çıkarmak için delinmiş olmadığından emin olun; sol akciğer uyumu yaralanma dan sonra azalır, hangi akciğer lavaj için daha yüksek bir trans-alveoler basınç gereksinimi gerektirebilir.
4. Adım 2.3.1'den sonra trakeayı kanüle, ancak kateteri karinanın altında ilerletmeyin; kateteri trakeaya paralel olarak yerleştirin.
5. Kateter takılı takıldığında, kateteri yerinde tutmak için sütürü trakeanın etrafına bağlayın.
6. 1 cc şırınga kullanarak 0,6 mM EDTA ile art arda iki adet 1 mL buz gibi PBS -/- (magnezyum veya kalsiyum olmadan) aşılayıp geri çekin. Akış sitometrisi ile immünofenotiyoloji için, her aliquot çıkarın ve buz üzerinde 5 mL polistiren FACS tüp dönmek.
7. Ötenaziyi sağlamak için cerrahi makas ve ardından kardiyak delinme kullanarak torakotomi yapın. Akciğerler daha fazla işlem için hasat edilebilir.
8. Bal'ı 4 °C'de 800 g'da 10 dk santrifüj edin ve hücreleri peletleyin.
9. Supernatant'ı 2 mL mikrosantrifüj tüpe ve aliquot'u 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe dönüştürün. Sonraki analizler için -80 °C'de saklayın.
10. Akış sitometrisi ile lökosit diferansiyel analizi için PBS hücre pelet -/- % 2 FBS ile resuspend.
11. Interstisyel ve intravasküler nötrofilleri ayırt etmek için, sol ve sağ akciğeri ayrı ayrı çıkarın ve Abdülnour ve ark. 2014 6'da olduğu gibi akış sitometrisi için akciğerleri işletin.
12. Seçilen FACS antikorları kullanarak ortaya çıkan hücre süspansiyonuna leke atın, adım 4.1.1'den itibaren Ly6G antikordan farklı bir florofor ile konjuge olan Ly6G için lekelenmeyi unutmayın.

5. Evan'S Blue Boya (EBD) kullanarak Alveolar Bariyer Geçirgenliğinin Değerlendirilmesi

1. İntravenöz olarak evan'S Blue Boya enjekte (40 mg /kg) 30 dakika önce ötanazi.
2. Ketamin/ksilazin aşırı doz (adım 4.1) kullanarak fare ötenazi.
3. Alveoler bariyer bütünlüğünü ölçmek için BAL koleksiyonu için 4.2-4.9 adımlarını izleyin.
4. 100 μL BALF'ı 96 kuyulu net bir mikro plakaya ve 100 μL'lik yinelenen EBD standartlarına aktarın. PBS -/-'yi boş olarak kullanın.
5. BALF'nin 620 nm ve 740 nm'deki emnesini ölçmek için bir mikroplaka okuyucu kullanın. 740 nm'deki emiciliği kullanarak numunelerde heme kontaminasyonunu düzeltin⁷.
6. Vasküler bariyer bütünlüğünü ölçmek için, kalbin sağ ventrikülünden 5 mL buz gibi PBS -/- enjekte ederek akciğerleri perfüzyon. Sol akciğeri çıkar.
7. Fazla suyu gidermek için sol akciğeri 58 °C'de 72 saat kurulayın.
8. Radu ve Chernoff 2013 8'dekigibi kurutulmuş akciğer dokusunu işleyin ve 620 nm ve 740 nm'de absorbansları ölçün.

6. Akciğer Histolojisi

1. 4.1-4.5 adımlarını izleyerek nefes borusunu kanüle edin.
2. Akciğerleri 20 cm H₂O'da basınçla onarmak için, kapak kontrollü tüple donatılmış ve seçilmiş bir fiksatif çözeltiyle doldurulmuş 60 mL'lik bir şırıngayı (örn. çinko fiksatif) yükseltmek için bir halka standı ve kelepçe kullanın, böylece fiksatif çözeltinin menisküsü 20 cm yukarıda Akciğer.
3. Tüpü katetere takın ve değeri açın. Yavaş yavaş onlar şişirme durdurmak kadar fiksatif ile akciğerleri doldurun.
4. Kateteri nefes borusundan çıkarken 3/4 çıkarın. Fiksatif kaybını en aza indirmek için kateteri tamamen çıkarmadan önce trakeayı sütürle bağlayın.
5. Akciğerleri ve kalbi kaldırın.
   NOT: Akciğerlerin kaldırma sırasında fiksatif basınç infüzyon korumak için delinmediğinden emin olun.
6. Oda sıcaklığında fiksatif 25 mL 24 saat için akciğerleri düzeltin.
7. PBS -/-, %30 etanol ve %50 etanol de sıralı 20 dk aralıklarla sabit akciğerleri yıkayın.
8. Son yıkamadan sonra, Eickmeier ve ark 2013⁹gibi histoloji işleme için% 70 etanol akciğerleri saklayın.

Selektif intra-bronşiyal HCl instillasyonu tek taraflı akut akciğer hasarı ile sonuçlanır

HCl'nin sol mainstem bronşlarına selektif intrabronşiyal aşılama yöntemi Şekil 1A'dagösterilmiştir. Bunun sonucu akut akciğer hasarı tüm sol akciğer içerir, ve EBD ve akciğer perfüzyoninin intravenöz uygulama dan sonra, EBD sol akciğer sadece kaldı (Şekil1B). Sol akciğere EBD ekstravazasyonu sayısallaştırılmış ve sham selektif instillasyona göre anlamlı olarak artmış bulunmuştur (Şekil1C; Abdulnour ve ark. 2014 6'dan uyarlanmıştır). Akciğer hasarına yanıt olarak, iltihaplı doku içine lökositler diapedese dolaşan. Bu modelde vasküler nötrofiller yaralı akciğer interstitiumuna trans-endotel göçünden geçerler. HCl instilonundan sonra sol akciğerde 24 saat biriken interstisyel nötrofiller, az sayıda interstisyel nötrofilin görüldüğü sağ akciğerin aksine (Şekil1D). Bu sonuçlar, selektif sol mainstem intra-bronşiyal instillasyon yönteminin büyük ölçüde sol akciğere lokalize olan murine akut akciğer hasarına yol açtığını ve insan ARDS ile de görülen patolojik değişikliklere yol açtığını göstermektedir. alveolar-kapiller bariyer ihlali ve nötrofil infiltrasyonu.

Tek taraflı akut akciğer hasarı çözüm mekanizmalarının araştırılmasını sağlar

Asit kaynaklı akut akciğer hasarı nın çözüm aşamasını incelemek için farelerin ilk hakaretten sağ çıkabilmesi gerekir. İntratrakeal HCl farklı, sadece sol mainstem bronş içine aşılanması aksi takdirde sağlıklı farelerde üniforma sağkalım ile kendini sınırlı yaralanmaya yol açar. Akciğerler, Şekil 2A'daolduğu gibi farelerden erken veya geç zaman noktalarında nelde edilebilir. Akciğer histolojisi sol akciğerde belirgin alveoler ödem ve nötrofil infiltrasyonu ile karakterize yaralanma dan sonra 24 saat eksüdaif inflamasyon ile organ ve hücresel düzeyde doku hasarı ve iltihabı gösterir. Yaralanmamış kontrol sağ akciğerine önemli bir yaralanma veya lökosit akını olmadığını unutmayın (Şekil 2A). Yaralanmadan sonra 72 saat, ödem ve hücresel infiltrasyonlar önemli ölçüde azalır, bu da eksüdasatif bir evreyi temsil eder. Alveoler nötrofiller tüm akciğer lavajı ile elde edilen akış sitometrisi (CD45+/CD68-/F4/80-/Ly6G+/CD11b+ )ile izlenebilir. Nötrofiller ilk yaralanmadan sonra sol akciğerde 24 saat artarak 48 ve 72 h'de önemli ölçüde azalmaktadır (Şekil 2B). Daha sonraki zaman noktaları araştırılırsa, nötrofil sayıları temel eve geri döner ve katabasisin sonraki aşamalarındaki mekanizmalar, fibroproliferatif yanıtlar gibi, incelenebilir.

Şekil 1: Selektif intra-bronşiyal HCl instillasyonu alveoler bariyer ihlali ve nötrofil infiltrasyonu ile tanımlanan tek taraflı akciğer hasarına neden olur. (A) Sol akciğere HCl'nin selektif indatması için murine sol anakök bronşlarının kanülasyonunun temsili. (B) Selektif asit instillasyonuna maruz kalan ve intravenöz Evan'ın mavi boyasını takiben perfüzyonlu sağ (RL) ve sol (LL) akciğerleri rezeke edilir. (C) Asit yaralanması veya sahte kontrolden sonra interstisyel Evan'ın mavi boyasının homojenleştirilmiş, perfüzyonlu akciğer24 saat den ölçülmesi; şekil Abdulnour ve ark. 20146uyarlanmıştır . Değerler± ± SEM'i temsil ediyor, n ≥ 5. *p < 0.05, Mann-Whitney U Test. (D) Intravasküler temsili akış sitometrisi (I.V.; florofor 1) ve interstisyel (I.S.; florofor 2) nötrofiller in total CD45 yüzdesi olarak+ işlenmiş akciğer hücrelerinin yüzdesi 24 saat asit yaralanması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Tek taraflı akut akciğer hasarı kendi kendine çözülmektedir. (A) Temsili H&E histolojisi (10x) saf farelerden (0 saat) veya farelerden 24, 48, 72 h yaralanma sonrası elde edilen sol akciğerlerin yanı sıra aynı fareden sağ akciğerle birlikte (Ölçek çubuğu = 250 μm). (B) Alveoler nötrofillerin (Ly6G+ CD11b+) saf (0 saat) fare veya farelerde toplam CD45+ hücrelerin yüzdesi olarak tüm akciğer lavajından elde edilen temsili akış sitometrisi 24, 48 ve asit yaralanmasından sonra 72 saat. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.