Yöntem makalesi

Küçük RNA-seq iyileştirilmesi: Daha Az Önyargı ve 2'-O-Metil RNA'ların Daha İyi Tespiti

DOI:

10.3791/60056

⸱

16 Eylül 2019

 ,  , 
1Institute for Integrative Biology of the Cell, UMR9198, CNRS CEA Univ Paris-Sud, Université Paris-Saclay

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Standart yöntemlere göre daha az önyargılı ve 2'-O-metil RNA'lar için artan hassasiyetiçeren ayrıntılı bir küçük RNA kütüphane telafi protokolü saiyoruz. Bu protokol maliyet tasarrufu veya kolaylık sağlamak için kitleri kullanarak ev yapımı reaktifler kullanılarak izlenebilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Küçük RNA'ların (sRNA) yeni nesil sıralama (NGS) ile incelenmesi, kütüphane hazırlığı sırasında önyargı sorunlarıyla mücadele ediyor. Bitki mikroRNA'ları (miRNA'lar) gibi çeşitli sRNA tipleri 3'lük terminal nükleotitlerinde 2'-O-metil (2'-OMe) modifikasyonu taşırlar. Bu modifikasyon 3'ün adaptör ligasyonunu inhibe ederken başka bir zorluk daha ekler. Daha önce 'TruSeq (TS)' protokolünün değiştirilmiş sürümlerinin daha az önyargıya ve 2'-OMe RNA'ların daha iyi algılanmasına sahip olduğunu gösterdik. Burada ayrıntılı protokolü 'TS5' olan en iyi genel performansı gösterdi açıklar. TS5, ts kitinden ev yapımı reaktifler veya reaktifler kullanılarak eşit performansla takip edilebilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Küçük RNA'lar (sRNA'lar) biyolojik süreçlerin çeşitliliğinin kontrolünde yer almaktadır1. Ökaryotik düzenleyici sRNA'lar genellikle 20 ile 30 nt arasındadır; üç ana tip mikroRNA (miRNA), piwi-etkileşimrra'lar (piRNA) ve küçük interferans RNA'ları (siRNA)dir. Anormal miRNA ekspresyon düzeyleri çeşitlihastalıklarakarışmış 2 . Bu, miRNA'ların sağlık ve hastalık taki önemini ve genel olarak SRNA'ları saptamak için doğru, nicel araştırma araçları nın gerekliliğini vurgulamaktadır.

Yeni nesil sıralama (NGS) sRNA'ları incelemek için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. NgS'nin kantitatif PCR veya mikrodizi teknikleri (qPCR) gibi diğer yaklaşımlarla karşılaştırıldığında başlıca avantajları, sRNA dizileri hakkında priori bilgisine ihtiyaç duymaması ve bu nedenle yeni RNA'ları keşfetmek için kullanılabilmesi ve buna ek olarak daha az arka plan sinyali ve doygunluk etkileri. Ayrıca, tek nükleotit farklılıkları algılayabilir ve mikrodizilerden daha yüksek bir iş elde eder. Ancak, NGS de bazı dezavantajları vardır; sıralama çalışmasının maliyeti nispeten yüksek kalır ve bir örneği sıralama için kitaplığa dönüştürmek için gereken çok aşamalı işlem önyargılara neden olabilir. Tipik bir sRNA kitaplık hazırlama işleminde, 3' adaptör ilk olarak SNA ligase 2 (RNL2) ve atp yokluğunda preadentlated 3' adaptör(Şekil 1)kesilmiş bir sürümü kullanılarak sRNA (genellikle toplam RNA'dan jel saflaştırılmış) ile bağlanır. Bu sRNA-adaptör ligasyonunun verimliliğini artırır ve sRNA daireselleştirme veya koncatemerization gibi yan reaksiyonların oluşumunu azaltır. Daha sonra, 5' adaptör RNA ligase 1 (RNL1) ile, ardından ters transkripsiyon (RT) ve PCR amplifikasyonu ile bağlanır. Tüm bu adımlar önyargı3,4tanıtabilir. Sonuç olarak, okuma sayıları yapay, yönteme bağımlı ifade desenlerine yol açan gerçek sRNA ifade düzeylerini yansıtmayabilir. Belirli SRNA'lar bir kütüphanede aşırı veya az temsil edilebilir ve güçlü bir şekilde yeterince temsil edilmeyen sRNA'lar tespitten kurtulabilir. Durum özellikle bitki miRNA'ları, böcek ve bitkilerdeki siRNA'lar ve böceklerde, nematodlarda ve memelilerde piRNA'lar ile karmaşıktır ve 3'-O-metil (2'-OMe) modifikasyonu1. Bu modifikasyon kuvvetle inhibe 3 ' adaptör ligasyon5,RNA bu tür için kütüphane hazırlık zor bir görev yapma.

Önceki çalışma adaptör ligasyonu ciddi önyargı tanıttı gösterdi, RNA dizisi nedeniyle / yapı etkileri6,7,8,9,10,11. Ters transkripsiyon ve PCR gibi adaptör ligasyonunun aşağı doğru adımlarında önyargı6,11,12önemli ölçüde katkıda bulunmaz. Ligasyon yanlılığı, belirli bir diziye sahip adaptör moleküllerinin reaksiyon karışımındaki sRNA molekülleriyle etkileşime girebileceği gerçeğinden kaynaklanmaktadır ve bu da ligasyon için olumlu veya elverişsiz konfigürasyonlara yol açabilir (Şekil 2). Sorefan ve ark7'den elde edilen veriler RNL1'in tek bir mahsur bağlamı tercih ettiğini, RNL2'nin ise ligasyon için çift iplikçik tercih ettiğini göstermektedir. Bağdaştırıcı/sRNA eş kıvrım yapılarının belirli bağdaştırıcı ve sRNA dizileri tarafından belirlenmesi, belirli sRNA'nın neden belirli bir bağdaştırıcı kümesiyle neden aşırı veya az temsil edildiğini açıklar. Karşılaştırılacak bir dizi sRNA kitaplığı içinde aynı bağdaştırıcı dizilerinin kullanılması gerektiğini de unutmayın. Nitekim, daha önce farklı barkod dizileri giriş tarafından adaptörleri değişen kütüphaneler9,13sıralama miRNA profilleri değiştirir gözlenmiştir.

Bağdaştırıcı dizilerinin ligasyon kavşağına yakın randomize edilmesi bu önyargıları azaltır. Sorefan ve meslektaşları7 kendi ekstremitelerinde 4 rasgele nükleotit ile adaptörler ihdas, belirlenen "High Definition" (HD) adaptörleri, ve bu adaptörlerin kullanımı daha iyi gerçek sRNA ifade düzeylerini yansıtan kütüphanelere yol gösterdi. Daha yeni çalışmalar bu gözlemler doğruladı ve randomize bölge ligasyon kavşak11bitişik olması gerekmez ortaya . Adaptörler bu roman türü "MidRand" adaptörleri seçildi. Birlikte, bu sonuçlar gelişmiş bağdaştırıcı tasarımıönyargı azaltabilir göstermektedir.

Bağdaştırıcıları değiştirmek yerine, yanlılık reaksiyon koşullarının optimizasyonu yoluyla bastırılabilir. Polietilen glikol (PEG), ligasyon verimliliğini artırmak için bilinen bir makromoleküler kalabalık ajan14,belirgin önyargı azaltmak için gösterilmiştir15,16. Bu sonuçlara dayanarak, birkaç "düşük önyargı" kitleri piyasada ortaya çıktı. Bunlar arasında, klasik adaptörler veya HD adaptörlerle birlikte ligasyon reaksiyonlarında PEG kullanan kitler yer almaktadır. Diğer kitleri tamamen ligasyon önlemek ve 3' poliadenilasyon ve şablon anahtarlama 3' ve 5' adaptör ek, sırasıyla12kullanın. Başka bir stratejide ise 3' adaptör ligasyonu daireselleştirme adımı ile takip edilir,böylece 5' adaptör ligasyonu 17.000.000.000.000.000.000.000.000.000.000.000.000.000.000.000.000.000.00

Bir önceki çalışmada, biz önyargı mümkün olan en düşük düzeyde ve 2'-OMe RNA12en iyi tespiti ile bir sRNA kütüphane hazırlama protokolü aradı. Biz standart protokol (TS) daha 2'-OMe RNA daha iyi bir tespit vardı yukarıda belirtilen 'düşük önyargı' kitleri, bazı test etti. Şaşırtıcı ancak, modifikasyon üzerine (randomize adaptörlerin kullanımı, ligasyon reaksiyonlarında PEG ve saflaştırma tarafından aşırı 3' adaptör kaldırılması) ikinci 2'-OMe RNA tespiti için diğer protokolleri geride. Burada, 2'-OMe RNA'ların en iyi genel tespitine sahip olan TS protokolü 'TS5'e dayalı bir protokolü ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Protokol, TS kitinden reaktifler ve 'Nf' kitinden bir reaktif kullanılarak veya paradan tasarruf etmek için ev yapımı reaktifler kullanılarak eşit performansla izlenebilir. Ayrıca sRNA'nın toplam RNA'dan arındırılması ve preadentlated 3' adaptörünün hazırlanması için ayrıntılı bir protokol salıyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Küçük RNA'ların İzolasyon

  1. Fenol bazlı reaktifler veya başka bir yöntem kullanarak toplam RNA ayıklayın. RNA'nın kaliteli olup olmadığını doğrulayın.
  2. Önceden 200 V'de 15 dakika boyunca %15 TBE-üre jeli (Bkz. Malzeme Tablosu)çalıştırın.
  3. Jel önceden çalışırken, 5-15 μL hacimdeki toplam RNA'nın 5-20 μg'sini eşit hacimli formamid yükleme boyası ile karıştırın (bkz. Aynı şekilde, 10 μL (200 ng) küçük RNA merdiveni (Bkz. Malzeme Tablosu)ile eşit hacimli formamid yükleme boyası ile karıştırın. Isıtılmış kapaklı bir termocycler 65 °C'de 5 dakika kuluçkaya yatırın, ardından tüpleri hemen buzüzerine yerleştirin.
  4. Merdiveni ve numuneyi aralarında en az bir şeritle aynı jel üzerine yükleyin ve bromofenol mavisi (koyu mavi) jel uzunluğunun yaklaşık üçte ikisi (yaklaşık 40 dk) göç edene kadar 200 V'de çalıştırın.
  5. RNA'yı jelden uzaklaştıracak bir sistem hazırlayın: nükleaz içermeyen 0,5 mL mikro santrifüj tüpünün altını 21 kalibrelik bir iğneyle delin. Delinmiş 0,5 mL'lik tüpü nükleaz içermeyen yuvarlak dipli 2 mL mikro santrifüj tüpe yerleştirin.
  6. Jeli çıkarın ve oda sıcaklığında 3 μL nükleik asit jel lekesi (10.000 x konsantre; bkz. Malzeme Tablosu)ile 10-15 dakika boyunca 30 mL suda kuluçkaya yatırın.
  7. Bir 'Dark Reader' trans aydınlatıcı üzerinde jel görüntüleyin (bu RNA zarar verebilir gibi UV önlemek için şiddetle tavsiye edilir) ve 17 nt ve 29 nt merdiven bantları arasında örnek RNA kesip. Jel parçasını adım 1.5'ten 0.5 mL tüpe aktarın.
  8. 2 mL tüpteki 0,5 mL'lik tüpü maksimum hızda mikro santrifüjde 2 dk.
  9. Ezilmiş jeli içeren 2 mL boruya 300°L nükleaziçermeyen 0,3 M NaCl ekleyin ve oda sıcaklığında veya gece lemede 4 °C'de (16 saat) en az 2 saat döndürün.
  10. Ezilmiş jel parçalarının süspansiyonuna bir spin sütununa (Malzeme Tablosunabakınız) ve mikro santrifüjde maksimum hızda 2 dakika santrifüj aktarın.
  11. 1 μL (20 g/μL) glikojen (Bkz. Malzeme Tablosu)ve 950 μL oda sıcaklığında %100 etanol ekleyin. -80 °C'de en az 30 dakika kuluçkaya yatırın.
  12. 4 °C'de bir mikro santrifüjde maksimum hızda 20 dk santrifüj. Supernatant çıkarın, soğuk 800 μL ile pelet yıkayın 800% etanol. 4 °C'de 5 dakika daha santrifüj edin ve tüm supernatant'ı dikkatlice çıkarın. 15 μL çekirdeksiz suda RNA peletini yeniden askıya alın. Tipik olarak, giriş toplam RNA miktarına bağlı olarak küçük RNA ~5-20 ng kurtarılmalıdır (~1 ng küçük RNA girişi toplam RNA başına 1 μg).
  13. Önerilen ek adım: Kurtarılan sRNA'nın miktarını ve kalitesini kontrol edin (örn. küçük bir RNA kiti kullanarak kılcal jel elektroforezi ile; bkz. Malzemeler Tablosu).

2. Preadenylated 3' HD adaptörü hazırlanması

NOT: 3' HD adaptörün preadeniltion Chen ve ark18tarafından açıklanan protokole benzer bir şekilde yapıldı . Preadenylated adaptör doğrudan sipariş edilebilir unutmayın (/5rApp / modifikasyon), ama bu oldukça pahalı.

  1. Sipariş 5' fosforilted, 3' bloke 3' HD adaptör oligonükleotid. Dizi ve değişiklikler için Tablo 1'e bakınız. '3AmMO' 3 ' amino değiştirici grup olduğunu unutmayın, en tedarikçiler bu değişiklik ile oligonükleotid üretebilir. 100 μM çekirdeksiz su seyreltin.
  2. Aşağıdaki reaktifleri içeren 100 μL'lik bir reaksiyon ayarlayın: 10 μL oligo (100 μM), 10 μL T4 RNA ligase tampon (10x), 10 μL ATP (10 mM), 40 μL %50 PEG8000, 5 μL T4 RNA ligase 1 (50 birim), 25 μL çekirdeksiz su. 20 °C'de bir gecede kuluçkaya yatırın.
  3. Preadentinlated oligonükleotid in klasik fenol-kloroform ekstraksiyon ve etanol yağış gerçekleştirin. 100 μL asit (pH 4.5) fenol ekleyin: kloroform ve girdap. Oda sıcaklığında 5 dakika, maksimum hızda döndürün. Üst fazın 90 μL'sini yeni bir tüpe dikkatlice aktarın; 3 M sodyum asetat pH 5.2, 1 μL ultra saf glikojen ve 250 μL soğuk % 100 etanol ekleyin.
  4. -20 °C'de en az 30 dk. Santrifüj 4 °C maksimum hızda 30 dk tutun. Supernatant çıkarın, bir kez 500 μL soğuk% 80 etanol ile pelet yıkayın. Fenol-kloroform ekstraksiyonu ve etanol yağışına alternatif olarak, nükleotit çıkarma kiti kullanılabilir (bkz. Malzemeler Tablosu). 25°L suda tekrar askıya alın.
  5. Tek iplikçikli DNA'nın özel tespiti için bir kit kullanarak bağdaştırıcının konsantrasyonunu ölçün (bkz. Seyreltik 80 ng/μL (10 μM).
  6. Önerilen ek adım: İşlenmemiş oligonükleotid ile birlikte %15'lik TBE-üre jeli(Malzeme Tablosu)üzerinde 1 μL 10 μM adaptörü geçirerek preadenilalasyonun etkinliğini doğrulayın. Preadenylated adaptör tedavi edilmemiş oligonükleotid biraz daha yavaş göç etmelidir. İstenirse, preadenylated adaptör jel saflaştırılmış olabilir; yukarıda açıklandığı gibi devam edin (adım 1.2-1.12).

3. Kütüphane hazırlama - Protokol TS5

NOT: Burada daha önce12 olarak tanımladığımız ve kitten reaktiflerle veya kendi kendine sağlanan reaktiflerle yapIlebilen değiştirilmiş TS protokolünü 'TS5' olarak sıyoruz. 'TS7' adlı farklı bir protokolle benzer hatta biraz daha iyi sonuçlar elde ettiğimiz unutulmamalıdır. Ancak, TS7 ile adaptör dimer'leri ortadan kaldırmak daha zordur. Bu nedenle TS5'i ayrıntılı olarak tanımlamayı tercih ettik, ancak TS7'yi sadece bağdaştırıcıların değiştirilmesi yle takip edilebilir. TS7 için 'MidRand Benzeri (MRL)' bağdaştırıcı dizilerini kullanın (Tablo 1). Burada rasgele bölgeler bağdaştırıcıların ortasında olduğunu unutmayın. Ters transkripsiyon ve PCR için astarlar, randomize bölgenin 3' bağdaştırıcısında ve 5' adaptördeki randomize bölgenin yukarı akışındaki dizilere hibridize edilir. Sıralama, 5' adaptöründeki ilk randomize nükleotitten başlayacaktır.

  1. 3' adaptör ligasyonu.
    1. 1 μL preadenylated 3' HD adaptörü (10 μM) ile 0,2 mL mikro santrifüj tüpte 1 μL saflaştırılmış küçük RNA (~0,1-1 μM) birleştirin. Bir termo cycler 72 °C'de 2 dakika kuluçka, sonra doğrudan buz üzerine koyun.
    2. 4 μL % 50 PEG 8000 (viskoz çözelti; pipet yavaş), 1 μL RNA ligase tampon (10x), 1 μL H2O, 1 μL T4 RNA ligase2 kesilmiş ve 1 μL RNa inhibitörü ekleyin. 16 °C'de bir gecede kuluçkaya yatırın.
  2. Unligated 3' adaptörün ortadan kaldırılması
    1. 10 μL'lik nükleaziçermeyen su ekleyin ve iyice karıştırın. Nf kitinden(Malzeme Tablosu)6 μL 3 M NaOAc pH 5.2 veya 'Adaptör Tükenme Çözümü' ekleyin ve iyice karıştırın. 40 μL manyetik saflaştırma boncukları(Malzeme Tablosu)ve 60 μL isopropanol ekleyin ve iyice karıştırın. Oda sıcaklığında 5 dakika kuluçka.
    2. Çözelti net görünene kadar numuneyi manyetik bir rafa koyun. Supernatant'ı çıkarın ve atın.
    3. 180 μL taze hazırlanmış % 80 etanol ekleyin. ~30 s için kuluçka, sonra kaldırın. Taze hazırlanmış %80 etanol kullanmaya özen ve uzun süre %80 etanol ile kuluçkaya yatmayın.
    4. Kısaca tüpü döndürün ve kuyunun dibinde toplanmış olabilecek artık sıvıyı çıkarın. Boncuklar 2 dk kurusun, sonra 22 μL 10 mM Tris pH 8 veya Nf kitinden resuspension tamponu ile yeniden askıya alın. 2 dakika kuluçkaya yat, sonra çözelti net görünene kadar numuneyi manyetize edin.
    5. Nf kitinden(Malzeme Tablosu)yeni bir tüpe 6 μL 3 M NaOAc pH 5.2 veya 'Adaptör Tükenme Çözümü' ekleyin. Bir önceki adımdan 20 μL'lik supernatant'ı bu yeni tüpe aktarın ve pipetleme ile karıştırın. 40 μL manyetik boncuk ve %100 isopropanol 60 μL ekleyin ve pipetleme ile iyice karıştırın. 5 dakika kuluçka.
    6. Çözelti net görünene kadar numuneyi manyetize edin, ardından süpernatant'ı çıkarın ve atın.
    7. 180 μL taze hazırlanmış % 80 etanol ekleyin. ~30 s için kuluçka, sonra kaldırın. Take bakım taze hazırlanmış kullanmak için 80% etanol ve uzun süre boyunca% 80 etanol ile kuluçka yok.
    8. Kısaca tüpü döndürün ve kuyunun dibinde toplanmış olabilecek artık sıvıyı çıkarın. Boncuklar 2 dk kurusun ve 10°L nükleazsız suda tekrar asın. 2 dakika kuluçkaya yat, sonra çözelti net görünene kadar numuneyi manyetize edin.
    9. Yeni bir tüpe 9 μL supernatant aktarın. 1 μL T4 RNA ligaz tampon (10x) ve 1 μL su ekleyin. Alternatif olarak, TS kitinden 2 μL ligaz arabelleği ekleyin.
  3. 5' adaptörün ligasyonu.
    1. 1 μL 5' HD adaptör (10 μM; Tablo 1) ısıtmalı kapaklı bir termo cycler 200 μL PCR tüp. 70 °C'de 2 dakika kuluçkaya yatın, sonra tüpü doğrudan buza koyun.
    2. 1 μL 10 mM ATP ve 1 μL T4 RNA ligaz 1 ekleyin. Yavaşça pipetleme ile iyice karıştırın. Adım 3.2.9'dan 3' ligatlı RNA'ya bu karışımın 3 μL'sini ekleyin ve pipetleme ile karıştırın. 28 °C'de 1 saat kuluçka.
  4. Ters transkripsiyon (RT)
    1. 6 μL 3' ve 5' adaptör rna'yı yeni bir 200 μL PCR tüpe aktarın (gerekirse daha sonra kullanmak için kalan ~8 μL'yi -80 °C'de saklayın). 1 μL RT astar (10 μM; Tablo 1) ve pipetleme ile karıştırın. 70 °C'de 2 dakika kuluçkaya yatın, sonra tüpü doğrudan buza koyun.
    2. RT için aşağıdaki reaktifleri ekleyin: 2 μL 5x ilk iplikçik tamponu, 0,5 μL 12,5 mM dNTP karışımı, 1 00 mM DTT 1l, RNase inhibitörü 1 μL ve 1 μL ters transkriptaz(Malzeme Tablosu). 50 °C'de 1 saat kuluçka.
  5. PCR amplifikasyonu
    1. 12,5 μL RT reaksiyon karışımına aşağıdaki reaktifleri ekleyin: 10 μL PCR polimeraz tamponu, 2 μL evrensel P5 astarı (10 μM; Tablo 1), 2 μL P7-indeks astar (10 μM; Tablo 1), 1 μL 12,5 mM dNTPs, 0.5 μL DNA polimeraz(Malzeme Tablosu)ve 22 μL su. Kullanıma kadar reaksiyonu buzda tutun.
    2. Aşağıdaki PCR programını çalıştırın: 30 s için 98 °C, 11 devir (10 s için 98 °C, 30 s için 60 °C ve 15 s için 72 °C) ve 10 dk için 72 °C. Bittiğinde reaksiyonu 4 °C'de tutun.
      NOT: PCR döngülerinin sayısı ile ilgili olarak: biz genellikle 11 döngüleri gerçekleştirmek, ancak bu kullanıcı tarafından optimize edilmelidir. Mümkün olan en az sayıda PCR döngüsünü gerçekleştirmeye çalışın.
  6. Jel arınma
    1. 5, 10 ve 20 μL PCR ürününü %6'lık bir TBE jeli üzerinde (Bkz. Malzeme Tablosu)uygun bir merdivenle birlikte çalıştırın (Bkz. Malzeme Tablosu). Jeli 145 V'da yaklaşık 1 saat çalıştırın (bromofenol mavisi dibe ulaşana kadar; bu boya 65 bp pozisyonunda taşınır).
    2. Jel çıkarın ve nükleik asit jel lekesi ile kuluçka (Malzemeler Tablosubakınız) 10-15 dakika suda.
    3. Bir "Dark Reader" trans aydınlatıcı üzerinde jel görüntüleyin (bu RNA zarar verebilir gibi UV önlemek için şiddetle tavsiye edilir) ve 150 bp. Adım 1.5 açıklandığı gibi jel RNA eute için bir sistem hazırlamak ve 0.5 mL tüp jel parçası aktarmak.
    4. 2 dakika maksimum hızda mikro santrifüj santrifüj. Şimdi boş olması gereken 0,5 mL tüp, çıkarın.
    5. Ezilmiş jeli içeren 2 mL boruya 300°L çekirdeksiz su ekleyin ve oda sıcaklığında veya gece boyunca 4 °C'de en az 2 saat döndürün.
    6. Ezilmiş jel parçalarının süspansiyonuna bir spin sütununa ve santrifüje maksimum hızda 2 dakika aktarın.
    7. 1 μL (20 g/μL) glikojen, 30 μL 3 M NaOAc ve 975 μL buz gibi soğuk %100 etanol ekleyin. 4 °C'de maksimum hızda 20 dk santrifüj.
    8. Peleti 10 mM Tris pH8'in 20 μL'inde yeniden askıya alın. Konsantrasyon ölçümü için 1 l, kalite kontrol için 1 000 kullanın.

4. Veri analizi

NOT: Aşağıda açıklanan veri analizi prosedürü Linux işletim sistemi Ubuntu 16.04 LTS'ye dayanmaktadır.

  1. Ham dizi dosyalarının işlenmesi
    1. Sıralama çalışması sırasında oluşturulan FASTQ sıralı dosya(lar)ı indirin. Gerekirse, bcl2fastq2 (sürüm V2.2.18.12; bir kılavuz aşağıdaki linkten indirilebilir: http://emea.support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/bcl2fastq-conversion-software/documentation.html) ile demultiplexing gerçekleştirin.
      Aşağıdaki komutu kullanın:
      nohup Pathway_of_bcl2fastq/bcl2fastq --runfolder-dir Pathway_of_Run --yoksay-eksik-bcl --çıktı-dir Pathway_of_Output_Directory --barkod-uyuşmazlıklar 1 --birleştirilmiş-fayans AUTO -r 16 -d 16 -p 16 -w 16
    2. Cutadapt19 sürüm 1.15 kullanarak bağdaştırıcı dizilerini kaldırın. Bir kılavuz buradan indirilebilir: https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/guide.html.
      Aşağıdaki komutu kullanın:
      Pathway_to_cutadapt/ cutadapt -a TGGAATCTCGGGTGCCAAGG -n 5 -O 4 -m 10 -j 0 --nextseq-trim 10 -o Output_File_Read1_cutadapt.fastq.gz Giriş_File_Read1.fastq.gz.com.gz
      Komuttaki sıranın 4 rasgele nükleotit olmadan 3' HD bağdaştırıcıya karşılık geldiğini unutmayın; bu nedenle bu adım sırasında kaldırılmaz.
    3. Sıralama okumalarında terminal rasgele nükleotitlerin çıkarılması için seqtk (https://github.com/lh3/seqtk) kullanın. Aşağıdaki komutu kullanın (kalın değişken adları):
      seqtk trimfq -b 4 -e 4 Output_File_Read1_cutadapt .fastq > Çıktı_Dosya_Okuma1 _kesilmiş .fastq
    4. 10 nt'den kısa dizileri atmak için aşağıdaki awk komutunu kullanın:
      awk 'BEGIN {FS = "\t" ; OFS = "\n"} {header = $0 ; getline seq ; getline qheader ; getline qheader ; if (length(seq) >= 10) {print header, seq, qheader, qseq}} Output_File_Read1_trimmed.fastq > Length_Filtered.fastq
  2. Kesilmiş dizilerin eşlemi
    1. Çalışma organizmasına karşılık gelen veritabanını miRBase'den aşağıdaki gibi indirin. http://www.mirbase.org/ftp.shtml gidin ve 'mature.fa' dosyasını indirin. Dizilerin RNA gösteriminde gösterildiğini unutmayın. U artıklarını Aşağıdaki komutla T ile değiştirin:
      sed -i '/^>/! s/U/T/g' mature.fa
      NOT: Bu, çeşitli organizmalardan kaynaklanan miRNA'ların tam bir listesini verecektir.
    2. Aşağıdaki komutla organizmanızın ilgi çekici miRNA dizilerini seçin:
      awk 'name_of_the_organism{print; nr[NR+1]; next}; NR içinde nr' mature.fa > olgun_name_of_the_organism_mirs.fa
    3. Bowtie220 (sürüm 2.3.0) hiçbir uyuşmazlıklar izin kullanarak yukarıda oluşturulan dosyaya okuma harita. İlk olarak, aşağıdaki komutla dosyanız için bir dizin oluşturun:
      bowtie2-build mature_name_of_the_organism_mirs.fa mature_name_of_the_organism_mirs
    4. Sıralama okumalarını veritabanına hizalayarak, okumanın haritaları tamamen veritabanının bir miRNA'sına, herhangi bir uyuşmazlık olmadan gerektirmesini gerektirir. Bu amaçla, aşağıdaki aracı kullanın:
      bowtie2 -N 0 -L 10 --score-min C,0,0--uçtan uca --zaman -x mature_name_of_the_organism_mirs -U Length_Filtered.fastq -S Length_Filtered_ALIGNMENT.sam
      NOT: Seçenek: --score-min C,0,0 hizalamanın herhangi bir uyumsuzluk olmamasını sağlar. Araçtaki çeşitli parametrelerin açıklaması için lütfen aşağıdaki web sitesini ziyaret edin: http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/manual.shtml
    5. Hizalamayan okumaları atmak için aşağıdaki komutu kullanın:
      samtools görünümü -F 4 Length_Filtered_ALIGNMENT> Reads_aligned_to_Mirs.sam
      NOT: Bu adımların bir sonucu olarak, şimdi miRNA'lara karşılık gelen hizalanmış okumaları elde etmiş olmalısınız.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kritik adımlar, başlangıç toplam RNA materyalinin küçük RNA fraksiyonunun(Şekil 3)ve istenilen nihai kütüphane ürününün(Şekil 4)izolasyonudur. Her iki adım da poliakrilamid jel saflaştırma içerir; küçük RNA% 15 TBE üre jelleri izole edilir, son kütüphaneler% 6 yerli TBE jelleri izole edilir. Jelden izole edilen küçük RNA küçük bir RNA kapiller elektroforez çipi üzerinde analiz edilebilir (Malzeme Tablosu; Şekil 3

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Küçük RNA kitaplık hazırlığı, özellikle adaptör ligasyon adımları sırasında tanıtılan önyargı nedeniyle zorlu olmaya devam etmektedir. Bitki miRNA'ları, böceklerde, nematodlarda ve memelilerde piRNA ve böceklerde ve bitkilerde küçük müdahale eden RNA'lar (siRNA) gibi 3' ucunda 2'-OMe modifikasyonu olan RNA'ların incelenmesi özellikle zordur çünkü 2'-OMe modifikasyonu 3'-ADAPTÖR ligasyonunu engeller. Literatürde sRNA kitaplık hazırlama protokollerini geliştirmek için bir dizi çözüm önerilmiştir, ancak ticari olarak kullan...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Ulusal Bilimsel Araştırma Merkezi (CNRS), Fransız Alternatif Enerjiler ve Atom Enerjisi Komisyonu (CEA) ve Paris-Sud Üniversitesi tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma için tüm kütüphane hazırlama, Illumina dizilemesi ve biyoinformatik analizleri I2BC Yeni Nesil Sıralama (NGS) tesisinde yapılmıştır. I2BC NGS tesisinin üyeleri, makalenin eleştirel okunması ve yararlı öneriler için kabul edilmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
2100 Biyoanaliz Cihazı AgilentG2939BA
Asit-Fenol: Kloroform, pH 4.5 (IAA ile, 125: 24: 1)ThermoFisherAM9720
Adenozin 5'-Trifosfat (ATP)Nex England BiolabsP0756S
Agencourt AMPure XP boncuklarıBeckman CoulterA63880
Biyoanalizör Yüksek Hassasiyetli DNA KitiAgilent5067-4626
Biyoanalizör Küçük RNA KitiAgilent5067-1548
Corning Costar Spin-X santrifüj tüpü filtreleriSigma AldrichCLS8162-96EA
Karanlık Okuyucu transilluminatörçeşitli suppiers
HotStart PCR Kiti, dNTP'ler ileKapa BiosystemsKK2501
NEXTflex küçük RNA-seq V3 kitiBIOO ScientificNOVA-5132-05isteğe bağlı
Novex TBE jelleri %6ThermoFisherEC6265BOX
Novex TBE Üre jelleri %15ThermoFisherEC6885BOX
QIAquick Nükleotid Temizleme KitiQiagen 28304
Qubit 4 Kantitasyon Başlangıç KitiThermoFisherQ33227
Qubit ssDNA TestKiti ThermoFisherQ10212
RNA Jel Yükleme Boyası (2X)ThermoFisherR0641
RNA Jel Yükleme Boyası (2X)ThermoFisherR0641
RNaz İnhibitörü, Murin Nex England BiolabsM0314S
SuperScript IV Ters TranskriptazThermoFisher18090200
SYBR Altın Nükleik Asit Jel LekesiThermoFisherS11494
T4 RNA Ligaz 1 (ssRNA Ligaz)Nex England BiolabsM0204S
T4 RNA Ligaz 2, kesilmişNex England BiolabsM0242S
TrackIt 50 bp DNA merdivenThermoFisher10488043
TruSeq Küçük RNA Kitaplığı Hazırlık KitiIlluminaRS-200-0012/24/36/48isteğe bağlı
UltraPure GlikojenThermoFisher10814010
XCell SureLock Mini HücreliThermoFisherEI0001
XCell SureLock Mini HücreliThermoFisherEI0001
ZR küçük RNA merdiveniZymo ResearchR1090
son iki sayı indeks kümesine karşılık gelir

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ghildiyal, M., Zamore, P. D. Small silencing RNAs: an expanding universe. Nature Reviews Genetics. 10, 94-108 (2009).
  2. Chang, T. C., Mendell, J. T. microRNAs in vertebrate physiology and human disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 8, 215-239 (2007).
  3. Zhuang, F., Fuchs, R. T., Robb, G. B. Small RNA expression profiling by high-throughput sequencing: implications of enzymatic manipulation. Journal of Nucleic Acids. 2012, 360358(2012).
  4. van Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. Library preparation methods for next-generation sequencing: tone down the bias. Experimental Cell Research. 322, 12-20 (2014).
  5. Munafo, D. B., Robb, G. B. Optimization of enzymatic reaction conditions for generating representative pools of cDNA from small RNA. RNA. 16, 2537-2552 (2010).
  6. Hafner, M., et al. RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries. RNA. 17, 1697-1712 (2011).
  7. Sorefan, K., et al. Reducing ligation bias of small RNAs in libraries for next generation sequencing. Silence. 3, 4(2012).
  8. Sun, G., et al. A bias-reducing strategy in profiling small RNAs using Solexa. RNA. 17, 2256-2262 (2011).
  9. Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing. Nucleic Acids Research. 39, 141(2011).
  10. Zhuang, F., Fuchs, R. T., Sun, Z., Zheng, Y., Robb, G. B. Structural bias in T4 RNA ligase-mediated 3'-adapter ligation. Nucleic Acids Research. 40, 54(2012).
  11. Fuchs, R. T., Sun, Z., Zhuang, F., Robb, G. B. Bias in ligation-based small RNA sequencing library construction is determined by adaptor and RNA structure. PLoS One. 10, 0126049(2015).
  12. Dard-Dascot, C., et al. Systematic comparison of small RNA library preparation protocols for next-generation sequencing. BMC Genomics. 19, 118(2018).
  13. Van Nieuwerburgh, F., et al. Quantitative bias in Illumina TruSeq and a novel post amplification barcoding strategy for multiplexed DNA and small RNA deep sequencing. PLoS One. 6, 26969(2011).
  14. Harrison, B., Zimmerman, S. B. Polymer-stimulated ligation: enhanced ligation of oligo- and polynucleotides by T4 RNA ligase in polymer solutions. Nucleic Acids Research. 12, 8235-8251 (1984).
  15. Song, Y., Liu, K. J., Wang, T. H. Elimination of ligation dependent artifacts in T4 RNA ligase to achieve high efficiency and low bias microRNA capture. PLoS One. 9, 94619(2014).
  16. Zhang, Z., Lee, J. E., Riemondy, K., Anderson, E. M., Yi, R. High-efficiency RNA cloning enables accurate quantification of miRNA expression by deep sequencing. Genome Biology. 14, 109(2013).
  17. Barberan-Soler, S., et al. Decreasing miRNA sequencing bias using a single adapter and circularization approach. Genome Biology. 19, 105(2018).
  18. Chen, Y. R., et al. A cost-effective method for Illumina small RNA-Seq library preparation using T4 RNA ligase 1 adenylated adapters. Plant Methods. 8, 41(2012).
  19. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet. , (2011).
  20. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10, 25(2009).
  21. Shore, S., et al. Small RNA Library Preparation Method for Next-Generation Sequencing Using Chemical Modifications to Prevent Adapter Dimer Formation. PLoS One. 11, 0167009(2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

K k RNA Dizileme2 O Metil RNA TespitiTruSeq Protokol TS5RNA K t phanesi Haz rlamaJel ElektroforeziManyetik Boncuk Safla t rmaAdapt r Ligasyon nhibisyonuBitki MikroRNA AnaliziBowtie2 Dizileme HizalamaKapiler Jel Elektroforezi

İlgili makaleler