Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Kemik İliği Transplantasyon Platformu Greft-versus-Host Hastalığında Dendritik Hücrelerin Rolünü Araştırmak Için

7.5K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/60083

⸱

17 Mart 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Cancer Division, Burnett School of Biomedical Sciences, University of Central Florida, 2Department of Biochemistry, Hanoi University of Pharmacy, 3Center for Cardiovascular Regeneration, Department of Cardiovascular Sciences, Houston Methodist Research Institute, 4Department of Epidemiology, University of Pittsburgh Graduate School of Public Health, 5Division of Cancer Control and Population Sciences, University of Pittsburgh Medical Center, Hillman Cancer Center

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Greft-versus-host hastalığı allojenik kemik iliği transplantasyonu sonrası önemli bir komplikasyondur. Dendritik hücreler greft-versus-host hastalığının patogenezinde kritik bir rol oynarlar. Bu makalede, dendritik hücrelerin greft-versus-host hastalığı nın gelişimindeki rolünü ve greft-versus-lösemi etkisinin araştırılması için yeni bir kemik iliği transplantasyon platformu açıklanmaktadır.

Özet

Allojeneik kemik iliği transplantasyonu (KNOT), tümörlerin kökünü kurutmak için greft-versus-lösemi (GVL) etkisine bağlı hematolojik maligniteler için etkili bir tedavi yöntemidir. Ancak, uygulama greft-versus-host hastalığı gelişimi ile sınırlıdır (GVHD), BMT önemli bir komplikasyon. GVHD donör greftlerinde T-hücreleri alıcı hücreler tarafından ifade alloantijen tanımak ve alıcı sağlıklı dokulara karşı istenmeyen immünolojik saldırılar monte uyarılır. Böylece, geleneksel tedaviler donör T-hücre alloreactivity bastırmak için tasarlanmıştır. Ancak, bu yaklaşımlar gvl etkisini önemli ölçüde bozar, böylece alıcının hayatta kalması iyileştirilmez. Terapötik yaklaşımların BMT, GVL ve GVHD üzerindeki etkilerini anlamak bu nedenle önemlidir. Donör T-hücrelerini uyarmak için antijen sunum ve sitokin salgılayıcı kapasiteleri nedeniyle, alıcı dendritik hücreler (DCs) GVHD indüksiyonönemli bir rol oynamaktadır. Bu nedenle, alıcı DC'leri hedefleme gvhd kontrol etmek için potansiyel bir yaklaşım haline gelir. Bu çalışma, ev sahibi DC'lerin transplantasyon sonrası GVH ve GVL yanıtlarını nasıl düzenlediğini araştırmak için yeni bir BMT platformunun açıklamasını sağlar. Ayrıca transplantasyon sonrası GVHD ve GVL biyolojisini incelemek için etkili bir BMT modeli sunulmaktadır.

Giriş

Allojeneik hematopoetik kök hücre nakli (KT) hematolojik malignitelerin tedavisinde etkili bir tedavidir1,2 greft-versus-lösemi (GVL) etkisi ile3. Ancak, donör lenfositler her zaman alıcı dokulara karşı istenmeyen immünolojik ataklar monte, greft-versus-host hastalığı olarak adlandırılan bir süreç (GVHD)4.

GVHD Murine modelleri GVHD ve GVLyanıtı5 biyolojisini incelemek için etkili bir araçtır. Fareler uygun maliyetli bir araştırma hayvan modelidir. Onlar küçük ve verimli moleküller ve biyolojik geliştirmeninerken aşamalarında ile dosed 6 . Onlar genetik olarak iyi tanımlanmış, çünkü fareler genetik manipülasyon çalışmaları için ideal araştırma hayvanlar, hangi biyolojik yollar ve mekanizmaları incelemek için idealdir6. C57BL/6 (H2b) ile BALB/c (H2d)ve FVB (H2q)→C57BL/6 (H2b)5,7gibi birkaç fare majör histouyumluluk kompleksi (MHC) MHC uyumsuzmodelleri iyi kurulmuştur. Bunlar, bireysel hücre tiplerinin, genlerin ve GVHD'yi etkileyen faktörlerin rolünü belirlemek için özellikle değerli modellerdir. C57/BL/6 (H2b)ebeveyn donörlerinden MHC I (B6.C-H2bm1)ve/veya MHC II (B6.C-H2bm12)mutasyonu olan alıcılara yapılan transplantasyon, hem MHC sınıf I'de hem de sınıf II'de bir uyumsuzluk olduğunu ortaya koymuştur. Bu hem CD4+ ve CD8+ T-hücreleri hastalık gelişimi için gerekli olduğunu göstermektedir7,8. GVHD aynı zamanda 'pro-inflamatuar sitokin fırtınası' olarak bilinen inflamatuar bir kaskad yer almaktadır9. Murine modellerinde en sık kullanılan klima yöntemi x-ray veya 137Cs ile toplam vücut ışınlaması (TBI) yöntemidir. Bu alıcının kemik iliği ablasyon yol açar, böylece donör kök hücre engraftment izin ve greft reddini önlemek. Bu donör hücrelere yanıt olarak alıcı T-hücrelerinin çoğalmasını sınırlayarak yapılır. Ayrıca, genetik eşitsizlikler de küçük MHC-uyumsuzluk10bağlıdır hastalık indüksiyon, önemli bir rol oynamaktadır. Bu nedenle, miyeloablatif ışınlama dozu farklı fare suşlarında değişir (örneğin, BALB/c→C57BL/6).

Donör T-hücrelerinin konak antijen sunan hücreler (AAP' ler) tarafından aktivasyonu GVHD gelişimi için gereklidir. ADC'ler arasında, dendritik hücreler (DCs) en güçlü. Onlar kalıtsal onların üstün antijen alımı nedeniyle GVHD indükleme yeteneğine sahiptirler, T-hücre ko-uyarıcı moleküllerin ekspresyonu, ve patojenik subsets içine T-hücreleri polarize pro-inflamatuar sitokinler üretimi. Alıcı DCs transplantasyon sonrası T-hücre astar ve GVHD indüksiyon kolaylaştırmak için kritik11,12. Buna göre, DCs GVHD tedavisinde ilginç hedefler haline gelmiştir12.

TBI donör hücre engraftment geliştirmek için gereklidir. TBI etkisi nedeniyle alıcı CD'ler aktive edilir ve transplantasyondan sonra kısa bir süre hayattakalır12. Biyolüminesans veya floresan kullanımındaki büyük gelişmelere rağmen, GVHD'de alıcı DC'lerin rolünü incelemek için etkili bir model oluşturmak hala zordur.

Donör T-hücreleri GVL aktivitesi için itici güç olduğundan, t-hücre alloreactivity bastırmak için steroid gibi immünsupresif ilaçlar kullanarak tedavi stratejileri genellikle tümör nüks veyaenfeksiyonneden 13. Bu nedenle, alıcı DC'leri hedeflemek GVL etkisini korurken ve enfeksiyondan kaçınırken GVHD tedavisinde alternatif bir yaklaşım sağlayabilir.

Kısacası, mevcut çalışma, alıcı DC'lerde farklı sinyal türlerinin GVHD gelişimini ve BMT'den sonra GVL etkisini nasıl düzenlediğini anlamak için bir platform sağlamaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Deneysel prosedürler, Central Florida Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı.

1. GVHD İndüksiyon

NOT: Allojeneik kemik iliği (BM) hücre nakli (adım 1.2) ışınlama dan sonra 24 saat içinde yapılır. Aşağıda açıklanan tüm işlemler steril bir ortamda gerçekleştirilir. Bir doku kültürü başlık prosedürü gerçekleştirin ve filtrelenmiş reaktifler kullanın.

  1. 0. Gün: Alıcı fareleri hazırlayın.
    1. Balb/c arka planda (CD45.2+ H2kd+), alıcı olarak 10−12 haftalık dişi yabani fareler kullanın.
    2. TBI'den önce alıcıları tarttırın ve kulak etiketi. Daha sonra, ışınlama odasına en fazla 11 fare yerleştirin ve ışınlayıcıda saklayın. 10−15 dk boyunca 700 cGy tek bir dozda ışın.
    3. Radyasyona maruz kalanlardaki hayvanları kafeslere geri döndürün ve nakilden önce patojensiz tesislerde barındırın.
      NOT: Alıcıların en az vücut ağırlığı yaklaşık 20 g olmalıdır.
  2. 1. Gün: Donör farelerden T-hücre tükenmiş kemik iliği (TCD-BM) hazırlayın.
    1. CD45.1/Ly5.1 C57BL/6 fareleri CO2 boğulma ile ötenazi edin ve bilinçsiz olana kadar 2−3 dk bekleyin. Gerekirse ikincil ötenazi olarak servikal çıkığı gerçekleştirin.
    2. Her fareyi temiz bir çalışma tahtasına koyun. % 70 isopropanol ile kürk ve cilt sanitize.
    3. Forseps ve makas kullanarak her iki bacaktan tibia ve femur toplayın. 50 mL konik tüplerde %1 FCS ve 100 U/mL penisilin/streptomisin ve 2 mM L-glutamin (%1 RPMI) içeren buz gibi RPMI'ye koyun. Femur ve tibia kemiklerini, forceps ve makas kullanarak tüm kas dokularını temizleyerek iyice temizleyin. 50 mL konik tüplerden %1 RPMI içeren 92 mm çapındaki Petri kabına femur ve tibia aktarın.
    4. Makas kullanarak, femur veya tibia uçlarını kesti. 50 mL'lik bir tüpü %1 RPMI 1640 orta ile 25 mL doldurun. Bunu, 26 G iğneye bağlı ve %1 RPMI'lik 3 mL'lik bir şırınga yı doldurmak için kullanın. Bu şırıngayı kemiğe takın ve daldırıcıyı iterek kemik iliğini (BM) boşluktan %1 RPMI (~3 mL/kemik) ile toplama tüpüne boşaltın.
    5. Diğer donör farelerden kalan tüm kaval kemiği ve uyluk kemiği için adım 1.2.4'ü tekrarlayın. Tüm toplama tüplerini buzda tut.
    6. Kemik iliği parçalarını 75 μm mesh hücreli süzgeçten geçirerek tek hücreli süspansiyonu yapın. Tek hücreli süspansiyonu 50 mL'lik bir tüpte toplayın.
    7. 4 °C'de 5 dk için 800 x g santrifüj tüpler. Aspire ve supernatant atın. PBS tamponundaki peletin %0.5 büyükbaş serum albumin (BSA) içeren 20 x 106 hücre/mL'de yeniden askıya alınması. Saflık boyama için 2 x 106 hücreden oluşan bir aliquot kaydedin.
    8. 0,05 μg/106 hücre14 ve 4 °C'de 30 dakika kuluçkaya yat.a 80 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 000 000 00 00 00 00 0 25 mL buz gibi PBS ile bir kez yıkayın. 20 x 106/mL'de %0.5 BSA/10% genç tavşan komplemanı/%2 DNase(steril H2O'da 10.000 U/mL) yeniden askıya alın. 37 °C'de 45 dakika kuluçkaya yatın ve eskisi gibi 2x yıkayın.
      NOT: T-hücreleri Thy1'e özgü bir mAb kullanılarak tükenir, tüm T-hücreleri tarafından ifade edilen bir protein, ancak diğer lökositler tarafından ifade edilmez.
    9. %0.5 BSA içeren PBS tamponunun 20 mL'lik hücrelerini yeniden askıya alın. Kemik iliği hücrelerini hemositometre kullanarak %1 asetik asit tesviye edin. Hücre saflaştırma sonra akış sitometri tarafından saflık kontrolü için 2 x 106 hücreleri bir aliquot tutun.
      NOT: Bir donör fare normalde yaklaşık 25 x 106 TCD-BM üretir.
    10. Başarılı bir T hücresi tükenmesini onaylamak için akış sitometrisini kullanın. 1 x 106 hücreleri, 1.2.7 (T-hücre tükenmesinden önce) ve 1.2.9 (T-hücre tükenmesinden sonra T-BM) aşağıdaki antikorlarla lekeler: α-CD3 (17A2), α-CD4 (GK1.5) ve α-CD8α (53-6.7).
  3. 1. Gün: Donör farelerden T-hücreleri hazırlayın
    1. CD45.2+ H2kb+ C57BL/6 yabani tip (WT) fareleri T hücreleri için donör olarak kullanın.
    2. 1.2.1'de açıklandığı gibi C57BL/6 farelerini karbondioksit (CO2)boğulması ile ötenazi.
    3. Farenin kürkünü ve cildini %70 etanol ile iyice temizleyin. Dalakları ve lenf düğümlerini özelleştirin ve şırınga pistonu ve 40 m örgü süzgeçkullanarak splenositlerin tek hücreli süspansiyonuna ayırın. Tüm splenositleri toplamak için süzgeci ve şırınga pistonu %1 RPMI (%1 FBS içeren RPMI media) ile yıkayın.
    4. Hücre süspansiyonuna 800 x g'de 4 °C'de 5 dakika santrifüj edin. 5 mL ACK lysing tampon (1 mM Na2EDTA, 10 mM KHCO3, 144 mM NH4Cl, pH 7.2) ekinden atılmalıdır. Hücre süspansiyonuna oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatırın.
      NOT: ACK lysis tampon kırmızı kan hücrelerinin lysing için kullanılır.
    5. Lysis durdurmak için% 1 RPMI 5 mL ekleyin. Santrifüj 800 x g'de 5 dk 4 °C'de. Supernatant atın.
    6. Buz gibi manyetik aktive hücre sıralama (MACS) tamponu (%0.5 BSA, PBS'de 2 mM EDTA, pH 7.2) hazırlayın. Kullanmadan önce arabelleği degas edin. 5 mL MACS arabelleğindeki hücre peletlerini yeniden askıya alın.
    7. Splenositleri sayın ve hemositometre ve %1 trippan mavisi kullanarak canlı ve ölü hücreleri kontrol edin. Akış sitometri analizi ile saflaştırma verimini değerlendirmek için 2 x 106 hücreden oluşan bir aliquot kaydedin.
    8. MACS tamponunda 200 x 106/mLkonsantrasyonda splenositleri yeniden askıya alın. 0.03 μL biotin anti-mouse-Ter-119, 0.03 μL biotin anti-mouse-CD11b, 0.03 μL biotin anti-mouse-CD45R ve 0.03 μL biotin anti-mouse-DX5 106 hücre başına ekleyin. 4 °C'de 15 dakika kuluçka.
      NOT: Biotin anti-mouse-Ter-119, biotin anti-mouse-CD11b, biotin anti-mouse-CD45R ve biotin anti-mouse-DX5 sırasıyla eritrosit, granülositler, B-hücreleri ve NK hücreleri ile reaksiyona kullanıldı. Bu nedenle, bu hücre alt kümeleri aşağıdaki adım15tükenmiş.
    9. Hücre süspansiyonuna 10 mL buz gibi MACS tamponu ekleyin. Santrifüj 800 x g'de 5 dk 4 °C'de. Supernatant atın.
    10. MACS arabelleğindeki hücre peletlerini 100 x 106/mL konsantrasyonda yeniden askıya alın. Splenosit süspansiyonuna anti-biyotin mikroboncukları (0.22 μL/106 hücre) ekleyin. İyice karıştırın ve 4 °C'de 15 dakika daha kuluçkaya yatırın. Hücre süspansiyonuna 10 mL buz gibi MACS tamponu yla bir kez yıkayın. 4 °C'de 5 dk 800 x g'de santrifüj edin ve süpernatantı atın.
    11. Manyetik alana manyetik bir ayırma sütunu koyun. 3 mL MACS arabelleği ile sütunu durulayın. Hücre süspansiyonu sütunüzerine bırakın. Yeni bir 15 mL konik tüp içinde, sınırsız, zenginleştirilmiş T-hücrelerinden oluşan akış-through toplamak. MS sütununa 3 mL buz gibi MACS arabelleği ile yıkayın.
      NOT: Yıkama adımlarını gerçekleştirmeden önce sütunun boş olduğundan emin olun.
    12. Hücre süspansiyonuna 800 x g'de 4 °C'de 5 dakika santrifüj edin. 5 mL MACS arabelleğindeki hücre peletini yeniden askıya alın.
    13. Hücreleri hemositometre kullanarak %1 trippan mavisi olarak sayın. Akış sitometrisi tarafından saflık kontrolü için 2 x 106 hücreden oluşan bir aliquot kaydedin.
      NOT: Bu yöntemle izole edilen dalak T-hücrelerinin ortalama verimi fare başına ~20−25 x 106 hücredir.
    14. Akış sitometrisi ile T-hücre zenginleştirme verimini onaylayın. 1 x 10 6 hücreleri, 1.3.7 (T-hücre tükenmesinden önce) ve 1.3.13 (T-hücre tükenmesinden sonra TCD-BM) basamaklarından korunan 1 x 106 hücreleri aşağıdaki antikorlarla lekeler: α-CD3 (17A2), α-CD4 (GK1.5) ve-α-CD8α (53-6.7).
  4. 1. Gün: Işınlanmış farelere donör T-hücreleri ve TCD-BM enjekte edin.
    1. TCD-BM ve T-hücrelerini 2x PBS ile yıkayın (4 °C'de 5 dk için 800 x g). Enjeksiyon için buz gibi PBS hücreleri resuspend. Hücre konsantrasyonu TCD BM için 20 x 106/mL ve T hücreleri için 4 x 106/mLolarak ayarlayın.
    2. Çift taraflı kuyruk damarlarının görünürlüğünü artırmak için bir ısıtma lambası kullanarak hayvan ısıtın. Gerekirse fareyi bir dizginleyiciye yerleştirin.
    3. % 70 isopropanol kullanarak kuyruk yüzeyini temizleyin. TCD-BM (5 x 106 hücre/fare) t-hücreleri (0,75 x 106 hücre/fare) ile enjekte edin. Şırınganın içine hava sokmamaya dikkat edin.
    4. İğneyi çıkarın ve kanamayı durdurmak için doğrudan enjeksiyon bölgesine 5−10 s antiseptik bir bez uygulayın.
  5. GVHD'yi 2−80 gün olarak değerlendirin.
    1. Hayvan hayatta kalma takip edin. Cook ve ark.16 tarafından daha önce kurulan skorlama sisteminden uyarlanan GVHD'nin klinik bulgularını ve alıcı farelerin vücut ağırlığını haftada 2 x izleyin. Vücut kilo kaybıhesaplamak için TBI önce belirlenen vücut ağırlığı kullanın.
    2. Her fareyi ayrı ayrı tartın. Puan aşağıdaki gibi kilo kaybı: grade 0 = az% 10; sınıf 1 = %10−%20; grade 2 = %20'den fazla.
    3. Alıcıların duruş işareti puan: grade 0 = hiçbir önsezi; grade 0.5 = hafif önsezi ama yürürken düzer; sınıf 1 = hayvan yürürken kambur kalır; grade 1.5 = hayvan düzleştirmek değil; grade 2.0 = arka ayak larda hayvan standı.
    4. Alıcıların hareketlilik işareti puan: grade 0 = çok aktif; grade 0.5 = naif farelerden daha yavaş; grade 1.0 = sadece dürttüğünde hareket eder; grade 1.5 = dürttüğünde hafif hareket eder; grade 2.0 = dürttüğünde hareket etmez.
    5. Alıcıların cilt puan: grade 0 = hiçbir aşınma, lezyonlar, ya da ölçekleme; grade 0.5 = belirli bir alanda kızarıklık; grade 1 = bir alanda aşınma veya iki alanda hafif aşınma; grade 1.5 = iki veya daha fazla alanda ciddi aşınmalar; grade 2.0 = şiddetli sıyrıklar, çatlama cilt, kurutulmuş kan.
    6. Alıcıların kürk puan: grade 0 = hiçbir anormal işaretler; grade 0.5 = boyun göbek veya ense tarafında ridging, grade 1.0 = karnının veya boyun tarafı nın veya yan sının; grade 1.5 = unkempt mat ve fırfırlı kürk; grade 2.0 = göbek ve sırt üzerinde kötü mat kürk.
    7. Puan alıcıların ishal: grade 0 = hiçbir ishal; grade 0.5 = hafif ve yumuşak dışkı; grade 1.0 = hafif (sarı dışkı); grade 1.5 = orta (biraz kan ile sarı dışkı); grade 2 = şiddetli (açık sarı ve kanlı dışkı, "kurutulmuş kek dışkı" anal alanda görünür).

2. Kotransplantasyon Modeli

  1. Kemik iliği kaynaklı dendritik hücreler (BM-DCs) oluşturun.
    1. 1.2.3−1.2.4 adımlarında açıklandığı gibi B6 arka planüzerindeki WT veya faktör B (fB)-/- farelerin uyluk ve tiyyanlarından kemik iliği izole edin. Hücreleri 800 x g'de 5 dk döndürün.
    2. Kırmızı kan hücresi lisisi için 5 mL'lik ACK lysing tamponundaki peleti yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonuna 5 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın. 4 °C'de 5 dk için 800 x g'de lisi ve santrifüjü durdurmak için hücre süspansiyonuna %1 RPMI'nin 10 mL'sini ekleyin. Supernatant atın.
    3. Hücre peletlerini 10 mL kültür medyasında (RPMI 1460 %10 FBS içeren, 100 U/mL penisilin/streptomisin, 2 mM l-glutamin ve 50 mM β-mercaptoetanol) yeniden askıya alın ve 2 x 106 hücre/mL'nin son konsantrasyonuna uyacak şekilde ayarlayın.
    4. Hücre süspansiyonuna 20 ng/mL granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) ekleyin. Kültür 100 x 15 mm Petri yemekleri 37 °C 5% CO2 6 gün boyunca kemik iliği hücreleri.
    5. Devam eden kültür ortamının yarısını (yaklaşık 5 mL) 3.
    6. Kültür ortamını 37 °C'de bir su banyosunda ısıtın. Kemik iliği kültür yemeklerinden yaklaşık 5 mL medya toplayın. Santrifüj 800 x g'de 5 dk 4 °C'de. Supernatant atın. 40 ng/mL GM-CSF içeren 5 mL kültür medyasında hücre peletini yeniden askıya alın.
    7. BM-DC'leri olgunlaştırmak için kültürün 6.6
    8. Olgunlaşmış BM-DC'leri toplayın: Petri yemeklerinden CD'leri yumuşak bir şekilde kazımak için hücre kaldırıcıları kullanın. Tüm hücre süspansiyonlarını 50 mL konik tüplerde toplayın. Santrifüj 800 x g, 4 °C'de 5 dk. Supernatant atın. Hücre peletlerini 50 mL buz gibi PBS ile 3 x yıkayın. Akış sitometrisi ile immünolojik fenotip analizi için yaklaşık 2 x 106 BM-DC kaydedin.
  2. BMT (DC-cotransplanting BmT) dendritik hücre ko-transplantasyon gerçekleştirin.
    NOT: T-hücreleri ve BM hücreleri için donör olarak FVB (H2kq)fareler kullanın. 1.100 cGy (2 doz, 3 saat aralık) bir dozda B6 Ly5.1 alıcı fareler ışın. 1.1. adımdaki ayrıntılara bakın.
    1. BM'yi FVB donör farelerin uyluk kemiğinden ve tibiaslarından ayırın. 1.2.3−1.2.10 adımlarında ayrıntılara bakın.
      NOT: Bu modelde TCD-BM yerine toplam izole kemik iliği kullanın.
    2. FVB donör farelerin dalak ve lenf düğümlerinden T-hücrelerini arındırın. 1.3.1-1.3.13 adımlarında ayrıntılara bakın.
    3. Deney kursunun 0. gününde BM-D'lerle (2 x 106/fare) BM(5 x 106/fare), T-hücrelerini (0,5 x 106/fare) enjekte edin.
    4. Transplantasyondan sonraki 3.
      1. Alıcıların gözlerinden kan toplayın.
      2. CD45.1/Ly5.1 B6 farelerini %3 isofluran emdirerek anestezi edin. Bir parmak sıkışmayanıt eksikliği ile anestezi derinliği ni kontrol edin.
      3. Burun düzleminden 30−45° açıyla caudally yönlendirilen gözün medial kanthusuna steril cam pipet tüpü yerleştirin. Tüpü hafifçe döndürürken basınç uygulayın.
      4. Kanı 10 μL heparin içeren steril 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerine bırakın. 5 mL cam akış tüplerine 50 μL kan aktarın.
      5. 2 mL ACK lysing arabelleği ekleyin. 45 dk. 2 mL FACS boyama tamponu ekleyin. Santrifüj 800 x g'de 5 dk 4 °C'de. Supernatant atın.
      6. Uygun akış boyama antikorları içeren 200 μL FACS tamponu içeren hücre peletlerini yeniden askıya alın (canlı/ölüm sarısı, α-H-2Kb,α-CD45.1, α-CD45.2, α-CD11c ve α-MHCII). Karanlıkta 4 °C'de 15 dakika kuluçka. 1 mL FACS arabellek ile 2x yıkayın. 200 μL FACS tampon hücre peletleri resuspend ve akış sitometri ile analiz yapmak.

3. BMT GVHD /GVL Modelleri

  1. GVHD/GVL indüksiyonu gerçekleştirin.
    1. Kültür luciferase RPMI kültür medyada A20 B hücreli lenfoma transduced.
    2. 700 cGy (tek doz) de BALB / c arka plan WT veya Ly5.1 alıcı ışın. 1.1. adımdaki ayrıntılara bakın.
    3. TCD-BM'yi B6'nın uyluk ve tiyyanlarından ayırın. Ly5.1 donör fareler. 1.2.1−1.2.10 adımlarında ayrıntılara bakın.
    4. C57BL/6 donör farelerin dalak ve lenf düğümlerinden T-hücrelerini arındırın. 1.3.1−1.3.15 adımlarında ayrıntılara bakın.
    5. A20 lenfoma 2x'i 25 mL PBS ile yıkayın. Hücre peletlerini 10 mL buz gibi PBS'de yeniden askıya alın. Bir hücre süspansiyon aliquot alın (10 μL) ve% 1 trypan mavi ve hemositometre kullanarak hücreleri saymak. Hücre konsantrasyonu 20.000 hücre/mL olarak ayarlayın.
    6. TCD-BM (5 x 106/fare) T-hücreleri (0,75 x 106/fare) ve A20 lenfoma (5.000 hücre/fare) ile enjekte edin.
    7. Deneysel kurs sırasında alıcının sağkalımını, GVHD klinik bulgularını ve vücut kilo kaybını takip edin. 1.5 adımdaki ayrıntılara bakın.
  2. Biyolüminesans görüntüleme yapın.
    1. Alıcıya 4 mg D-luciferin enjekte ederek, nakledilen alıcıdaki tümör büyümesini izleyin. Luciferin luciferase ile reaksiyona emin olmak için 5 dakika kuluçka.
    2. Bir biyolüminesans görüntüleyici odasında% 3 izofluran kullanarak fare anestezi ve alan D ve 1 dk pozlama süresi 5 dakika için alıcılar görüntü.
    3. Görüntü analiz yazılımLarını kullanarak verileri analiz edin. En iyi sonuçlar için sözde renkli görüntülerin ölçeğini değiştirin.
      NOT: Tüm resimler deneyler arasında aynı ölçekte olmalıdır.
    4. İlgi bölgelerini belirlemek ve her ilgi bölgesinden yayılan akısı (fotonlar/ler) hesaplayarak sinyal yoğunluğunu ölçmek için görüntü analiz yazılımını kullanın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Majör MHC uyumsuz B6 (H2kb)-BALB/C (H2kd)modeli transplantasyon sonrası GVHD gelişimine yakından karşılık gelmektedir (Şekil 2). Cooke ve ark.16 tarafından daha önce tespit edilen altı GVHD klinik bulgunun tümü WT-B6 T-hücreleri ile nakledilen alıcılarda meydana gelmekte, ancak gvhd-negatif grubunu temsil eden BM ile nakledilen alıcılarda (adım 1.5) yer almıyordu. Bu modelde GVHD gelişiminde iki aşama vardır. İlk ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Belirli bir kişiye uygun kök hücre kullanımı gelişmiş ve dirençli kanserlerin tedavisinde etkili bir yaklaşımdır18. Küçük molekül ilaç, ancak, uzun kişiselleştirilmiş kanser tedavisinin birincil odak kalmıştır. Öte yandan, hücresel tedavide donör ve konak arasındaki etkileşimlerin çok sayıda kararlı tedavi sonuçlarını etkileyebilir, BMT sonra GVHD gelişimi gibi1.

BmT'nin MHC'li büyük fare modelleri GVHD'nin biyolojisini anlamada ve tedavide ilaçl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların çıkar çatışması yok.

Teşekkürler

Bu çalışma University of Central Florida College of Medicine start-up hibe (HN), Pittsburgh Üniversitesi Tıp Merkezi Hillman Kanser Merkezi start-up hibe (HL), Amerika Birleşik Devletleri NIH Grant #1P20CA210300-01 ve Vietnam Sağlık Bakanlığı Hibe #4694/QD-BYT (PTH için) tarafından desteklenir. Güney Carolina Tıp Üniversitesi'nden Dr. Xue-zhong Yu'ya çalışma için malzeme sağladığı için teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0,5 M EDTA pH 8,0 100MLFisher ScientificBP2482100MACS tamponu
10X PBSFisher ScientificBP3994MACS tamponu
A20 B hücreli lenfomaCentral Florida ÜniversitesiKurum içiGVL deneyi
ACC1 fl/flJackson Lab30954GVL deneyi
ACC1 fl/fl CD4creCentral Florida ÜniversitesiGVL deneyi
Anti-Biotin Mikro BoncuklarMiltenyi Biotec130-090-485T hücresi zenginleştirme
Anti-İnsan / Fare CD45R (B220)Thermo Fisher Scientific13-0452-85T hücresi zenginleştirme
Anti-fare B220 FITCThermo Fisher Scientific10452-85Akış sitometrisi analizi
Anti-fare CD11c- AF700Thermo Fisher Scientific117319Akış sitometrisi analizi
Anti-Mouse CD25 PEThermo Fisher Scientific12-0251-82Akış boyama
Anti-Mouse CD4 BiotinThermo Fisher Scientific13-0041-86T hücresi zenginleştirme
Anti-Mouse CD4 eFluor & reg; 450 (Pasifik Mavisi & reg; değiştirme)Thermo Fisher Scientific48-0042-82Akış boyama
Anti-fare CD45.1 PEThermo Fisher Scientific12-0900-83Akış sitometrisi analizi
Anti-Mouse CD8a APCThermo Fisher Scientific17-0081-83Akış sitometrisi analizi
Anti-fare H-2Kb PerCP-Fluor 710Thermo Fisher Scientific46-5958-82Akış sitometrisi analizi
Anti-fare MHC Sınıf II-antikor APCThermo Fisher Scientific17-5320-82Akış sitometrisi analizi
Anti-Fare TER-119 BiotinThermo Fisher Scientific13-5921-85T hücresi zenginleştirme
Anti-Thy1.2Bio ExcelBE0066BM nesil
B6 fB-/- farelerCentral Florida ÜniversitesiKurumİçi Alıcılar
B6. Ly5.1 (CD45.1+) farelerCharles River564Donörler
BALB/c farelerCharles River028Nakil alıcıları
C57BL/6 farelerCharles River027Bağışçılar/Alıcılar
CD11bThermo Fisher Scientific13-0112-85T hücresi zenginleştirme
CD25-biotinThermo Fisher Scientific13-0251-82T hücresi zenginleştirme
CD45RThermo Fisher Scientific13-0452-82T hücresi zenginleştirme
CD49b Monoklonal Antikor (DX5)-biyotinThermo Fisher Scientific13-5971-82T hücresi zenginleştirme
Hücre süzgeci 40 uMThermo Fisher Scientific22363547Hücre hazırlama
Hücre süzgeci 70 uMThermo Fisher Scientific22363548Hücre hazırlama
D-LuciferinGoldbioLUCK-1GCanlı hayvan görüntüleme
Fetal Sığır Serumu (FBS)Atlanta Bilogicals R& D sistemiD17051Hücre Kültürü
Akış sitometri tüpleriFisher Scientific352008Akış sitometrisi analizi
FVB / NCrlCharles River207Donors
Lipopolisakarit (LPS)Millipore SigmaL4391-1MGDC olgun
LS sütunuMitenyi Biotec130-042-401Hücre hazırlığı
MidiMACSMiltenyi Biotec130-042-302T hücresi zenginleştirme
New Brunswick Galaxy 170R inkübatörEppendorfGalaxy 170 RHücre Kültürü
Penisilin + streptomisinPenisilin / Streptomisin (10.000 ünite penisilin / 10.000 mg / ml strep)GIBCO15140Medya
RPMI 1640Thermo Fisher Bilimsel11875-093Medya
TER119Termo Balıkçı Bilimsel13-5921-82T hücresi zenginleştirme
Ksenojen IVIS-200Perkin ElmerKsenojen IVIS-200Canlı hayvan görüntüleme
X-RAD 320 Biyolojik IşınlayıcıHassas X-RAYX-RAD 320Tüm Vücut Işınlaması

Kaynaklar

  1. Shlomchik, W. D. Graft-versus-host disease. Nature Reviews Immunology. 7, 340-352 (2007).
  2. Appelbaum, F. R. Haematopoietic cell transplantation as immunotherapy. Nature. 411, 385-389 (2001).
  3. Blazar, B. R., Murphy, W. J., Abedi, M. Advances in graft-versus-host disease biology and therapy. Nature Reviews Immunology. 12, 443-458 (2012).
  4. Pasquini, M. C., Wang, Z., Horowitz, M. M., Gale, R. P. 2010 report from the Center for International Blood and Marrow Transplant Research (CIBMTR): current uses and outcomes of hematopoietic cell transplants for blood and bone marrow disorders. Clinical Transplantation. , 87-105 (2010).
  5. Schroeder, M. A., DiPersio, J. F. Mouse models of graft-versus-host disease: advances and limitations. Disease Model & Mechanism. 4, 318-333 (2011).
  6. Graves, S. S., Parker, M. H., Storb, R. Animal Models for Preclinical Development of Allogeneic Hematopoietic Cell Transplantation. ILAR Journal. , ily006(2018).
  7. Sprent, J., Schaefer, M., Korngold, R. Role of T cell subsets in lethal graft-versus-host disease (GVHD) directed to class I versus class II H-2 differences. II. Protective effects of L3T4+ cells in anti-class II GVHD. Journal of Immunology. 144, 2946-2954 (1990).
  8. Rolink, A. G., Radaszkiewicz, T., Pals, S. T., van der Meer, W. G., Gleichmann, E. Allosuppressor and allohelper T cells in acute and chronic graft-vs-host disease. I. Alloreactive suppressor cells rather than killer T cells appear to be the decisive effector cells in lethal graft-vs.-host disease. The Journal of Experimental Medicine. 155, 1501-1522 (1982).
  9. Lu, Y., Waller, E. K. Dichotomous role of interferon-gamma in allogeneic bone marrow transplant. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15, 1347-1353 (2009).
  10. Abdollahi, A., et al. Inhibition of platelet-derived growth factor signaling attenuates pulmonary fibrosis. The Journal of Experimental Medicine. 201, 925-935 (2005).
  11. Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
  12. Stenger, E. O., Turnquist, H. R., Mapara, M. Y., Thomson, A. W. Dendritic cells and regulation of graft-versus-host disease and graft-versus-leukemia. Blood. 119, 5088-5103 (2012).
  13. Ullmann, A. J., et al. Posaconazole or fluconazole for prophylaxis in severe graft-versus-host disease. New England Journal of Medicine. 356, 335-347 (2007).
  14. Dittel, B. N. Depletion of specific cell populations by complement depletion. Journal of Visualized Experiments. , (2010).
  15. Nguyen, H. D., et al. Metabolic reprogramming of alloantigen-activated T cells after hematopoietic cell transplantation. Journal of Clinical Investigation. 126, 1337-1352 (2016).
  16. Cooke, K. R., et al. An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin. Blood. 88, 3230-3239 (1996).
  17. Nguyen, H., et al. Complement C3a and C5a receptors promote GVHD by suppressing mitophagy in recipient dendritic cells. Journal of Clinical Investigation Insight. 3, (2018).
  18. McNutt, M. Cancer immunotherapy. Science. 342, 1417(2013).
  19. Negrin, R. S., Contag, C. H. In vivo imaging using bioluminescence: a tool for probing graft-versus-host disease. Nature Reviews in Immunology. 6, 484-490 (2006).
  20. Roy, D. C., Perreault, C. Major vs minor histocompatibility antigens. Blood. 129, 664-666 (2017).
  21. Gendelman, M., et al. Host conditioning is a primary determinant in modulating the effect of IL-7 on murine graft-versus-host disease. Journal of Immunology. 172, 3328-3336 (2004).
  22. Li, J., et al. HY-Specific Induced Regulatory T Cells Display High Specificity and Efficacy in the Prevention of Acute Graft-versus-Host Disease. Journal of Immunology. 195, 717-725 (2015).
  23. Zeiser, R., et al. Early CD30 signaling is critical for adoptively transferred CD4+CD25+ regulatory T cells in prevention of acute graft-versus-host disease. Blood. 109, 2225-2233 (2007).
  24. Sadeghi, B., et al. GVHD after chemotherapy conditioning in allogeneic transplanted mice. Bone Marrow Transplant. 42, 807-818 (2008).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Greft l semiye kar etkiT h cre depleksiyonumanyetik boncukla ay rmakemik ili i kaynakl dendritik h crelerFakt r B nakavtMHC uyumsuz modelilusiferaz transd kte edilmi A20
Kemik İliği Transplantasyon Platformu Greft-versus-Host Hastalığında Dendritik Hücrelerin Rolünü Araştırmak Için
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.