Yöntem makalesi

Bireysel Protein Agregalarının Kızılötesi Nanospektroskopi ve Atomik Kuvvet Mikroskobu ile Karakterizeleştirilmesi

DOI:

10.3791/60108

⸱

12 Eylül 2019

 ,  ,  ,  , 
1Centre for Misfolding Diseases, Department of Chemistry, University of Cambridge, 2Institute of Biotechnology, Life Sciences Center, Vilnius University, 3Cavendish Laboratory, Department of Physics, University of Cambridge

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz kızılötesi nanospectroskopi ve yüksek çözünürlüklü atomik kuvvet mikroskobu oligomerik agregalar ve amiloid fibrils içine protein kendini montaj sürecini görselleştirmek için uygulama açıklar, yakından başlangıç ve geliştirme ile ilişkilidir insan nörodejeneratif bozuklukların geniş bir yelpazede.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protein yanlış katlama ve toplama olgusu, Alzheimer ve Parkinson gibi nörodejeneratif durumlarla ilişkili yüksek heterojen protein agregalarının oluşumuna neden olur. Özellikle düşük molekül ağırlıklı agregalar, amiloid oligomerler, jenerik sitotoksik özelliklere sahip olduğu gösterilmiştir ve demans birçok formları nörotoksinler olarak karıştığı gösterilmiştir. Konvansiyonel yapısal yöntemlerle incelenmesi zor olan bu agregaların morfolojik, yapısal ve kimyasal özelliklerini karakterize etme gibi zorlu bir görevi ele almak için atomik kuvvet mikroskobu (AFM) dayalı yöntemlerin kullanımını gösteriyoruz. heterojenlik leri ve geçici doğası nedeniyle yöntemler veya toplu biyofiziksel yöntemler. Tarama sondamikroskopi yaklaşımları artık nanometre çözünürlüğü ile amiloid agregaların morfolojisini araştırma yeteneğine sahiptir. Burada, AFM'nin yüksek çözünürlüğünü ve IR spektroskopisinin kimyasal tanıma gücünü aynı anda kullanan kızılötesi (IR) nanospektroskopinin (AFM-IR) daha ileri gidebileceğini ve bireyin yapısal özelliklerinin karakterizasyonunu mümkün kılabilir. protein agregaları, ve böylece toplama mekanizmaları içine anlayışlar sunuyoruz. Tarif ettiğimiz yaklaşım, protein derlemelerinin küçük moleküller ve antikorlarla etkileşimlerinin araştırılmasına da uygulanabildiği için, tanı veya tedavi etmek için yeni terapötik bileşikler geliştirmek için temel bilgiler sunabilir. nörodejeneratif bozukluklar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dünya çapında 40 milyondan fazla insan şu anda nörodejeneratif bozukluklar etkilenir, Alzheimer gibi (AD)1 ve Parkinson (PH)2 hastalıkları. Daha genel olarak, elliden fazla patoloji protein misfolding ve agregasyon ile moleküler düzeyde ilişkilidir, çözünmez fibriller protein agregalarının çoğalmasına yol açan bir süreç, amiloid mevduat olarak bilinen3, 4. Nörodejenerasyonun moleküler kökenleri ve amiloid oluşumuna yol açan proteinlerin protein konformasyonel değişiklikleri ile bağlantıları, ancak, heterojen yüksek düzeyde nedeniyle büyük ölçüde belirsiz liğini koruyor, geçici doğa ve nanoölçek patolojik agregaların boyutları4,5.

Son birkaç on yıl içinde protein yapıları son derece başarılı araştırmalar x-ışını kristalografisi, kriyo-elektron mikroskobu ve nükleer manyetik rezonans spektroskopisi 5 dahil olmak üzere toplu yöntemlerin kullanımı, yaygın olarak dayanmaktadır5, 6.000 , 7.000 , 8.000 , 9. Teknikleri bu sınıf içinde, kızılötesi (IR) spektroskopi proteinler 8 gibi biyolojik sistemlerin kimyasal özelliklerini çözmek için hassas bir analitik araç olarak ortayaçıkmıştır. IR yöntemleri, protein sekonder ve kuaternary yapısal değişikliklerin yanlış katlama ve toplama sırasında nicelleştirilmesine olanak sağlar. Buna ek olarak, mikroskobik düzeyde daha fazla şifreyi çözmek için onların toplama sırasında protein karmaşık serbest enerji manzara dahil mekanistik ayrıntıları, önemli bir ilerleme karmaşık genişletmek için kimyasal kinetik araçların geliştirilmesi olmuştur amiloid fibrilsoluşumu5,6,7,10,11,12dahil olmak üzere kendi kendine montaj yolları . Ancak, toplu spektroskopik yöntemler, çözeltide bulunan veya belirli mikroskobik adımlarda yer alan türlerin heterojen topluluğu hakkında sadece ortalama bilgi sağlayarak bireyin biyofiziksel özelliklerinin araştırılmasını sağlar. nanoölçekli düzeyde zorlu toplu türler13,14.

Son yıllarda ışığın kırınım sınırından daha küçük ölçeklerde çalışma kapasitesine sahip çeşitli mikroskopi teknikleri ortaya çıkmıştır. Bu yöntem sınıfı elektron mikroskobu (EM) ve atomik kuvvet mikroskobu (AFM) içerir. Taramalı elektron mikroskobu (SEM) ve iletim elektron mikroskobu (TEM) bir numunenin iki boyutlu (2D) görüntülerini sağlarken, AFM son yıllarda üç boyutlu (3D) morfolojileri incelemek için güçlü ve çok yönlü bir teknik olarak ortaya çıkmıştır. nanometre çözünürlüğü 13 , 14,15,16,17,18,19, 20.000 , 21.000 , 22.000 , 23.000 , 24.000 , 25.000 , 26.000 , 27- AFM ile protein toplama eğitiminin ardındaki mantık, bu yaklaşımınçözelti13,14,16, 17,19,20,21,25,27,28,29,30, 31,32,33,34,35,36,37. Özellikle, zaman bir fonksiyonu olarak örnek izleyerek, AFM mümkün takip etmek ve amiloid oluşumu 23 yollarını görselleştirmek için yapar, örnek içinde türlerin morfolojisi evriminin araştırılmasına olanak sağlar23, 25,38,39,40,41,42. Ayrıca, AFM kesitsel yükseklikleri ve çözelti13mevcut bireysel türlerin uzunlukları gibi yapısal parametrelerin sayısallaştırılması nı sağlar 13,19,30,31 ,32,33,34,35,36,37,40,43, 44.000 , 45.000 , 46.000 , 47.000 , 48- Ancak, morfoloji gibi tek bir biyofiziksel özelliğin incelenmesi, heterojen ve karmaşık biyolojik sistemleri incelerken genellikle yeterli değildir. AFM, SEM veya TEM görüntüleme yöntemleri tek başına nano ölçekte amiloid agregalarının heterojen türlerinin kimyasal özelliklerini kolayca ortaya çıkaramaz.

Bu ölçekte heterojen biyolojik örneklerin analizi için önemli bir ilerleme son zamanlarda kızılötesi nanospektroskopi (AFM-IR)24,26protein toplama alanına geliştirme ve uygulama ile yapılmıştır, 38,42,49,50,51,52. Bu yenilikçi yöntem, AFM'nin (~1−10 nm) uzamsal çözünürlüğünün IR'nin kimyasal analiz gücüyle birleşiminden yararlanır. AFM-IR tekniği, IR lazeri tarafından yönlendirilen fototermal rezonans etkisinin ölçümü ve AFM ucu ile araştırılanın camı termal genleşmenin ölçümü üzerine dayanır. Örnek, geleneksel kızılötesi spektroskopi24,42,52,53 gibi, toplam iç yansıma doğrudan üst veya alttan IR lazer ile aydınlatılabilir . IR lazer kilohertz (1−1000 kHz) yüzlerce sırayla tipik frekansları ile darbeli olabilir ve geniş bir spektral aralık üzerinde ayarlanmış, genellikle arasında 1000−3300 cm-1. Lazer kaynağı ~30 μm çapında bir alanı kapsa da, AFM-IR tekniğinin mekansal çözünürlüğü, sistemin yerel ısıgenliğini algılayan AFM uç çapı ile nominal olarak belirlenir. AFM-IR biyolojik numuneleri incelemek için uygundur, çünkü IR sinyali kalınlığı 1−1,5 μm'ye kadar orantılıdır ve ortaya çıkan IR spektrumları genellikle ilgili FTIR iletim spektrumları13,54 ile uyum içindedir ,55. Bu nedenle, spektroskopide yerleşik analiz yöntemleri, kimyasal değişimlerin incelenmesi, bant şekli değişimi ve ikinci türevlerin analizi ile de-kıvrım gibi kolayca uygulanabilir52. Genel olarak, AFM'nin uzamsal çözünürlüğünü IR spektroskopisinin kimyasal tanıma gücüyle birleştiren AFM-IR, nano ölçekte bir numunenin çok çeşitli morfolojik, mekanik ve kimyasal özelliklerinin aynı anda elde edilmesini sağlar.

Burada, in vitro floresan tahlilleri, yüksek çözünürlüklü AFM görüntüleme ve nano ölçekli AFM-IR kombinasyonunu kullanan protein toplama sürecinin karakterizasyonu için bir protokol gösterilmektedir. Bu kombine yaklaşım, protein agregalarının oluşturduğu bireysel mikro damlacıkların kimyasal ve yapısal özelliklerinin incelenmesinde, sıvı-sıvı protein faz ayrıştırma çalışmalarında ve nanoölçekte23, 26,38,45,50,53,bireysel toplu türlerin heterojenite ve biyofiziksel özelliklerini araştırmak , 56,57.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Floresan levha okuyucular üzerinde toplama tahlilleri

NOT: Burada açıklanan protokol, herhangi bir protein veya peptidin kimyasal kinetik ile nasıl toplandığının incelenmesine bir örnektir. Özellikle, Alzheimer hastalığının başlangıcı ve ilerlemesi nde yer alan Aβ42 peptid, agregasyon incelemek için optimize edilmiş bir protokol açıklar58,59. Benzer bir protokol ayarlanabilir ve herhangi bir protein veya peptid toplama çalışma doğru kabul edilebilir.

  1. Aβ42 içeren protein fraksiyonlarını ayırt etmek için iyon değişimi ve boyut dışlama kromatografi teknikleri ile Aβ42'nin son derece saf monomerik çözeltisini elde etmek ve monomerik fraksiyonu Elde edilen Aβ42'nin diğer toplam formlarından ayırmak için58 , 59.
  2. Aβ42 peptidini 20 mM sodyum fosfat tamponunda seyreltin, pH 8.058'de 200 μM EDTA'yı 1−5 μM arasında değişen bir nihai konsantrasyona 1,5 mL düşük bağlamalı tüplerde seyreltin. AFM ölçümleri için toplanan numuneler, AFM analizi için numune birikimi sırasında eserler getirebileceğinden, agregasyon tahlillerinde (tioflavin T, ThT) kullanılan floresan boyayı içermemelidir. Böylece, iki özdeş çözeltinin triplicates hazırlamak: i) Ilk içeren monomerik Aβ42 AFM tarafından toplama sürecini takip etmek; ii) agregasyonk kinetik izlemek için bir izleyici olarak 20 μM ThT ekolarak Aβ42 monomerik içeren ikinci.
    NOT: Buz üzerinde 1.1 ve 1.2 adımlarını gerçekleştirmek önemlidir. Bu yordam, monomerik Aβ42 çözeltisinin plaka okuyucuda başlatılana kadar toplamını sağlamamasını sağlamaktır. Numuneleri işlerken, protein örneğini etkileyebilecek hava kabarcıklarının ortaya çıkmasına karşı dikkatli pipetleme esastır.
  3. Pipet, her bir numunenin her bir kuyuda, açık alt ve bağlayıcı olmayan yüzeylere sahip 96 kuyulu, yarım alanlı siyah polistiren plakası.
  4. Plakayı, numunenin toplama süresince buharlaşmasını en aza indirmek için bir folyo ile kapatın.
  5. Plaka okuyucunun sıcaklığını 37 °C'ye dengeleyin.
  6. 440 nm uyarma dalga boyunda ve 480 nm emisyon dalga boyunda, sabit zaman-nokta aralıklarında floresan ölçümleri okumak için toplama protokolünü ayarlayın. Toplama quiescent koşullarda başlatılmalıdır.
  7. Plakayı plaka okuyucusuna takın.
    NOT: Plaka yı çalıştırmadan önce agregasyonun tetiklenmediğinden emin olmak için plakayı kullanırken dikkatli olmak önemlidir. Her numunenin floresansının en iyi şekilde okunmasını sağlamak için kazanç ayarlama ayarlarını kullanın.
  8. Ölçümü başlatın.
    NOT: ThT floresan sigmoidal eğrisi plato58'eulaştığında toplama deneyi sonuçlandırılır.

2. AFM ve nano-IR ölçümleri için numune hazırlama

  1. Yapıştırıcı sekmeler veya çift taraflı bant kullanarak yüksek kaliteli manyetik paslanmaz çelik diske yapıştırıcı en kaliteli kaliteV1 mika disk.
  2. Mika yüzeyine yapışkan bant bir parça yerleştirerek ve mika üst tabakası çekerek mica etch. Bu işlem, numune birikimine uygun temiz, atomik olarak düz bir yüzey üretecektir.
    NOT: Kazınan yüzey düzgün ve pürüzsüz olmalıdır.
    DİkKAT: Yeni kazınmlı mikanın üzerine doğrudan dokunmayın veya nefes almayın, çünkü bu eserler tanıtacak.
  3. Proteinin toplama işlemi sırasında ilgi çekici zaman noktasını toplamak için plaka okuyucu ölçümünü duraklatın/durdurun.
  4. Sızdırmazlık folyosunun çıkarılmasını ve tht olmadan numunelerin 10 μL aliquot'ünü kuyudan 1,5 mL düşük bağlamalı tüplere toplayın.
  5. Numunenin 10 μL'sini taze kazınan mikanın üzerine yatırın. AFM-IR ölçümleri için numuneler taze soyulmuş altın alt tabakaüzerine yatırılmalıdır.
  6. Fizyorbasyon alabilmek için mikadaki çözeltiyi 1 dk kuluçkaya yatırın.
    NOT: Daha uzun kuluçka süresi yüzeyde daha iyi emilimi sağlayacak ama yapay öz-organizasyon ve kendi kendine montaj neden olabilir25. Bu etkilerden kaçınmak için, sprey birikimi25yararlanılabilir.
  7. 1 mL ultra saf su ile üç kez durulayın.
  8. Hava ortamında numuneyi ölçmek için hafif bir azot akışı altında kurulayın.

3. Protein agregalarının morfolojisinin AFM görüntülemesi

NOT: Morfoloji ölçümleri hem temas hem de dinamik modda yapılabilir, aşağıdaki adımlarda, numunenin 3Boyutlu morfolojisini yüksek çözünürlükte ölçmek için lateral kuvvetleri azalttığı için ikincisi açıklanmıştır. AFM-IR ölçümleri, AFM-IR sinyal-gürültü oranını artırmak için temas modunda yapılacaktır.

  1. Sistemin termal stabiliteye ulaşmasını sağlamak için ölçümlerden en az 30 dakika önce AFM sistemini açın. Kurulum'atıklayın, ardından Probe'da. Sonda Değiştir penceresinde Z, Odak Aşaması'nıhazırlamak için İleri'ye tıklayın.
  2. AFM ışın anahtarını kapatın (açıksa). Güvercin kuyruğu kilitlerini açın, kafanın sistemden bağlantısını kesin ve Sonda Değiştir penceresinde İleri'yetıklayın.
  3. AFM kantilini sonda tutucuya monte edin. Kafayı sisteme bağlayın ve güvercin kuyruğu kilitlerini kilitleyin.
    NOT: Dinamik modda biyolojik numuneleri incelemek için optimal kantileverler 2−40 N m-1 arasında değişen yay sabiti ve 2−8 nm14arasında değişen bir apeks yarıçapına sahiptir.
  4. AFM lazer ışını anahtarını açın ve Sonda Değiştir penceresinde İleri'yetıklayın.
  5. Açılan pencerede cantilever türü değişmediyse Hayır'ı tıklatın. Cantilever'i bulmak için optik hizalama düğümlerini ayarlayın. Cantilever üzerine odak ayarlayın ve İleritıklayın.
  6. Açılan pencerede odak kantilever ise Evet'e tıklayın.
  7. Algılama lazerinin konumunu kontrol eden düğümleri kullanarak lazer ışınını kantilin in sonuna yerleştirin. Konuma duyarlı fotodiyot (PSPD) üzerindeki saptırılmış lazer ışınının konumunu kontrol eden düğümleri kullanarak dört dörtlük fotodiyot ile ölçülen toplam sinyali en az >1 V'a kadar en üst düzeye çıkarın. Sonda Değiştir penceresinde İleri'ye ve ardından Kapat'atıklayın.
  8. Kantilin termal stabiliteye ulaşması için 15 dk bekleyin. Gerekirse PSPD üzerinde saptırılmış lazer ışınının konumunu kolayca hazırlayın.
  9. NCM SWEEPtıklayın, salınım istenilen genlik seçin, Kullanım Aşamasıtıklayın , otomatik tıklayın ve bir yaklaşık 300 kHz olan salınım, ilk ücretsiz rezonans maksimum yakın cantilever ayarlayın 40 N m-1yay sabiti ile cantilever .
    NOT: Kantilin serbest rezonansının maksimumundan çıkarılması, ölçümlerin daha yüksek stabilitesini sağlar14.
  10. Numuneyi numune tutucuya yerleştirin. Uygun görüntüleme parametrelerini seçin. Tipik tarama hızı 1 x 1 μm2 ila 5 x 5 μm2'likbir tarama alanı için 0,3−1,0 Hz'dir. Gerekli tipik çözünürlük 256 x 256 ve 1024 x 1024 piksel arasındadır. Tarayıp boyutunu ve piksel numarasını seçmek için Scan Alanını tıklatın.
  11. Optik görünümü örneğe odakla. Örnek yüzeyine yaklaşmak için Yaklaşım'a tıklayın. Yaklaşma tamamlandıktan sonra AFM ucunu numunenin yüzeyinden 100 μm üzerine çıkarmak için Lift 100 μm'ye tıklayın. Örneğin optik görüntüsünü Genişlet'i tıklatın. Görünümü örnek yüzeyine odaklamak için Odak Aşaması çubuğuna tıklayın.
  12. İlgi örneği bölgesinde hareket etmek için okları kullanın. Yaklaş düğmesine basarak yüzeyi meşgul edin. Line Tcan düğmesine tıklayın ve ucun yüzeyi iyi izleyip takip edip olmadığını kontrol edin, gerekirse Set Noktasınıayarlayın.
  13. Scan düğmesine basarak örnek yüzeyini görüntülemeye başlayın. Görüntüleme sırasında, büyük görüntüleme kuvvetinden kaçınmak ve bağımsız numunelerin tutarlılığını korumak için Δ20°42'yigeçmeyen sabit bir faz değişimi rejimini koruyun.
  14. Dosya adını girin ve edinilen görüntünün kaydedileceği temel dizini seçin.

4. Protein agregalarının kızılötesi nanospektroskopi ölçümleri

  1. Termal stabilizasyon ölçümleri öncesinde AFM-IR sistemini ve kızılötesi (IR)lazer60 30−60 dk'yı açın. AFM-IR cihazları için tipik lazerler optik parametre osilatörleri (OPO) ve kuantum basamaklı lazerlerdir (QCL).
  2. Cihazı kontrol etmek için yerleşik yazılımı açın. Yeni bir nanoIR dosyasını açmak için dosyaya ve ardından yeni ye tıklayın. AFM-IR sistemini başlatmak için düğmeye basın.
  3. AFM-IR sistemine alet kapağını açın ve numuneyi temas modunda ölçmek için nominal yarıçapı 30 nm olan silikon altın kaplama prob ve 0,2 N/m yay sabiti monte edin.
  4. Bölüm AFM sondasında Yükle'ye tıklayın ve ardından. Sonda bölümüne odaklanArak kamerayı kantilever'e odaklamak için oklara tıklayın. Kesit örnek XY hareketi,kantilever sonuna çapraz hava yerleştirmek için oklar kullanın.
  5. Algılama lazerinin konumunu kontrol eden düğümleri, lazeri kantilinin sonunda konumlandırmak için döndürün. Dört dörtlük fotodiyot tarafından ölçülen toplamı algılamak ve en üst düzeye çıkarmak için lazer düğümlerini döndürün ve bir değere >3 V. Kavrama sapmasını -1 V'e ayarlamak için sapma düğmesini döndürün ve sonra sonrakinitıklatın. Enstrümanın kapağını kapatın.
  6. Örnek üzerinde bölüm odak kamera örnek odaklanmak için okları kullanın. Daha sonra, kesit örneğinde XY hareketi, numunenin ilgi alanında hareket etmek için okları kullanın ve yaklaşmaya tıklayın ve devreye girin.
  7. Mikroskop penceresinde, numunenin biyofiziksel özelliklerini haritalamak için ilgi kanalları nın girişleri olarak seçin. Özellikle, morfoloji için yükseklik seçin, IR emilimi için Genlik 2 ve pll frekansı harita ipucu örnek temas rezonans.
  8. Denetim penceresinin AFM tarası bölümünde, bölüm 3'teki gibi benzer parametreler kullanın (örneğin, 0.1−1.0 Hz tazyik hızı, 256 x 256 ile 1024 x 1024 piksel arasında). Örnek pürüzlülüğe göre kazançların değerini seçin: integral I = 1−10 ve orantılı P = 10−30. Ardından, bir morfoloji haritası elde etmek için teşle'ye tıklayın.
    NOT: Morfoloji benzer şekilde dinamik dokunma modunda ölçülebilir, ancak AFM-IR ölçümleri burada iletişim modunda gürültü oranlarına daha yüksek sinyal esahip olmak için yapılır.
  9. Morfolojinin haritalaması tamamlandıktan sonra, mikroskop penceresinde, sondayı bir agreganın üstüne konumlandırmak için yükseklik haritasına tıklayın. Daha sonra kontrol penceresinin nanoIR bölümünde, ÖRNEĞI IR lazerle aydınlatmak için start IR'ye tıklayın.
  10. Kızılötesi lazeri kantilever'e odaklamak için optimizasyonatıklayın. Bu pencerede, örneğin yüksek emiciliğe sahip olacak bir dalga numarası yazın ve ekle'yetıklayın. Protein için tipik bir değer 1655 cm-1'dir. IR lazer konumunu bulmak için tarayıp güncellemeye tıklayın ve konumunu kantilever ile hizalamak için güncelleme'ye tıklayın. Pencereyi kapat.
  11. NanoIR ayarı bölümünde, göreli alanda yüksek emicilik beklenen bir dalga numarası yazın. Daha sonra, Bant Geçiş Filtresi seçeneğini devre dışı bırakın ve sayaç okumave cantilever yanıtı hızlı Fourier dönüşümü (FFT) bakmak. FFT penceresinde cantilever rezonans frekansını okumak için yeşil imleci hareket ettirin. Kantilevers rezonans FFT tipik bir değeri yaklaşık 300 kHz olduğunu. Bu rezonans frekans değerini freq. orta alandaki genel bölüme yazın ve 50 kHz'lik bir freq. pencere kullanın.
    NOT: Sayaç okumasını doygunlaştırmayacak, kantilever yanıtında bozulma olmayacak ve numuneyi aşırı ısıtmayacak kadar düşük bir lazer gücü seçin.
  12. Rezonans geliştirilmiş modunu kullanmak için lazer darbe ayar penceresine tıklayın. 300 kHz'lik bir frekans merkezi, 50 kHz'lik bir ayar aralığı ve %5'lik lazer görev döngüsü seçin. Lazerin nabız hızını süpürmek için edinme üzerine tıklayın. Grafikteki imleci kullanarak, lazer darbesini, IR ışığını emen numunenin termal genişlemesinin mekanik tepkisinin frekansına ayarlayın. Ardından, örnek ve ipucu arasındaki temas rezonansını izlemek için PLL seçeneğini belirleyin. PLL penceresindeki sıfır düğmesine basın ve örnek uçlu kontak rezonansını izlemeyi etkinleştirin. Integral kazanç I = 0,5 ve orantılı kazanç P = 10 seçin. Pencereyi kapat.
  13. Optimizasyon penceresini tekrar açın ve numunenin ana emici bantlarına (amide bant I-II-III) karşılık gelen en az 3 dalga numarası ve lazerin her çipi için en az bir dalga numarası için IR lazerin konumunu bulun.
  14. Araçlar 'a tıklayın | IR Arka Plan Kalibrasyonu | Yeni. Pencerede spektroskopik ilgi bölgesini seçin (protein örneklerini incelemek için 1800−1200 cm-1); adım 4.12'de belirlenen aynı nabız oranını ve %5'lik bir görev döngüsünü seçin; hızlı edinimi tıklayın ve lazer hızı seçin, bir kuantum basamaklı lazer için tipik aralığı 20−500 cm-1arasındadır. IR lazer arka planı ölçmek için edinme'ye tıklayın. Bu arka plan spektrumu ölçülen nano ölçekli yerelleştirilmiş spektrumların normalleştirilmesi için kullanılacaktır. Pencereyi kapat.
    NOT: Hızlı lazer ve rezonans gelişmiş modu yoksa, adım 4.12'yi atlayın ve hem arka planda hem de IR spectra edinme pencerelerinde hızlı yerine adımlı spektrumları seçin. Ancak, tek bir toplu duyarlılık ulaşılamayacaktır.
  15. IR spektrum ayarlarında, 1−4 cm-1 ve en az 64x ortak ortalamalar arasında bir IR spektrum çözünürlüğü seçin. Protein aralığında (1800−1200 cm-1)nano ölçekli lokalize IR spektrumu ölçmek için satın almak tıklayın.
  16. Nano ölçekli çözümlenmiş kimyasal harita elde etmek için IR görüntüleme seçeneğini seçin, bir dalga sayısı seçin (örn. amide bandı I için 1655 cm-1) ve AFM taraması penceresindeki taramaya tıklayın.
  17. Eşleme tamamlandıktan sonra dosyaya gidin ve ölçümleri kaydedin. Morfoloji, temas rezonans ve kimyanın edinilmiş haritalarını ve nano ölçekli yerelleştirilmiş spektrumları analiz etmek için yerleşik AFM görüntü işleme yazılımını kullanın. Spectra ve Görüntüler ticari yazılımile daha ayrıntılı analiz için .csv veya .axz dosyaları olarak kaydedilebilir.

5. Kesitsel boyutların görüntü işleme ve analizi

  1. Düzleştirmek ham görüntüler14,17,19,41,42,59 dahili AFM görüntü işleme yazılımı veya ticari yazılım kullanarak.
    NOT: Agregalar, analiz eserlerinden ve ölçülen yüksekliklerinin küçümbirini önlemek için hesaplamadan maskelenmelidir.
  2. Görüntüyü 0 sipariş düzlemine uygun çıkarma ile düzleştirir.
  3. Görüntüyü düzleme düzleştirir ve 1st regresyon sırasına göre satır satır, ikinci adım görüntünün çizgi profilindeki düz taban çizgisine ulaşılıncaya kadar yinelenir.
  4. Örnek çok kalabalıksa, son derece yüksek agregalar içeriyorsa veya tarayıcı yay artefaktı mevcutsa,2.
  5. Fibril eksene dik olarak alınan bir çizgi profilinden toplam yüksekliği ve genişliği ölçün14,17,19,41,42,59.
  6. Fibril uzunluğunu fibril eksenine paralel olarak ölçün14,17,19,41,42,59.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aβ42 toplamanın temsili bir zaman rotası, ThT floresan tetkik ile ölçüldüğünde, Şekil 1'degösterilmiştir. Toplama işlemi genellikle bir sigmoidal eğri ile karakterizedir, bir gecikme fazı başlangıçta gözlenen nerede, ve dik bir büyüme aşaması tarafından takip, eğri bir plato ulaşmadan önce bir denge sabit devlet ulaşıldığında6,7 , 58. Toplama işlemleri58ile ilgili moleküler a...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokoldeki ilk kritik adım, 1.1 ve 1.2 adımlarında tanımlanan Aβ42 çözeltisi gibi monomerik proteinlerin hazırlanmasıdır. Oligomerik veya birleştirilmiş türlerin varlığı, toplama kinetiğinin yetersiz tekrarlanabilirliğine neden olabileceğinden ve AFM'deki eserleri ikna edebileceğinden, sonderece saf, monomerik bir çözeltiden toplama işlemini başlatmak esastır. ölçümler (örn. fibriller türler agregasyonun ilk aşamalarında belirgin olacaktır), bu da verilerin yanlış yorumlanmasına yol açabilir....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar İsviçre Ulusal Bilim Vakfı'na (SNF) mali destek için teşekkür (hibe numarası P2ELP2_162116 ve P300P2_171219), Darwin College, Erasmus+ programı için mali destek için (hibe numarası 2018-1-LT01-KA103-046719-15400-P3) ve bu sonuçlara yol açan araştırmalar, Avrupa Birliği'nin Yedinci Çerçeve Programı (FP7/2007-2013) kapsamında Avrupa Araştırma Konseyi'nden ERC hibe PhysProt (anlaşma numarası 337969), Newman Vakfı (T.P.J.K.) ve Cambridge Misfolding Hastalıkları Merkezi (C.G., M.V., ve T.P.J.K.).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
AFM-IR sistemiAnasys InstrumentsnanoIR 2 veya 3Temas ve rezonans modunda termal genleşmeyi ölçmek için sistemler
Corning 96 kuyulu Yarım Alan Siyah/Şeffaf Alt Polistiren NBSMikroplaka Corning3881
Corning Mikroplaka Alüminyum Sızdırmazlık BandıCorning6570
Çift Taraflı Yapışkan DisklerAGAR ScientificAGG3347N
FLUOstar Omega BMGLabtech415-101Plaka Okuyucu
Mika Disk 10mm V1AGAR BilimselAGF7013
Park NX10 AFM sistemiParkSistemleri N/AAtomik Kuvvet Mikroskobu
Ornitorenk Ultra Düz Altın CipsOrnitorenk TeknolojileriAU.1000.SWTSG
PPP-NCHR-10 konsollarPark SistemleriPPP-NCHR-10
Protein LowBind Tüpleri, 2.0 mLEppendorf30108132
Silikon altın kaplı konsollarAnasys InstrumentsPR-EX-nIR2
SPM Numune Diskleri 12mmAGAR ScientificAGF7001

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Selkoe, D. J., Hardy, J. The amyloid hypothesis of Alzheimer’s disease at 25 years. EMBO Molecular Medicine. 8, 595-608 (2016).
  2. Poewe, W., et al. Parkinson disease. Nature Reviews Disease Primers. 3, 1-21 (2017).
  3. Chiti, F., Dobson, C. M. Protein misfolding, functional amyloid, and human disease. Annual Review of Biochemistry. 75, 333-366 (2006).
  4. Chiti, F., Dobson, C. M. Protein misfolding, amyloid formation, and human disease: A summary of progress over the last decade. Annual Review of Biochemistry. 86, 27-68 (2017).
  5. Knowles, T. P. J., Vendruscolo, M., Dobson, C. M. The amyloid state and its association with protein misfolding diseases. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15, 384-396 (2014).
  6. Meisl, G., et al. Molecular mechanisms of protein aggregation from global fitting of kinetic models. Nature Protocols. 11, 252-272 (2016).
  7. Knowles, T. P. J., et al. An analytical solution to the kinetics of breakable filament assembly. Science. 326, 1533-1537 (2009).
  8. Barth, A. Infrared spectroscopy of proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1767, 1073-1101 (2007).
  9. Fitzpatrick, A. W. P., et al. Atomic structure and hierarchical assembly of a cross- amyloid fibril. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 5468-5473 (2013).
  10. Cohen, S. I. A., et al. Proliferation of amyloid-β42 aggregates occurs through a secondary nucleation mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 9758-9763 (2013).
  11. Michaels, T. C. T., Lazell, H. W., Arosio, P., Knowles, T. P. J. Dynamics of protein aggregation and oligomer formation governed by secondary nucleation. Journal of Chemical Physics. 143, (2015).
  12. Šarić, A., Michaels, T. C. T., Zaccone, A., Knowles, T. P. J., Frenkel, D. Kinetics of spontaneous filament nucleation via oligomers: Insights from theory and simulation. The Journal of Chemical Physics. 145, 211926(2016).
  13. Ruggeri, F. S., Habchi, J., Cerreta, A., Dietler, G. AFM-based single molecule techniques: Unraveling the amyloid pathogenic species. Current Pharmaceutical Design. 22, 3950-3970 (2016).
  14. Ruggeri, F. S., Šneideris, T., Vendruscolo, M., Knowles, T. P. J. Atomic force microscopy for single molecule characterisation of protein aggregation. Archives of Biochemistry and Biophysics. 664, 134-138 (2019).
  15. Iljina, M., et al. Nanobodies raised against monomeric α-synuclein inhibit fibril formation and destabilize toxic oligomeric species. BMC Biology. 15, 1-14 (2017).
  16. Schilling, C., et al. Sequence-Optimized Peptide Nanofibers as Growth Stimulators for Regeneration of Peripheral Neurons. Advanced Functional Materials. 1809112, 1-15 (2019).
  17. Chiki, A., et al. Mutant exon1 huntingtin aggregation is regulated by T3 phosphorylation-induced structural changes and crosstalk between T3 phosphorylation and acetylation at K6. Angewandte Chemie - International Edition. 56, 5202-5207 (2017).
  18. Sieste, S., et al. Water-dispersible polydopamine-coated nanofibers for stimulation of neuronal growth and adhesion. Advanced Healthcare Materials. 7, 1-11 (2018).
  19. De, S., et al. Different soluble aggregates of Aβ42 can give rise to cellular toxicity through different mechanisms. Nature Communications. 10, 1541(2019).
  20. Chang, K. C., Chiang, Y. W., Yang, C. H., Liou, J. W. Atomic force microscopy in biology and biomedicine. Tzu Chi Medical Journal. 24, 162-169 (2012).
  21. Variola, F. Atomic force microscopy in biomaterials surface science. Physical Chemistry Chemical Physics. 17, 2950-2959 (2015).
  22. Drolle, E., Hane, F., Lee, B., Leonenko, Z. Atomic force microscopy to study molecular mechanisms of amyloid fibril formation and toxicity in Alzheimer’s disease. Drug Metabolism Reviews. 46, 207-223 (2014).
  23. Ruggeri, F. S., et al. Identification and nanomechanical characterization of the fundamental single-strand protofilaments of amyloid α-synuclein fibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (28), 7230-7235 (2018).
  24. Ruggeri, F. S., et al. Infrared nanospectroscopy characterization of oligomeric and fibrillar aggregates during amyloid formation. Nature Communications. 6, 1-9 (2015).
  25. Ruggeri, F. S., et al. Microfluidic deposition for resolving single-molecule protein architecture and heterogeneity. Nature Communications. 9, (2018).
  26. Qamar, S., et al. FUS phase peparation is modulated by a molecular chaperone and methylation of arginine cation-π interactions. Cell. 173, 720-734 (2018).
  27. Habchi, J., et al. Cholesterol catalyses Aβ42 aggregation through a heterogeneous nucleation pathway in the presence of lipid membranes. Nature Chemistry. 10, 673-683 (2018).
  28. Sweers, K. K. M., Stöckl, M., Bennink, M. L., Subramaniam, V. Characterizing nanoscale morphologic and mechanical properties of α-Synuclein amyloid fibrils with atomic force microscopy. Bio-nanoimaging: Protein Misfolding & Aggregation. Uversky, V. N., Lyubchenko, Y. L. , London, UK. 309-322 (2014).
  29. Goldsbury, C., et al. Amyloid structure and assembly Insights from scanning transmission electron microscopy. Journal of Structural Biology. 173, 1-13 (2011).
  30. Knowles, T. P. J., Smith, J. F., Devlin, G. L., Dobson, C. M., Welland, M. E. Analysis of structural order in amyloid fibrils. Nanotechnology. 18, (2007).
  31. Knowles, T. P. J., Mezzenga, R. Amyloid fibrils as building blocks for natural and artificial functional materials. Advanced Materials. , 6546-6561 (2016).
  32. Knowles, T. P. J., Oppenheim, T. W., Buell, A. K., Chirgadze, D. Y., Welland, M. E. Nanostructured films from hierarchical self-assembly of amyloidogenic proteins. Nature Nanotechnology. 5, 204-207 (2010).
  33. Knowles, T. P. J., Smith, J. F., Craig, A., Dobson, C. M., Welland, M. E. Spatial persistence of angular correlations in amyloid fibrils. Physical Review Letters. 96, 1-4 (2006).
  34. Knowles, T. P. J., et al. Twisting transition between crystalline and fibrillar phases of aggregated peptides. Physical Review Letters. 109, 158101(2012).
  35. Knowles, T. P., et al. Role of intermolecular forces in defining material properties of protein nanofibrils. Science. 318, 1900-1903 (2007).
  36. Smith, J. F., Knowles, T. P. J., Dobson, C. M., MacPhee, C. E., Welland, M. E. Characterization of the nanoscale properties of individual amyloid fibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 15806-15811 (2006).
  37. Sokolov, D. V. Atomic force microscopy for protein nanotechnology. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 300, 323-367 (2013).
  38. Ruggeri, F. S., et al. Influence of the β-sheet content on the mechanical properties of aggregates during amyloid fibrillization. Angewandte Chemie - International Edition. 54, 2462-2466 (2015).
  39. Jeong, J. S., Ansaloni, A., Mezzenga, R., Lashuel, H. A., Dietler, G. Novel mechanistic insight into the molecular basis of amyloid polymorphism and secondary nucleation during amyloid formation. Journal of Molecular Biology. 425, 1765-1781 (2013).
  40. Adamcik, J., Mezzenga, R. Study of amyloid fibrils via atomic force microscopy. Current Opinion in Colloid and Interface Science. 17, 369-376 (2012).
  41. Deguire, S. M., et al. N-terminal huntingtin (Htt) phosphorylation is a molecular switch regulating Htt aggregation, helical conformation, internalization, and nuclear targeting. Journal of Biological Chemistry. , (2018).
  42. Ruggeri, F. S., et al. Nanoscale studies link amyloid maturity with polyglutamine diseases onset. Scientific Reports. 6, 1-11 (2016).
  43. Adamcik, J., et al. Understanding amyloid aggregation by statistical analysis of atomic force microscopy images. Nature Nanotechnology. 5, 423-428 (2010).
  44. Lin, Y. C., Komatsu, H., Ma, J., Axelsen, P. H., Fakhraai, Z. Quantitative analysis of amyloid polymorphism using height histograms to correct for tip convolution effects in atomic force microscopy imaging. RSC Advances. 6, 114286-114295 (2016).
  45. Mannini, B., et al. Stabilization and characterization of cytotoxic Aβ40 oligomers isolated from an aggregation reaction in the presence of zinc ions. ACS Chemical Neuroscience. , (2018).
  46. Medalsy, I., Hensen, U., Muller, D. J. Imaging and quantifying chemical and physical properties of native proteins at molecular resolution by force-volume AFM. Angewandte Chemie - International Edition. 50, 12103-12108 (2011).
  47. Dufrêne, Y. F., Martínez-Martín, D., Medalsy, I., Alsteens, D., Müller, D. J. Multiparametric imaging of biological systems by force-distance curve–based AFM. Nature Methods. 10, 847-854 (2013).
  48. Takai, E., et al. Scanning electron microscope imaging of amyloid fibrils. American Journal of Biochemistry and Biotechnology. 10, 31-39 (2014).
  49. Dazzi, A., et al. AFM-IR: Combining atomic force microscopy and infrared spectroscopy for nanoscale chemical characterization. Applied Spectroscopy. 66, 1365-1384 (2012).
  50. Volpatti, L. R., et al. Micro- and nanoscale hierarchical structure of core-shell protein microgels. Journal of Materials Chemistry B. 4, 7989-7999 (2016).
  51. Galante, D., et al. A critical concentration of N-terminal pyroglutamylated amyloid beta drives the misfolding of Ab1-42 into more toxic aggregates. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 79, 261-270 (2016).
  52. Ruggeri, F. S., et al. Identification of oxidative stress in red blood cells with nanoscale chemical resolution by infrared nanospectroscopy. International Journal of Molecular Sciences. 19, 1-14 (2018).
  53. Ramer, G., Ruggeri, F. S., Levin, A., Knowles, T. P. J., Centrone, A. Determination of polypeptide conformation with nanoscale resolution in water. ACS Nano. 12 (7), 6612-6619 (2018).
  54. Dazzi, A., Prater, C. B. AFM-IR: Technology and applications in nanoscale infrared spectroscopy and chemical imaging. Chemical Reviews. 117, 5146-5173 (2017).
  55. Lahiri, B., Holland, G., Centrone, A. Chemical imaging beyond the diffraction limit: experimental validation of the PTIR technique. Small. 9 (3), 439-445 (2013).
  56. Ansaloni, A., et al. One-pot semisynthesis of exon 1 of the huntingtin protein: New tools for elucidating the role of posttranslational modifications in the pathogenesis of Huntington’s disease. Angewandte Chemie - International Edition. 53 (7), 1928-1933 (2014).
  57. Khalaf, O., et al. The H50Q mutation enhances α-synuclein aggregation, secretion, and toxicity. Journal of Biological Chemistry. 289, 21856-21876 (2014).
  58. Hellstrand, E., Boland, B., Walsh, D. M., Linse, S. Amyloid β-protein aggregation produces highly reproducible kinetic data and occurs by a two-phase process. ACS Chemical Neuroscience. 1, 13-18 (2010).
  59. Limbocker, R., et al. Trodusquemine enhances Aβ42 aggregation but suppresses its toxicity by displacing oligomers from cell membranes. Nature Communications. 10 (1), 225(2019).
  60. Lu, F., Belkin, M. A. Infrared absorption nano-spectroscopy using sample photoexpansion induced by tunable quantum cascade lasers. Optics Express. 19, 1902-1904 (2011).
  61. Jiao, Y., Schäffer, T. E. Accurate height and volume measurements on soft samples with the atomic force microscope. Langmuir. 20, 10038-10045 (2004).
  62. Müller, D. J., Engel, A. The height of biomolecules measured with the atomic force microscope depends on electrostatic interactions. Biophysical Journal. 73, 1633-1644 (1997).
  63. Heymann, J. B., Moller, C., Muller, D. J. Sampling effects influence heights measured with atomic force microscopy. Journal Of Microscopy-Oxford. 207, 43-51 (2002).
  64. Marinello, F., Balcon, M., Schiavuta, P., Carmignato, S., Savio, E. Thermal drift study on different commercial scanning probe microscopes during the initial warming-up phase. Measurement Science and Technology. 22, 9(2011).
  65. Marinello, F., Bariani, P., De Chiffre, L., Savio, E. Fast technique for AFM vertical drift compensation. Measurement Science and Technology. 18, 689-696 (2007).
  66. Ricci, D., Braga, P. C. Recognizing and avoiding artifacts in AFM imaging (Clifton, N.J.). Methods in Molecular Biology. 242, 25-27 (2004).
  67. Canale, C., Torre, B., Ricci, D., Braga, P. C. Recognizing and avoiding artifacts in atomic force microscopy imaging. Atomic Force Microscopy in Biomedical Research. Braga, P. C., Ricci, D. 736, Humana Press. New York, NY. 31-43 (2011).
  68. Marinello, F., Carmignato, S., Voltan, A., Savio, E., De Chiffre, L. Error Sources in Atomic Force Microscopy for Dimensional Measurements: Taxonomy and Modeling. Journal of Manufacturing Science and Engineering. 132, 030903(2010).
  69. Ukraintsev, E., Kromka, A., Kozak, H., Reme, Z., Rezek, B. Artifacts in Atomic Force Microscopy of Biological Samples. Atomic Force Microscopy Investigations into Biology - From Cell to Protein. Frewin, C. L. , (2012).
  70. Tsukruk, V. V., Singamaneni, S. Scanning Probe Microscopy of Soft Matter: Fundamentals and Practices. , Wiley-VCH Verlag GmbH. Weinheim, Germany. (2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

AFM IRMorfolojik AnalizYap sal zelliklerKimyasal zelliklerN rodejeneratif Hastal klarAmiloid OligomerleriTek Molek l Y ntemleri

İlgili makaleler