Protein katabolizmindeki biyolojik ritimleri otofaji ve fare karaciğerinde proteozom yoluyla ölçme protokolümüzü tanımlıyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Otophagic ve Proteasomal Akı'da Diurnal Ritimlerin Ölçülmesi
Bu makalede
Özet
Özet
Hücreler istenmeyen proteinlerve diğer malzeme geri dönüşüm için çeşitli yöntemler kullanır, lysosomal ve non-lysosomal yollar da dahil olmak üzere. Protein katabolizmasının birincil lizozomal olmayan yöntemi ubikitin-proteozom sistemi iken, başlıca lizozom-bağımlı yol otofaji olarak adlandırılır. Model organizmalar üzerinde yapılan son çalışmalar, hem otofaji hem de ubikitin-proteozom sisteminin aktivitesinin gün boyunca sabit olmadığını, bunun yerine günlük (sirkadiyen) ritme göre değiştiğini göstermektedir. Protein cirosu biyolojik ritimleri ölçmek için yeteneği hücresel kalite kontrolü nasıl elde edilir anlamak ve ilgi belirli proteinlerin dinamiklerini anlamak için önemlidir. Burada protein cirosunun sirkadiyen bileşenini yakalayan otophagic ve proteasomal akı in vivo'nun ölçülmesi için standart laştırılmış bir protokol salıyoruz. Protokolümüz, fare işleme, doku işleme, fraksiyonve başlangıç malzemesi olarak fare karaciğeri kullanarak otofatik akı nicelliği için ayrıntıları içerir.
Giriş
Sirkadiyen ritimler, biyolojik fonksiyonda doğa boyunca belirgin olan günlük, öngörülebilir varyasyonları ifade eder. Her biyolojik ölçekte varolurlar, uyku-uyanıklık döngüleri gibi makroskopik davranışlardan biyomoleküllerin ritmik bolluğu gibi moleküler fenomenlere kadar. Son yıllarda sirkadiyen ritim ler üzerine yapılan araştırmalar, sirkadiyen ritim üretimi için kritik öneme sahip "saat genlerinin" keşfi ile dönüştürülmüştür. Saat gen nakavt farelerde çalışmalar metabolizma1gibi zamansal olarak organize çekirdek hücresel süreçler sirkadiyen ritimleri için merkezi bir rol ortaya koymuştur. Sirkadiyen ritimlerin bunu gerçekleştirme yolları ar....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Burada açıklanan protokol Washington Üniversitesi tarafından St. Louis Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. Fare Muhafazası ve Deneysel Tasarımı
- Protein cirogünlük ritimleri tespit etmek için, ev fareleri (erkek veya kadın C57BL/6J, 4−8 haftalık, 20−25 g) standart 12 saat ışık / karanlık döngüleri altında gıda reklam libitumsağlanan . Hayvanları strese girmemek için, fareleri kullanmadan önce tesiste en az bir hafta boyunca alıştırın ve tek bir muhafazadan kaçının. Protein katabolizma ritimleri gerçekten sirkadiyen olduğunu kanıtlamak için (yani, hayvanın iç biyolojik saat tarafından tahr....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Temsili veriler Şekil 2A,B'desunulur ve bu verilerin niceliği Şekil 2C,D'de verilmiştir (ayrıca bkz. Ek Dosya "Örnek Veriler"). Basitlik için, Şekil 2'de yükleme kontrollerini göstermedik, ancak bunlar paralel olarak alınmalıdır. Tipik olarak, β-aktin karşı batı lekeleri bu amaçla kullanılır, ancak toplam protein lekesi (Ponceau S gibi) yeterli olacaktır. Herhangi bir zaman noktasın.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Protokolümüz, farelerde yaygın olarak kullanılan moleküler biyoloji ekipmanlarını kullanarak protein cirosundaki biyolojik ritimleri ölçmenin teknik olarak basit bir aracını tanımlar. Zaman serisi deneylerin uzunluğu ve ilgili biyolojik numunelerin sayısı nedeniyle, farelerin nasıl enjekte edildiği, doku ediniminin zamanlaması ve biyokimyasal işleme ile ilgili tüm deneyboyunca tutarlı olmak önemlidir. Örnekleri. Enjeksiyon, ötenazi ve servikal çıkık adımları, tam ölçekli bir deney başlatmadan önce operatör uygulaması ger.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
Bu çalışma RO1HL135846 ve Çocuk Geliştirme Enstitüsü hibe (PD-II-2016-529) tarafından finanse edilmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 4x SDS SAYFASI: Örnek Tamponu | Invitrogen | , Cat#, NP0008 | |
| Bortezomib | EMD, Millipore | Cat# 5.04314.0001; CAS: 179324-69-7 | |
| Image Studio | LICOR | N/A | |
| Immobilon-FL PVDF membran 0.45 mikron | Merck Millipore Ltd | Cat# IPFL00010 | |
| K48 bağlantılı Spesifik Poliubikitin (D9D5) Tavşan mAb | Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi | Cat#8081S; RRID: AB_10859893 | |
| LC3a | Boston Biochem | Cat # UL-430 | |
| LC3b antikoru | Novus | Cat # NB100-2220; RRID: AB_10003146 | |
| LC3b antikoru | Hücre Sinyal Teknolojisi Kedi | # 2775; RRID: AB_915950 | |
| Leupeptin | Sigma Kedi | # L2884; CAS: 103476-89-7 | |
| NuPAGE %4-12 Bis-Tris Midi Protein Jelleri | Thermo Fisher Scientific | Cat# WG1403BOX | |
| NuPAGE LDS Örnek Tamponu (4x) | Thermo Fisher Scientific | Cat# NP0007 | |
| P62-his | Novus | Cat# NBP1-44490 | |
| Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standartları | Bio-Rad | Cat# 1610373 | |
| Tavşan Anti-p62/SQSTM1 | Millipore-Sigma Kedisi | #P0067; RRID:AB_1841064 | |
| rhPoly-Ub WT (2-7) (K48) | Boston Biochem | Cat# UC-230 | |
| SDS-PAGE Midi-Size Jeller | Invitrogen | Cat# WG1403 | |
| SIGMAFAST Proteaz İnhibitör Tabletleri | Millipore-Sigma | Kedi # S8830 |
Kaynaklar
- Green, C. B., Takahashi, J. S., Bass, J. The meter of metabolism. Cell. 134 (5), 728-742 (2008).
- Ma, B. Y., et al. LPS suppresses expression of asialoglycoprotein-binding protein through TLR4 in thioglycolate-elicited peritoneal macrophages. Glycocon....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
