Hiv Hedeflerinin Antikorbağımlı Hücresel Fagositoz Sataşanında Kullanılmak Üzere İnsan Anne Sütünden Lökositlerin İzolasyon

İnsan anne sütü (BM) anne hücrelerinden oluşur >90% canlı^1. Hücre bileşimi güçlü emzirme aşamasında etkilenir, anne ve bebeğin sağlık durumu, ve bireysel varyasyon, hangi kötü anlaşılmış kalır^1,2,3,4. BM~10³−10⁵ lökosit/mL içerdiği göz önüne alındığında, anne sütüyle beslenen bebeklerin günlük⁵~10⁵−10⁸ maternal lökosit yuttukları tahmin edilebilir. Çeşitli in vivo çalışmalar, maternal lökositlerin bebeğe kritik bağışıklık sağladığını ve bu ilk yutma alanlarının çok ötesinde fonksiyonel olduğunu göstermiştir^{5,6,7,8 ,9,10,11}. Bebek tarafından yutulan tüm anne kaynaklı hücreler yanında bağışıklık fonksiyonları gerçekleştirmek veya bebeğin kendi lökositler telafi etmek için potansiyele sahip¹².

İnsan immün yetmezlik virüsünün (HIV) anne-çocuk iletimi (MTCT) kaynak sınırlı ülkelerde bir kriz olmaya devam etmektedir. İshal ve solunum yolu hastalıkları kaynak sınırlı ülkelerde bebekler arasında mortalite önemli oranlarda sorumlu olduğundan ve bu hastalıklar önemli ölçüde özel emzirme ile azalır, HIV enfekte anneler için faydaları emzirme çok riskleri ağır basar^13,14,15. Temiz su ve uygun bebek formülü erişim güvenilir olmadığı sürece, WHO HIV enfekte anneler için emzirme kesilmesini önermez¹⁶. BM üzerinden yılda yaklaşık 100.000 MTCT meydana gelir; henüz, hiv-enfekte anneler tarafından emzirilen bebeklerin sadece ~ 15% enfekte olur, BM güçlü bir koruyucu etkisi düşündüren^{17,18,19,20,21}. Çok sayıda faktör büyük olasılıkla iletimi önlemek için birlikte çalışır. Daha da önemlisi, BM'de HIV spesifik antikorlar (Abs) azaltılmış MTCT ve / veya HIV enfeksiyonu^22,23azaltılmış bebek ölümü ile ilişkili olmuştur. Bm'nin hücresel fraksiyonunun antiviral niteliklerine katkısı büyük ölçüde belirsizdir.

Birçok Abs immünglobulin molekülünün 'sabit' bölgesi tarafından aracılık anti-viral faaliyetleri çeşitli kolaylaştırmak, kristalize parça (Fc), Fc reseptörleri ile etkileşim yoluyla (FcR) hemen hemen tüm doğuştan gelen bağışıklık hücreleri üzerinde bulunan, hemen hemen hepsi insan BM²⁴bulunur. Antikorbağımlı hücresel fagositoz (ADCP) viral enfeksiyonların temizlenmesi için gerekli olarak gösterilmiştir ve HIV MTCT önlenmesi durumunda understudied olmuştur^{25,26,27, 28.000 , 29}. BM fagositleri tarafından ADCP aktivitesinin HIV MTCT'sinin önlenmesine olası katkısı hakkında bilginin azlığı göz önüne alındığında, hücreleri insan BM'den izole etmek için sıkı bir yöntem geliştirmeyi amaçladık. BM emzirmenin çeşitli aşamalarında elde edilir.

Bu çalışmadaki her katılımcı, IRB onaylı bir IRB onaylı kullanılarak Mount Sinai'nin İnsan Deneklerini Koruma Programı'nın (PPHS) rehberliği ve onayı ile etik ve kurumsal inceleme kurulu (IRB) onayı ile işe alındı ve mülakata alındı. anne sütü örnekleri almak için protokol.

1. Hedef Mikrosfer hazırlığı

1. İlgili bir hedef antijeni seçin.
   NOT: Bu örnekte, rekombinant protein V1V2-2F5K kullanılmıştır, hangi yerli HIV zarf trimerik apeks taklit etmek için tasarlanmıştır³⁰.
2. Üreticinin protokolüne göre ticari bir kit(Malzeme Tablosu)kullanarak biyotinylation gerçekleştirin.
   1. Formülü kullanarak 5 kat molar fazlalık için reaksiyoneklemek için biotin reaktifmin mmol hesaplayın: mmol biotin = mL protein x (mg protein / mL protein) x (mmol biotin / mg protein) x (5 mmol biotin / mmol protein)^30,31. Daha sonra formülü kullanarak eklemek için biotin reaktifinin μL'sini hesaplayın: μL biotin = mmol biotin x (1.000.000 μL/L) x (L/10 mmol).
   2. Açmadan önce biotin'i oda sıcaklığına dengeleyin. Yukarıda yapılan hesaplamaya göre proteini 0.5−2.0 mL fosfat tamponlu salin (PBS) içinde çözün.
   3. Dimetilsülfoksit (DMSO) biotin reaktif10 mM çözeltisi hazırlamak ve protein çözeltisi için 10 mM biotin reaktif uygun hacmi ekleyin ve 2 saat veya 30 dakika oda sıcaklığında buz üzerinde inkübat reaksiyonu.
3. Protein konsantruzları (polyethersulfone [PES] membranları, 3 kDa moleküler ağırlık kesme [MWCO], 0.5 mL; Malzeme Tablosu) üreticinin talimatlarına göre.
   1. Örnek örneği spin sütununun üst haznesine yatırın ve PBS'yi 400 μL. Cap'e kadar ekleyin ve bu numune haznesini bir toplama tüpüne takın. 30 dk oda sıcaklığında 12.000 x g santrifüj.
   2. Akış tan atın ve PBS'yi 400 μL'ye ekleyin. Akış tan atın ve PBS'yi 100 μL'ye ekleyin. Protein konsantrasyonu spektrofotometre ile ölçün.
      NOT: Protein kullanılana kadar -80 °C'de dondurulabilir.

2. Antikorbağımlı Hücresel Fagositosit (ADCP) Teşrin PlakaSı Hazırlama

1. Biyotinylated proteini 1 μm mikrokürelere ('boncuklar'; Malzeme Tablosu) üreticinin talimatlarına göre.
   1. Konjuge boncuk tabağı başına, 200 μL stok boncuk 12 μL stok boncuk ile 6 μg protein kuluçka 0.1% sığır serum albumin (BSA)-PBS oda sıcaklığında 1 saat, hafifçe her 20 dakikada girdap.
   2. 5 dk. 13.000 x g.'de santrifüj, süpernatant, girdap yavaşça atın ve %0,1 BSA-PBS 1200 μL'de yeniden askıya alın. Tekrar spin ve yıkama adım 2x. 1200 μL'de %0.1 BSA-PBS'de yeniden askıya alın.
2. Aliquot 10 μL boncuk çözeltisi iyi bir yuvarlak alt 96-iyi plaka. Genellikle 50 μg/mL antikor veya 1/100 serum seyreltme ile başlayan 12 μL hsa HBSS'de antikor veya immün sera seyreltmeler hazırlayın.
   NOT: Örnek lemlerde monoklonal antikor (mAb) 830A kullanılmıştır.
3. Boncuk plakasına 10 μL titre antikor/sera ekleyin ve 37 °C'de 2 saat kuluçkaya yatırın. Her kuyuya 200 μL HSA HBSS ve 10 dk için 2.000 x g'lık santrifüj plaka ekleyin.
4. Görünmez boncuk peletini rahatsız etmemek için plaka kuyularından sıvının bir lavaboya doğru hızlı bir şekilde devrilmesi ve decanting ilerlemesi ile supernatant'ı dikkatlice çıkarın.

3. Anne sütü hücre izolasyonu

1. Çift elektronik veya manuel pompalar kullanılarak ifade sağlıklı emziren kadınlardan insan anne sütü alın. Sütü oda sıcaklığında tutarak ~4 saat ifade içindeki hücreleri izole edin.
2. 50 mL tüpler kullanarak, santrifüj 50 mL süt 800 x g için 15 dk. Dikkatli bir şekilde yağsız süt ve yağ dökün hücre pelet rahatsız bırakılırken. Tüpün içini tiftiksiz bir mendille silin ve tüp duvarındaki tüm yağları çıkarın.
3. Hank'in dengeli tuz çözeltisine %2 insan serum albumeni 10 mL ekleyin (%2 HSA HBSS [Ca²⁺ veya Mg^{+ olmadan}]). Hücre aktivasyonu ve apoptoz önlemek için nazik pipetleme tarafından pelet resuspend. 10 dk için 450 x g'da 15 mL'lik bir tüp ve santrifüje aktarın.
4. Supernatant dökün ve adım 1.3 tekrarlayın. Daha sonra, beklenen hücre sayısına bağlı olarak %2 HSA HBSS'nin 1−2 mL'lik hücreleri yavaşça yeniden askıya alan ve hücreleri hemositometre veya otomatik hücre sayacı ile sayarak hücrecanlılığını da kaydettirin.

4. ADCP tsömonu

NOT: Burada açıklanan yöntemler Ackerman ve ark.^32'denuyarlanmıştır.

1. Her ADCP istreme plakasına %2 HSA-HBSS 200 μL'lik iyi bir şekilde 50.000 adet taze izole BM hücresi ekleyin. 37 °C'de 2 saat kuluçka.
   1. Kontrol deneyleri için, 37 °C'de 10 μg/mL aktin inhibitörü (sitokasin-D), 50 μg/mL FcR engelleme ajanı (FcBlock) veya plakalara ilave edilmeden önce her ikisinin kombinasyonu ile kuluçka öncesi hücreler.
2. 10 dk. 10 dk. 200 μL 200 μL HSA HBSS ve tekrar santrifüj için 930 x g santrifüj plaka. 2.7 adımdaki gibi supernatant'ı dikkatlice çıkarın ve tekrar yıkayın.
3. %2 HSA HBSS'nin 50 μL'sinde 0,5 μg/mL (son konsantrasyon) düzeltilebilir canlılık lekesi kullanılarak süpernatant ve leke hücrelerini dikkatlice çıkarın. Karanlıkta oda sıcaklığında 20 dk kuluçka. 10 dk için 930 x g santrifüj plaka ve adım 2.7 gibi supernatant kaldırın. 200 μL 2% HSA HBSS ve santrifüj plaka tekrar adım 2.7 gibi supernatant kaldırılması nı takip ekleyin.
4. Canlılık boyama sonra, ilgi lökosit belirteçleri için leke hücreleri, en az pe-fare anti-insan CD45 (klon HI30) gibi bir CD45 özgü leke dahil optimize edilmiş bir konsantrasyonda (1 μg/ μL 50 μL% 1 BSA HBSS örnek verilerde).
   NOT: Herhangi bir soya özgü ilgi belirteçleri dahil edilebilir.
5. Karanlıkta oda sıcaklığında 20 dk kuluçka. 10 dk için 930 x g santrifüj plaka ve adım 2.7 gibi supernatant kaldırın. %1 BSA HBSS 200 μL ekleyin ve tekrar santrifüj. Supernatant çıkarın. Hücreleri 200 μL ve karanlıkta %0,5 formaldehit halinde oda sıcaklığında 30 dakika veya gece boyunca 4 °C'de sabitler. Analiz ene kadar karanlıkta soğutun.

5. Akış sitometrisi ile analiz

1. İleri dağılım (FSC) ve yan dağılım (SSC) çizimi ve enkaz (FSC = 5000'den küçük malzeme) üzerindeki doublet'leri ortadan kaldırmak için ilk gating'i gerçekleştirin (Bkz. Şekil 1). Ölü hücreleri (canlılık lekesi için pozitif olanlar) ortadan kaldırmak için bir SSC vs canlılık lekesi (Bu durumda V450) planı kullanın.
2. Büyük lökosit sınıfları (granülositler, monositler, lenfositler) ayırt etmek için bir SSC vs CD45 arsa kullanın yaygın olarak açıklanan^33,34.
   NOT: Bu sınıflandırma sadece müstehcendir ve hücre tipini doğrulamak için soya özgü belirteçlere ihtiyaç vardır.
3. Tüm CD45+ hücreleri veya ilgi her lökosit alt kümesi için, floresan boncuk tespit edilir floresan izotiyoloit (FITC) kanalının bir histogramboncuk pozitif hücreler üzerinde bir belirteç ile gating tarafından ADCP aktivitesini ölçmek.
   NOT: Boncuk eklenmediği negatif kontrol kuyuları, boncuk pozitif hücrelerin histogramda nerede belirgin olduğunu ve bu nedenle gating markerin nereye yerleştirileceğini gösterir.
4. ADCP skorlarını (boncuk pozitif hücrelerin ortanca floresan yoğunluğu [MFI] olarak) x (%pozitif popülasyondaki toplam CD45 + hücrelerin toplamı) olarak hesaplayın. Her Ab/serum konsantrasyonundaki puanları çizmek ve eğrinin altında bir alan (AUC) analizi yapmak için grafik yazılımını kullanın.
   NOT: AdCP, ADCP skoru AUC'nin spesifik olmayan negatif kontrol mAb'sinin 3x standart sapmasından büyükse pozitif kabul edilir (bu durumda, 3865).

Süt oda sıcaklığında veya soğutucuda saklanabilir (dondurulmuş olmasa da); ancak, sütün çok soğuk tutulduğunda (veriler gösterilmediğinde) daha az canlılık gözlemlediğimiz ve ortam sıcaklıklarında toplanması, depolanmasını ve taşınmasının daha kolay olduğu göz önüne alındığında, numunelerin soğutulmaması tavsiye edilir. örnek-numune değişkenliği. 7−183 gün sonra elde edilen sütte, otomatik hücre sayacı tarafından belirlenen hücre konsantrasyonu 16.083−222.857 hücre/mL arasında değişmektedir. Şekil 1, çift, enkaz ve ölü hücreleri ortadan kaldıran gating stratejisini göstermektedir. Canlılık ~90−99%' idi. Toplam canlı hücrelerin yaklaşık %1.6−12.3'ü CD45+ lökosittir (Tablo 1). En sözde monositler öncüleri / olgunlaşmamış hücreler daha önce açıklandığı gibi, müstehcen SSC vs CD45 gating34dayalı olduğu ortaya çıktı. Sözde monositler SSCdüşük-orta/CD45düşükolarak tanımlanmıştır, ancak birkaç iddia edilen lenfosit popülasyonundan farklı yüksek CD45 boyama düzeyleri sergilenmiştir (SSCdüşük/ CD45düşük) daha tipik kan monositleri ile ilişkili (Şekil 1), önceki çalışmalara benzer33,34. Sözde granülositler SSCyüksek/CD45 ara33,34 (Tablo 1) olarak tanımlanmıştır. Bu sınıflandırmanın yalnızca müstehcen olduğunu ve hücre türünü doğrulamak için soya özgü belirteçler gerekeceğini unutmayın.

Yeni izole BM hücrelerinin ADCP aktivitesi HIV'e özgü insan mAb 830A kullanılarak ölçüldü, bu hiv zarfının V2 bölgesine özgüdür ve burada test edilen V1V2-2F5K antijenine bağlanır. AdCP aktivitesi burada 1 ay sonrası elde edilen süt kullanılarak ölçüldü (Şekil 2A). Örnek veriler, CD45+ hücrelerde gating yaparken görülen beklenen FITC (boncuk+) histogramlarını gösterir (1 μg/mL mAb kullanılarak oluşturulan veriler gösterilir). Siyah işaretçiler, ADCP puanlarını hesaplamak için kullanılan popülasyonları gösterir. Örnek830A verilerinde (Şekil 2A'nınilk paneli), CD45+ hücrelerin yüzdesi ve bu popülasyonun ortalama floresansı gösterilir ve bu veriler 3.4'teki denklemi kullanarak ADCP puanını hesaplamak için kullanılır. Ab-bound/antijen-çiftleşmiş boncuklarla kuluçkadan önce aktin inhibitörü sitokasin-D (sitod) ve/veya FcR-bloke edici Abs (FcBlock) ile önceden kuluçkaya yatan hücreler, KONTROL mAb 3865 veya altında ADCP aktivitesi sergileyerek ADCP FcR olduğunu gösterir ve aktine bağımlı (Şekil 2). Toplam CD45+ hücreler için belirlenen ADCP skoru negatif kontrol anti-şarbon mAb 3865 kullanılarak tanımlanan arka plan seviyelerinin ~25−35 kat üzerindeydi. Her büyük alt küme ayrı ayrı da analiz edildi. Sözde granülositler ADCP aktivitesi ~ 12−29 kat arka plan daha yüksek sergiledi. Sözde monosit ADCP ~ 2−3 kat arka plan üzerinde(Şekil 2)idi. Beklendiği gibi sözde lenfositler herhangi bir ölçülebilir ADCP aktivitesi göstermedi (non-spesifik negatif kontrol mAb 3865 ADCP skoru AUC az 3x standart sapma; veriler gösterilmedi).

Şekil 1: Anne sütünden izole edilen hücrelerin örnek akış sitometri verileri. Hücreler protokolde açıklandığı gibi işlendi ve lekelendi. (A) Tek hücreler, fsc-h vs FSC-A arsada doublet'leri ortadan kaldırmak için geçitli ydi, ayrıca FSC-A'daki küçük enkaz <5,000'i de dışarı çıkardı. (B) Bu popülasyon, Bir SSC vs. V450 (canlılık lekesi) çiziminde canlı hücrelere (canlılık boyasıyla leke olmayan) geçit yapmak için kullanılmıştır. (C) Bu canlı hücreler Bir FSC vs SSC arsa kullanılmıştır. Ağırlıklı olarak meme epitel hücreleri olması muhtemel olan lökosit olmayanların beklenen konumu vurgulanır ("E"). (D) Aynı FSC vs SSC çizimi yalnızca CD45+ hücreleri ile gösterilir. Belirtilen başlıca lökosit alt kümeleri sadece köklü ve beklenen SSC parametrelerine (G = granülositler; M = monositler; L = lenfositler). (E) Canlı hücreler büyük lökosit alt kümeleri belirtilen bir SSC vs CD45 arsa için kullanılmıştır. Bu çizimden geriye doğru, D panelinde gösterilen verileri ortaya çıkar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Anne sütünden izole edilmiş hücreleri kullanarak ADCP verilerini örneklendirin. Yapılan ADCP tsalimi, Ackerman ve ark.30'danuyarlanan teste dayanmaktadır. Tsurus, yukarıdaki protokolde belirtildiği gibi gerçekleştirilmiştir. (A) ÖRNEK FITC histogramları 1 μg/mL mAb'de, ADCP skorunu belirlemek için kullanılan boncuk/FITC+ popülasyonlarını gösteren belirteçlerle birlikte. Skorlar (boncuk pozitif hücrelerin MFI'si) x (% boncuk/FITC+ pozitif popülasyondaki toplam CD45+ hücrelerin ini) olarak hesaplandı. Sadece mAb 830A kullanan ilk panel, toplam CD45+ hücrelerin yüzdesini ve bu örnekteki ADCP puanını hesaplamak için kullanılan ortalama floresan yoğunluk değerini de gösterir. (B) Grafik yazılımındaki her mAb seyreltme testindeki ADCP puanları, grafik yazılımındaki eğri altı (AUC) değerlerini hesaplamak için kullanılmıştır. Kontrol deneyleri için, aktin inhibitörü sitokasin-D (sitoD), FcR blokaj ajanı (FcBlock), ya da her ikisinin bir kombinasyonu bağışıklık komplekslerine katılmadan önce hücrelerle önceden kuluçkaya yatırılmıştır (bkz. Bu hücre sınıflandırması sadece müstehcen olduğunu ve hücre türünü onaylamak için soya özgü belirteçler gerekli olduğunu unutmayın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Tipik anne sütü hücre sayıları ve özelliklerine örnekler.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.