Bu protokol yağ asitleri ile stimülasyon üzerine insan bağırsak organoidlerinde lipid damlacık (LD) oluşumunun karakterizasyonu için bir test açıklar. Bu denemenin LD oluşumunun nicelleştirilmesi için nasıl kullanıldığını ve LD oluşumunu etkileyen ilaçlar için yüksek iş elde taramalarda nasıl kullanılabileceğini tartışıyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
İnsan Bağırsak Organoidlerinde Lipid Damlacık Oluşumunun Karakterizasyonu ve Niceliği için Floresan Esaslı Bir Test
Bu makalede
Özet
Özet
Diyet lipidler bağırsak epitel tarafından serbest yağ asitleri (FAs) olarak alınır. Bu FA'lar hücre içi trigliserid (TG) moleküllerine dönüştürülür, lenfe veya hücre içi depolama için sitozolik lipid damlacıklarına (LD) götürülmek üzere şilomikronlara paketlenmeden önce. LDs oluşumu için önemli bir adım Diacylglycerol ayltransferazların katalitik aktivitesidir (DGAT) TG sentezinin son adımında. LDs toksik lipid türleri tampon ve farklı hücre tiplerinde hücresel metabolizmayı düzenleyen önemlidir. İnsan bağırsak epiteli düzenli lipidlerin yüksek konsantrasyonlarda ile karşı karşıya olduğundan, LD oluşumu homeostaz düzenlemek için büyük önem taşımaktadır. Burada insan bağırsak organoidlerinde en sık görülen doymamış yağ asidi, oleik asit ile uyarılması üzerine LD oluşumunun (LDF) karakterizasyonu ve nicelemesi için basit bir analiz açıklıyoruz. LDF testi, ld'lerin konfokal mikroskopi, floresan plaka okuyucu veya akış sitometrisi ile ölçülmesine olanak tanıyan LD'ye özgü floresan boya LD540'ya dayanmaktadır. LDF analizi insan bağırsak epitel hücrelerinde LD oluşumunu karakterize etmek için kullanılabilir, veya LD metabolizmasını etkileyen insan (genetik) bozuklukları incelemek için, DGAT1 eksikliği gibi. Ayrıca, bu test aynı zamanda yeni terapötik bileşikleri test etmek için yüksek iş lenme boru hattı kullanılabilir, hangi bağırsak veya organoidlerin diğer türleri LD oluşumunda kusurları geri.
Giriş
Lipidler insan diyetinin önemli bir bileşenidir ve sistemik enerji depolama ve metabolizmaönemli bir rol oynamaktadır. Sindirildiğinde, diyet lipidleri pankreas lipazları tarafından serbest yağ asitleri (FFA) ve monogliseritler (MGs) içine bozulur. Bu substratlar daha sonra bağırsak epitelinin enterositleri tarafından alınır, burada ilk olarak monogliserit ayltransferazlar (MGAT) enzimleri tarafından digliseritlere (DG) ve daha sonra diacylrigerolerol tarafından trigliserid (TG) tarafından yeniden esterlenirler. acyltransferaz 1 (DGAT1)1. Son olarak, bu TGs ya lenf sistemine veya sitosolik lipid damlacıkları (LDs) hücre içi depolama için ihraca....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Burada tanımlanan insan dokuları kullanılarak yapılan tüm deneyler Utrecht Üniversitesi Tıp Merkezi (UMCU) etik komitesi tarafından onaylanmıştır. Wilhelmina Çocuk Hastanesi (WKZ)-UMCU'daki hastalardan organoidlerin toplanması, üretimi, depolanması ve kullanımı için bilgilendirilmiş onam alındı.
1. Kültür Medyasının Hazırlanması
NOT: Bu protokol bir biyogüvenlik kabini içinde yapılmalıdır. Organoidler standart hücre kültürü kurallarına göre ele alınmalıdır.
- Bazal kültür ortamı nı hazırlayın.
NOT: Büyüme faktörü olmayan kültür ortamına bazal orta (BM) denir.- 5....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
LD oluşumunun doğru analizi için, organoidler OA ve sonraki boyama ile stimülasyon öncesinde çok yoğun tohumlu olmamalıdır. Örtüşen organoidler floresan ile müdahale edebilir, çünkü bu konfokal ve plaka okuyucu okuma için özellikle önemlidir. Uygun organoid tohumlama yoğunluğuna bir örnek(Şekil 1A) ve üst üste binen organoidlere sahip bir kültür gösterilmiştir (Şekil 1B). OA ile numune stimülasyo.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada, oleik asit ile kuluçka üzerine insan bağırsak organoidlerinde LD oluşumunu belirlemek için bir protokol sağlar. Bu yöntem LD'ye özgü floresan boya LD54018'edayanmaktadır, bu da organoid kültürdeki lipid damlacıklarının toplam hacminin karakterizasyonuna ve ölçülmesine olanak sağlar. İnsan bağırsak organoid kültürleri kurmak ve korumak için prosedürler13önce yayınlanmıştır , ve bu protokolün görsel bir rehber de mevcuttur15.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
Biz cömertçe LD540 sağlayan için B. Spee teşekkür ederiz. Bu çalışma Hollanda Bilimsel Araştırma Örgütü (NWO-ZonMW; VIDI 016.146.353) Için S.M.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
2+
Ca/Mg<>sup2+< olmadan RWNT-3A üreten hücreler 12604021
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Gelişmiş DMEM/F12 | Gibco | 12634-028 | |
| B27 takviyesi | Gibco | 17504-044 | |
| Bodrum membran matrisi (matrigel) | BD Biosciences | 356231 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | |
| DGAT1 inhibitörü (AZD 3988) | Tocris Bioscience | 4837/10 | |
| Yağ asidi içermeyen BSA | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Formaldehit | Klinipath | 4078-9001 | |
| Glutamin (GlutaMAX, 100x) | Gibco | 15630-056 | |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630-080 | |
| Lazer taramalı konfokal mikroskop | Leica | SP8X | |
| LD540 | , Utrecht Üniversitesi'nden Dr. B. Spee, | ||
| mEGF | Peprotech | 315-09_500ug | |
| N-asetil sistein | tarafından sağlanmıştır.Sigma-Aldrich | A9165-100G | |
| Nikotinamid | Sigma-Aldrich | N0636-500G | |
| Noggin üreten hücreler (HEK293-mNoggin-Fc hücreleri) | J. den Hertog ile MTA, Hubrecht Enstitüsü | ||
| Oleik asit | Sigma-Aldrich | O1008-5G | |
| p38 MAPK inhibitörü (p38i) (SB202190) | Sigma-Aldrich | S7067-25MG | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662-500ML | |
| PBS > | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Penisilin-Streptomisin (5.000 U/mL) | Gibco | 15070-063 | |
| R-spondin üreten hücreler (Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Hücreleri) | & D sistemleri | 3710-001-01 | |
| TC ile tedavi edilen 24 kuyulu plakalar | Greiner-One | 662160 | |
| TC ile muamele edilen siyah şeffaf tabanlı 96 kuyulu plakalar | Corning Life Sciences | 353219 | |
| TGFb tip I reseptör inhibitörü (A83-01) | Tocris Bioscience | 2939/10 | |
| Tripsin (TrypLE Express) | |||
| Yaşam Teknolojileri (L-Wnt-3A hücreleri) | J. den Hertog ile MTA, Hubrecht Enstitüsü | ||
| Y-27632 dihidroklorür (Rho kinaz inhibitörü) | Abcam | ab120129-10 |
Kaynaklar
- Yen, C. L. E., Nelson, D. W., Yen, M. I. Intestinal triacylglycerol synthesis in fat absorption and systemic energy metabolism. Journal of Lipid Research. 56 (3), 489-501 (2015).
- Yen, C. L. E., Stone, S. J., Koliwad, S., Harris, C., Farese, R. V.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
