Yöntem makalesi
* These authors contributed equally
Burada, faj görüntüleme peptid kütüphanesi kullanarak FGFR2'ye bağlanan küçük peptidlerin taranması için ayrıntılı bir protokol sayılmiyoruz. Seçilen peptidlerin FGFR2 in vitro'ya olan yakınlığını ve hücre çoğalmasını bastırma yeteneğini daha da analiz ediyoruz.
İnsan Fibroblast Büyüme Faktörü Reseptörü (FGFR) ailesi, hücre çoğalması, sağkalım, göç ve farklılaşma gibi çeşitli biyolojik faaliyetlerde bulunan FGFR1, FGFR2, FGFR2, FGFR3 ve FGFR4 olmak üzere dört üyeden oluşur. FGFR sinyal yolunda mutasyonlar veya gen amplifikasyon olayları nedeniyle çeşitli kanser türlerinde çeşitli sapmalar tespit edilmiştir. Bu nedenle, son araştırmalar FGFR'lerin terapötik hedeflemesini içeren stratejiler geliştirmeye odaklanmıştır. monoklonal antikorlar, boru hattında sadece birkaç peptit bazlı inhibitörleri vardır. Burada, FGFR2 antagonistleri olarak küçük peptidler görüntülemek için faj ekran teknolojisini kullanarak bir protokol sağlar. Kısaca, faj görüntülenen peptidler bir kütüphane FGFR2 ile kaplı bir tabak içinde kuluçka yada oldu. Daha sonra, bağlanmamış faj TBST tarafından yıkandı (TBS + 0.1% [v/v] Tween-20), ve bağlı faj 0.2 M glisin-HCl tampon (pH 2.2) ile eluted edildi. Eluted faj daha da güçlendirilmiş ve biopanning bir sonraki tur için giriş olarak kullanılmıştır. Üç tur biopanning sonrasında, bireysel faj klonların peptid dizileri DNA dizilimi ile tespit edildi. Son olarak, taranmış peptidler sentezlendi ve yakınlık ve biyolojik aktivite için analiz edildi.
Fibroblast büyüme faktörü reseptörleri (FGVR) hücre çoğalmasında, yara iyileşmesinde ve in vivo1'deanjiyogenezde kilit rol oynar. Çeşitli tümörlerde gözlenen FGFR sinyallerinin anormal aktivasyonu2,3,4,5 gen amplifikasyonu, gen mutasyonları, kromozom salamanasyonları ve aşırı ligand salgılanması6 . FGFR'leri hedef alan birçok inhibitör klinik çalışmalarda umut verici terapötik etkiler göstermiştir ve esas olarak üç tipe ayrılır: (1) fgfr hücre içi etki alanına bağlanan küçük molekül kinaz inhib....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
1. Reaktif hazırlama
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
FGFR2 hedefleyen yüksek bir afinite küçük peptid elde.
Bu çalışmada FGFR2'yi hedefleyen fajları taramak için doktora-7 kütüphanesi kullanılmıştır. İş akışının şematik gösterimi Şekil 1'degösterilmiştir. Bu süreçte faj girdisi (PFU) sayısı değişmeden tutulurken, FGFR2 proteininin kaplama konsantrasyonu kademeli olarak azaltıldı. Faj titresinin sonuçları, kurtarılan faj sayısının kademeli olarak arttığını ve 3 raunt tan sonra ilk tura göre 65 kat ar.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Bir kombinatoryal faj kütüphane hedef molekülleri bağlamak ve fonksiyonlarını düzenleyen yeni peptidlerin yüksek iş letiyet tarama için güçlü ve etkili bir araçtır13. Şu anda, faj ekran peptid kütüphaneleri uygulamaları geniş bir yelpazede var. Örneğin, onlar reseptör proteinlerine bağlı biyoaktif peptidler seçmek için kullanılabilir23, non-protein hedefleri24,25, hastalığa özgü antijen taklitleri1.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yazarlar hiçbir mali çıkar çatışması ilan.
Bu çalışma Guangzhou Bilim ve Teknoloji Programı (No. 2016201604030039) tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 0.22 μ m Filtre | Merck Millipore | MPGP002A1 | |
| 35 cm2 Küçük tabak | Thermo | 150460 | |
| 70 Etanol | Guangzhou kimyasal reaktif fabrikası | 64-17-5-96 | |
| gIII sıralama astarı | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.'den sentez | ||
| 96 oyuklu plaka | Yuva | 701001-2 | |
| Agar | Beyotime | ST004D | |
| Bacto-Tripton | Oksoit | L0037 | |
| BALB/c 3T3 hücreleri | ATCC | CRL-&utangaç; 6587 | |
| BSA | Biodragon | BD-M10110 | |
| CCK-8 kiti | DOJINDO | CK04 | |
| DMEM | Hyclone | sh30243.01 | |
| DMF | Newprobe | PB10247 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576028 | |
| FGF2 Protein | Sino Biological Inc. | 10014-HNAE | Saflık >% 95 |
| Glisin | Sigma | G8898-1KG | |
| IPTG | Beyotime | ST097 | |
| ITC200 sistemi | MicroCal Omega | ||
| NaCl | Sigma | S6191 | |
| NaHCO3< / sub> | Guangzhou kimyasal reaktif fabrikası | 144-55-8 | |
| NaI | Bidepharm | ||
| NaOH | Guangzhou kimyasal reaktif fabrikası | 1310-73-2 | |
| PEG & ndash; 8000 | Sigma | P2139-250 | |
| Ph.D.-7 faj ekran peptit kütüphane kiti | New England BioLabs | E8100S | Ph.D.-7 faj kütüphanesi, E. coli ER2738 konak suşu ve M13KE kontrol fajı |
| Rekombinant FGFR2 hücre dışı alan proteinleri | içeren Sino Biological Inc. | 10824-H08H | Saflık > GL |
| Biochem Ltd.'den (Şangay, Çin) | Küçük peptit | ||
| Tetrasiklin | Sigma | S-SHS-5 | |
| Tris | Sigma | SLF-T1503 | |
| Tween-20 | Beyotime | ST825 | |
| X-gal | Beyotime | ST912 | |
| Maya özü | Oksoit | LP0021 |
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste
İzin iste