Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Glioblastoma'da İşlevsel İlişkili MiRNA'ların Ve Bunların Mühendisliğinin Gen Tedavisi İçin Yapay Kümelere Dönüştürülmesi

5.4K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/60215

⸱

4 Ekim 2019

 , 
1Department of Neurosurgery, Brigham and Women's Hospital-Harvard Medical School

Bu makalede

Özet

Burada tanımlanan biyolojik sinerjik miRNA'ların modüllerini ve bunların kısa transgenlere dönüştürülmesiiçin bir protokoldür, bu da gen terapisi uygulamaları için eşzamanlı aşırı ekspresyon sağlar.

Özet

MikroRNA'ların (miRNA'ların) sağlık ve hastalıktaki biyolojik önemi, tek bir miRNA'nın eylemi yerine aynı anda deregüle edilmiş birçok miRNA'nın belirli kombinasyonlarına dayanır. Bu özel miRNA modüllerinin karakterizasyonu, tedavide kullanımlarını en üst düzeye çıkarmada temel bir adımdır. Bu son derece alakalıdır, çünkü kombinatoryal öznitelikleri pratik olarak kullanılabilir. Burada açıklanan glioblastoma onkojenik kromatin represörlerin kontrolü ile ilgili belirli bir miRNA imza tanımlamak için bir yöntemdir. Yaklaşım ilk olarak tümörlerde normal dokuya göre deregulated olan genel bir miRNA grubunu tanımlar. Analiz, diferansiyel kültür koşullarına göre daha da rafine edilerek, belirli hücresel durumlar sırasında aynı anda ifade edilen miRNA'ların bir alt grubunun altını çizer. Son olarak, bu filtreleri karşılayan miRNA'lar, doğal olarak var olan miRNA kümelerinin genlerinin bir iskelesine dayanan ve daha sonra bu miRNA modüllerinin alıcı hücrelere aşırı ekspresyonu için kullanılan yapay bir polikistronik transgende birleştirilir.

Giriş

miRNA'lar birçok hastalığa geniş bir gen terapisi yaklaşımının geliştirilmesi için eşsiz bir fırsat sunuyoruz1,2,3, kanser dahil4,5. Bu küçük boyutu6dahil olmak üzere bu biyolojik moleküllerin çeşitli benzersiz özellikleri dayanmaktadır, basit biyogenez7, ve ilişki içinde işlev doğal eğilim8. Birçok hastalık genellikle karmaşık biyolojik fonksiyonların düzenlenmesi üzerinde yakınsama belirli miRNA ekspresyon desenleri ile karakterizedir9. Bu yöntemin amacı ilk olarak belirli hücresel fonksiyonlar için sinerjik olarak ilgili miRNA gruplarını tanımlamak için bir strateji tanımlamaktır. Sonuç olarak, bu tür miRNA kombinasyonlarının downstream çalışmalarda ve uygulamalarda yeniden kurulması için bir strateji sağlar.

Bu yöntem, birden fazla miRNA'nın aynı anda fonksiyonel analizini sağlar, çok sayıda mRNA'yı eşzamanlı olarak hedeflemelerinden yararlanarak hastalıkların karmaşık manzaralarını özetlemektedir. Bu yaklaşım son zamanlarda üç miRNA'lardan oluşan bir grubu tanımlamak için kullanılmıştır ki 1) aynı anda beyin kanserinde göz denir ve 2) sinirsel farklılaşma sırasında güçlü bir ko-ekspresyon paterni göstermek yanı sıra radyasyon veya bir genotoksik strese yanıt olarak DNA alkilleyici ajan. Üç miRNA'dan oluşan bu modülün, aşağıda açıklanan kümeleme yöntemi ile kombinatoryal yeniden ekspresyonu, kanser hücrelerinin biyolojisi ile derin bir girişimle sonuçlanır ve klinik öncesi çalışmalar için gen terapisi stratejisi olarak kolayca kullanılabilir10. Bu protokol miRNA araştırmave çeviri uygulamaları dahil olanlar için özel ilgi olabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Glioblastoma'da Fonksiyonel İlişkili MiRNA'ların Karakterizasyonu

  1. Glioblastoma vs beyinde geniş diferansiyel miRNA ekspresyonunun analizi
    1. İlk olarak, tümörde en önemli deregulated miRNA'ları belirleyin. Bu, en az üç farklı yöntem kullanılarak elde edilebilir:
      1. Mine Kanser Genom Atlası, https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga bulunan, veri sıralama için11.
      2. Taze bir operatif numuneden mikrodizi analizi yapın12.
      3. Daha önce yayımlanmış veri kümelerini kullanın13.
        NOT: Hangi yöntem seçilirse seçilsin, çıktı, ekspresyonu tümör biyolojisi ile istatistiksel olarak ilişkili (doğrudan veya ters) miRNA'ların toplu kümesini sağlar. Bu ilk grup, aşağıda açıkıldığı gibi ifade değişikliklerinin daha dinamik bir çözümlemesi gerçekleştirerek en sıkı işlevsel ilişkilendirmeyi görüntüleyen bir miRNA alt kümesinin tanımlanması için daha fazla analiz edilen miRNA'lar havuzunu oluşturur.
  2. Koşula özel miRNA ifade analizi
    1. Hücre farklılaşmasının indüksiyonu:
      1. Tek katmanlı bir kültürün oluşmasını sağlamak için önceden kaplanmış poli-D-lizin (PDL) plastik tabaklar kullanın. Bulaşık kaplaması için PDL'yi 100 μg/mL konsantrasyonda suda çözün. 25 cm2 yüzeyde 1 mL çözelti kullanın. PDL çözeltisi uygulamasından sonra PBS 6 h ile 2x durulayın.
      2. Eşit miktarlarda insan nöral kök hücreleri (100.000 hücre/5 mL) ya kök hücre orta (nörobazal orta + B27 takviyesi + 20 ng/mL EGF/FGF), astrositik farklılaşma ortamı (DMEM + 10% FBS) veya nöronal diferansiyasyon ortamı (nörobazal orta + B27 ek, + 2 μM retinoik asit)14. Oligodendrocyte farklılaşma protokolü IGF-1 eklenmesini gerektirir (200 ng / mL) EGF/ FGF kaldırmasonra 14,15.
      3. Hücre kaplamasonra, 37 °C, 5% CO21 hafta boyunca inkübatör yerleştirin.
    2. RNA çıkarma:
      1. 7 gün sonra, kuvözhücreleri çıkarın ve orta çıkarın.
      2. Hücreleri PBS (5 mL) ile yıkayın. Daha sonra, hücreleri lyse ve bir hücre kazıyıcı kullanarak 1,5 mL microfuge tüp içine hücreleri kazımak için lysis reaktif (Malzemeler Tablosubakınız) 1 mL ekleyin. Lysed hücreleri içeren tüpleri oda sıcaklığında (RT) 5 dakika bekletin.
      3. Üreticinin yönergelerini izleyerek toplam RNA yalıtımına devam edin.
    3. miRNA ifade analizi:
      1. Gerçek zamanlı PCR ile üç farklılaşma deseni arasında 1.1 adımda tanımlanan belirli miRNA'ların diferansiyel ifadesini, TaqMan probları kullanarak ve ters transkripsiyon ve PCR amplifikasyon için üreticinin protokollerini izleyerek ölçün ( Şekil 1).
  3. MiRNA kümelerinin strese özel zorluklara göre doğrulanması
    1. Kültür G34 glioblastoma nörobazal ortamda kök benzeri hücreler + B27 takviyesi + 20 ng/mL EGF/FGF. 25 cm2 düşük eki şişede 5 mL'lik 1 x 106 hücre ile başlayın.
    2. Kaplamadan sonra 48 saat başlayarak, dna alkilleyici ajan temozolomide (TMZ) her 5 günde bir iki katına ekleyin, aşağıdaki gibi:
      1. 5 gün boyunca 5 μM ile başlayın. 5 gün sonra, orta kaldırmak ve temozolomide olmadan taze orta ile değiştirin, hayatta kalan hücrelerin kurtarmak için izin vermek için. 48 saat sonra, 10 μM TMZ ekleyin ve başka bir 5 gün kuluçka.
      2. Tekrar adım 1.3.2.1, en az 100 μM konsantrasyonu ulaşılır ve hücreler ilaca dirençli hale gelene kadar, her zaman IKI katına TMZkonsantrasyonu 10.
    3. Paralel bir deneyde, G34 hücrelerini aşağıdaki gibi ışınla:
      1. 25 cm2 düşük ek şişede 5 mL'de 1 x 106 hücrenin kaplamadan 48 saat sonra başlayan hücrelere 2 Gy enerji ile ışınlanır (foton emisyonu sağlayan herhangi bir ışınlayıcı kabul edilebilir). Hücreleri kuvöze geri ver ve rahatsız etmeyin. 48 saat sonra, ek 2 Gy enerji ile hücreleri tekrar ışın.
      2. Toplam 10 Gy enerji verilene kadar 1.3.3.1 4x adımını tekrarlayın.
      3. Hücreleri kuvöze geri verin ve aşağı analizden önce en az 5 gün boyunca taze ortamda iyileşmelerine izin verin.
    4. Direnç indüksiyonundan sonra, lysis reaktifi kullanarak hücreleri lyse ve üreticinin protokolüne göre toplam RNA ayıklayın.
    5. 1.1-1.2 bölümlerinde tanımlanan belirli miRNA'ların ifadesini adım 1.2.1'de açıklandığı gibi analiz edin (Şekil 2).
  4. Kümelenmiş miRNA'ların işlevsel yakınsamasının karakterizasyonu
    1. miRNA hedefleme tahmin araçları kullanılarak elde edilen 1.2-1.3 bölümlerinde tanımlanan her bir miRNA'nın öngörülen targetome'sini elde edin.
      NOT: Algoritması periyodik olarak16olarak güncelleştirilir gibi biz genellikle TargetScan başvurmak. Ek tahmin araçları miRanda17, miRDB18, ve DIANA-miRPath19vardır. Tüm bu programlar ücretsiz, web tabanlı uygulamalardır.
      1. Targetscan'ın ön sayfasından, önceden doldurulan açılır menüden ilgi miRNA'sını seçin. Gönder düğmesini tıklatın.
      2. İndirme tablosu bağlantısını kullanarak ortaya çıkan hedefler listesini elektronik tablo olarak indirin (Ek Şekil 1).
      3. Yanlış pozitif tahminler olasılığını azaltmak için, alt akış analizlerinde yalnızca korunan siteler sütunundaki hedefleri içerir. Ayrıca, ek miRNA tahmin programları (yukarıya bakın) kullanılarak ve yalnızca tüm algoritmalarda ortak olan hedefler de dahil olmak üzere daha fazla sıkılık elde edilebilir.
    2. Elde edilen targetomeleri, her miRNA'da yaygın olan yolların zenginleşmesini değerlendirmek için ToppGene Suite20 kullanarak Gene Ontoloji kategorilerine göre sınıflandırın.
      1. Giriş türü olarak HGNC sembolü kullanılarak "Eğitim gen kümesi" penceresinde 1.4.1 adımdan elde edilen hedeflerin listesini yapıştırın. Gönder > Başlat'ıtıklatın. Program genlerin girilen listesi için en önemli "Git" kategorilerini gösteren bir çıktı tablosu sağlayacaktır(Ek Şekil 2).
    3. Sonunda ortak bir yol veya hücresel sürecin düzenlenmesi (bu durumda, kromatin düzenleme) düzenlenmesi için her miRNA katkısını kurmak için, belirli hücresel süreç dahil genlerin tam listesi ne karşı adım 1.4.1 elde edilen her targetome kontrol ( yani, kromatin regülasyonu), Biyoinformatik ve Evrimsel Genomik web sitesinde sağlanan Venn diyagramı işlevini kullanarak http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn.
      NOT: Bu program aynı anda birden fazla grubun kesişmesine izin verir (Şekil 3). Her miRNA tarafından sağlanan belirli benzersiz hedefler daha sonra açıklamalı ve downstream fonksiyonel deneyler için seçilir.
      1. Programın ön sayfasında, her bir miRNA veya ilgili pencerelere ilgi için hedef mRNA'lar varsa listeyi yükleyin veya kopyalayın/yapıştırın. Her listeyi benzersiz bir tanımlayıcıyla adlandırın.
      2. Gönder'itıklatın. Program, her sektördeki gen lerin sayısının yanı sıra her alt küme ve kesişme kombinasyonları için mRNA'ların tam listesini içeren bir Venn diyagramının görsel çıktısını sağlayacaktır.

2. MiRNA Modüllerinin PoliksitRonik Transgenik Kümeye Montajı

  1. MiR-17-92 küme lokusuna göre transgenik iskele hazırlanması
    1. Ensembl genomtarayıcı21miR-17-92 kümesinin nükleotit dizisini edinin. Locusun altı kodlanmış miRNA saç tokasını ve çekirdek dizisinin hem yukarı (5') hem de aşağı akım (3') dizilerini kapsayan ~800 baz çifti "çekirdek" dizisini seçin.
    2. Yukarıdaki sırayı herhangi bir sözcük düzenleme programına yapıştırın.
    3. MiRBase22'dealarak altı doğal saç tokasının her birinin dizisini tanımlayın. Bu dizilerin her birini daha önce tanımlanmış "çekirdek" dizisinin açıklığı içinde işaretleyin. Her saç tokası arasındaki tüm diziler, transgenin doğru işlenmesi için önemli olan spacer dizilerini temsil eder.
    4. Her saç tokasının 5' ve 3' uçlarında 3-5 nükleotit hariç, "çekirdek" dizisinden doğal saç tokası dizilerini çıkarın.
  2. Birden fazla miRNA'yı kodlayan yeni bir transgen oluşturma
    1. MiRBase'den transjende aşırı ifade edilmesi amaçlanan miRNA'ların saç tokası dizilerini edinin. Mikroişlemci bölünmesinin olduğu belirli nükleotitleri dikkatlice not edin.
    2. Çıkarılan saç tokalarını (adım 2.1.4) adım 2.2.1'de elde edilen istenilen miRNA'ların saç toka dizileri ile değiştirin.
    3. Transgenin her iki yan bölgesine de istenilen kısıtlama dizilerini ekleyerek, tercih edilen teslimat vektörlerine ikame etmeyi kolaylaştırın. Seçilen kısıtlama dizilerinin dizinin içinde bulunmadığını doğrulayın.
    4. Negatif kontroller için, her olgun miRNA'nın doğal 20 nükleotit dizisini değiştirmek için 20 nükleotit şifreli diziler kullanın. bu karışık dizileri https://genscript.com/tool/create-scrambled-sequence gibi çevrimiçi bir aracı kullanarak oluşturun.
  3. Transgenin iki boyutlu yapısını doğrulama
    1. RNA yapı tahmin yazılım programı RNAweb Fold23içine tam transgenik sırasını kopyalayın.
    2. Standart program ayarlarını kullanarak Devam et'itıklatın.
    3. Özellikle iyi tanımlanmış saç tokalarının varlığı ve mikroişlemci dekolte bölgesine yakın en az 11 nükleotit li çift iplikli kök yapının varlığı için grafik çıktısını analiz edin. Ayrıca, saç tokası dizileri içinde dallanma noktalarının yokluğuna bakın (Şekil 4).

3. DNA Sentezi ile Transgen elde edilmesi

  1. İmrital miRNA kümesinin tasarımı ndan ve silico doğrulamasından sonra, ticari satıcılardan DNA sentezi kullanarak çalışma sırasını elde edin24 ve aşağı akım klonlama ile vektörler ve transgen teslimi ile devam edin. İn vitro doğum için lentiviral vektörler10 ve in vivo intrakranial doğum için adeno-ilişkili virüsler (AAV) kullandık25.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu yöntem, beyin tümörlerinde sürekli olarak aşağı teregüle edilen ve özellikle nöronal farklılaşma sırasında(Şekil 1)birlikte ifade edilen ve daha sonra tümör sağkalım yanıtında yer alan üç miRNA'dan oluşan bir modülün karakterizasyonuna olanak sağladı. tedavi (Şekil 2). Bu karmaşık bir onkojenik kromatin baskıcı yolu düzenleyerek gerçekleştirilir. Bu ko-ifade deseni bu üç miRNA arasında güçlü bir sinerjik aktivite önerdi (

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu protokol, miRNA'ların izole olarak çalışmak yerine, biyolojik olarak gruplar halinde çalışarak ilgili olduğu ve bu grupların transkripsiyon olarak belirli hücresel bağlamlar tarafından belirlendiği fikrine dayanmaktadır26. Bu yaklaşımı çevirisel açıdan haklı göstermek için, hücrelerde/dokularda bu çoklu miRNA deseninin rekreasyonuna olanak tanıyan bir takip protokolü getirilmiştir. Bu miRNA'ların nispeten basit biyogenezinden yararlanarak mümkündür, böylece karakteristik miRNA saç tokasının mik...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar çıkar çatışması bildirmez.

Teşekkürler

Yazarlar destek ve yapıcı eleştiri için Harvey Cushing Nöro Onkoloji Laboratuvarı üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma NINDS tarafından desteklenmiştir K12NS80223 ve K08NS101091 P. P.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
% 0.4 düşük erime sıcaklığı agaroz &IBI BilimselIB70058
0.45 & M steril filtre ünitesiMerck MilliporeSLH033RS
1.5 mL Mikrosantrifüj tüpüEppendorf22431081
6 Kuyulu plakalar Greiner Bio-One657160
Atimik fareler (FoxN1 nu/nu)Envigo069(nu)/070(nu/+)
B-27 Takviyesi Thermo Fisher Scientific12587010
Hücre kültürü şişesiGreiner Bio-One660175
Hücre Sıyırıcı, 16cmSarstedt83.1832
Sezyum 137 ışınlayıcı JL Sheperd and AssociatesÇekirdek Tesisi (Harvard Tıp Okulu)
KloroformSigma-Aldrich439142-4L
DMEM, yüksek glikoz, piruvat ve nbsp;Thermo Fisher Bilimsel11995040
Dulbecco' S Fosfat Tamponlu Salin Gibco14190144
Eosin Y çözümü Sigma-AldrichE4009
Fetal Sığır Serumu Sigma-AldrichF9665
Formalin çözeltisiSigma-AldrichHT501128
GlutaMAX Takviyesi Thermo Fisher Scientific35050061
HEK-293Amerikan Tipi Kültür KoleksiyonuATCC CRL-1573
Hematoksilen çözeltisiSigma-Aldrich1051750500
İnsan primer glioma kök benzeri hücreleri (GBM62)Dr. EA Chiocca (Brigham ve Kadınlar ' s Hastanesi, Boston, MA)
İnsan primer glioma kök benzeri hücreler (MGG4)Dr. Hiroaki Wakimoto (Massachusetts General Hospital, Boston, MA) tarafından sağlanmıştır
Lentiviral vektör pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFPSistemi BiosciencesCD511B-1
Lipofektamin 2000 & nbsp;Thermo Fisher Scientific11668019
Mikrosantrifüj soğutmalıEppendorfmodel no. 5424 R, kat. no.5404000138
Montaj ortamı Thermo Fisher Scientific4112APG
Nalgene Yüksek Hızlı Polikarbonat Yuvarlak Tabanlı Santrifüj Tüpleri Thermo Fisher Bilimsel 3117-0380PK
NanoDropThermo Fisher Scientific2000c
Nöral Progenitör hücreler (NPC)Dr. Jakub Godlewski (Brigham ve Kadınlar s Hastanesi, Boston, MA)
Nörobazal Ortam Thermo Fisher Scientific21103049
Nikon eclipse Ti motorlu floresan mikroskop sistemiNikon, Japonya14314
Opti-MEMThermo Fisher Scientific31985088
PCR tüpleri Sigma-AldrichCLS6571-960EA
Penisilin-Streptomisin Thermo Fisher Scientific15140122
Petri Kapları 94/16 Greiner Bio-One632180
Poli-D-Lizin Sigma- AldrichP4707
Rekombinant İnsan EGF PeproTech AF-100-15
Rekombinant İnsan FGF-temel PeproTech AF-100-18B
Retinoik asitGibco12587-010 
RNA Miniprep KitiDirect-zolR2050
S1000 Termal Döngüleyici Bio-Rad1852196
Küçük Hayvan Görüntü Kılavuzlu Mikro Işınlayıcı Xstrahal Yaşam Bilimleri, Birleşik KrallıkÇekirdek tesisi (Dana-Farber Kanser Enstitüsü, Boston, MA)
Sorvall WX+ Ultrasantrifüj ve nbsp;Thermo Fisher Bilimsel 
StemPro Accutase Thermo Fisher ScientificA1110501
StepOne Gerçek Zamanlı PCR SistemiUygulamalı Biyosistemler 
SterilGARD biyogüvenlik kabini The Baker CompanySG403A-HE
SükrozSigma-AldrichS9378
T98-GAmerikan Tipi Kültür KoleksiyonuATCC CRL-1690
TaqMan MicroRNA Ters Transkripsiyon Kiti Thermo Fisher Scientific4366596
TaqMan Universal PCR Master MixThermo Fisher Scientific4324018
TemozolomideTocris Bioscience2706
Tissue-Tek optimum kesme sıcaklığı Fisher ScientificNC9636948
TRIzol Reaktifi Thermo Fisher Scientific15596026Lizis reaktifi
U251-MGAmerikan Tipi Kültür CollectiATCC HTB-17
U87-MG Amerikan Tipi Kültür KoleksiyonuATCC HTB-14
ViraPower Lentivector İfade sistemi Thermo Fisher ScientificK4970-00
Su, HPLC sınıfıFisherW54
Ksilen Sigma-Aldrich534056
750001004376357

Kaynaklar

  1. Wu, Y. E., Parikshak, N. N., Belgard, T. G., Geschwind, D. H. Genome-wide, integrative analysis implicates miRNA dysregulation in autism spectrum disorder. Nature Neuroscience. 19, 1463-1476 (2016).
  2. Esteller, M. Non-coding RNAs in human disease. Nature Reviews Genetics. 12, 861-874 (2011).
  3. Moradifard, S., Hoseinbeyki, M., Ganji, S. M., Minuchehr, Z. Analysis of miRNA and Gene Expression Profiles in Alzheimer's Disease: A Meta-Analysis Approach. Scientific Reports. 8, 4767(2018).
  4. Calin, G. A., et al. Frequent deletions and down-regulation of micro- RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 99, 15524-15529 (2002).
  5. Croce, C. M. Causes and consequences of miRNA dysregulation in cancer. Nature Reviews Genetics. 10, 704-714 (2009).
  6. Ambros, V. miRNAs: tiny regulators with great potential. Cell. 107, 823-826 (2001).
  7. Treiber, T., Treiber, N., Meister, G. Regulation of miRNA biogenesis and its crosstalk with other cellular pathways. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, 5-20 (2019).
  8. He, L., et al. A miRNA polycistron as a potential human oncogene. Nature. 435, 828-833 (2005).
  9. Santos, M. C., et al. miR-124, −128, and −137 orchestrate neural differentiation by acting on overlapping gene sets containing a highly connected transcription factor network. Stem Cells. 34, 220-232 (2016).
  10. Bhaskaran, V., et al. The functional synergism of miRNA clustering provides therapeutically relevant epigenetic interference in glioblastoma. Nature Communications. 10 (1), 442(2019).
  11. Kim, T. M., Huang, W., Park, R., Park, P. J., Johnson, M. D. A developmental taxonomy of glioblastoma defined and maintained by MiRNAs. Cancer Research. 71 (9), 3387-3399 (2011).
  12. Dell'Aversana, C., Giorgio, C., Altucci, L. MiRNA Expression Profiling Using Agilent One-Color Microarray. Methods in Molecular Biology. 1509, 169-183 (2017).
  13. Silber, J., et al. miR-124 and miR-137 inhibit proliferation of glioblastoma multiforme cells and induce differentiation of brain tumor stem cells. BMC Medicine. 6 (14), (2008).
  14. Hester, M. E., et al. Two factor reprogramming of human neural stem cells into pluripotency. PLoS ONE. 4 (9), e7044(2009).
  15. Hsieh, J., et al. IGF-I instructs multipotent adult neural progenitor cells to become oligodendrocytes. Journal of Cell Biology. 164 (1), 111-122 (2004).
  16. Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J., Bartel, D. P. Predicting effective miRNA target sites in mammalian mRNAs. eLife. 4, e05005(2015).
  17. Betel, D., Wilson, M., Gabow, A., Marks, D. S., Sander, C. The miRNA.org resource: targets and expression. Nucleic Acids Research. 36, D149-D153 (2008).
  18. Wong, N., Wang, X. miRD(B) an online resource for miRNA target prediction and functional annotations. Nucleic Acids Research. 43 (D1), D146-D152 (2015).
  19. Vlachos, I. S., et al. DIANA-miRPath v3.0: deciphering miRNA function with experimental support. Nucleic Acids Research. 43 (W1), W460-W466 (2015).
  20. Chen, J., Bardes, E. E., Aronow, B. J., Jegga, A. G. ToppGene Suite for gene list enrichment analysis and candidate gene prioritization. Nucleic Acids Research. 305, W305-W311 (2009).
  21. Aken, B. L., et al. Ensembl 2017. Nucleic Acids Research. 45, D635-D642 (2017).
  22. Kozomara, A., Birgaoanu, M., Griffiths-Jones, S. miRBase: from miRNA sequences to function. Nucleic Acid Research. 47, D155-D162 (2019).
  23. Lorenz, R., et al. Vienna RNA Package 2.0. Algorithms for Molecular Biology. 6 (1), 26(2011).
  24. Hughes, R. A., Ellington, A. D. Synthetic DNA synthesis and assembly: Putting the synthetic in synthetic biology. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (1), a023812(2017).
  25. Crommentuijn, M. H., et al. Intracranial AAV-sTRAIL combined with lanatoside C prolongs survival in an orthotopic xenograft mouse model of invasive glioblastoma. Molecular Oncology. 10 (4), 625-634 (2016).
  26. Ivey, K. N., Srivastava, D. MiRNAs as regulators of differentiation and cell fate decisions. Cell Stem Cell. 7, 36-41 (2010).
  27. Han, J., et al. Molecular Basis for the Recognition of Primary miRNAs by the Drosha-DGCR8 Complex. Cell. 125, 887-901 (2006).
  28. Barroso-del Jesus, A., Lucena-Aguilar, G., Menendez, P. The miR-302-367 cluster as a potential stemness regulator in ESCs. Cell Cycle. 8, 394-398 (2009).
  29. Liu, Y. P., Haasnoot, J., Brake, O., Berkhout, B., Konstantinova, P. Inhibition of HIV-1 by multiple shRNAs expressed from a single miRNA polycistron. Nucleic Acid Research. 36, 2811-2824 (2008).
  30. Chen, S. C., Stern, P., Guo, Z., Chen, J. Expression of Multiple Artificial MiRNAs from a Chicken miRNA126-Based Lentiviral Vector. PLoS ONE. 6 (7), e22437(2011).
  31. Yang, X., Marcucci, K., Anguela, X., Couto, L. B. Preclinical Evaluation of An Anti-HCV miRNA Cluster for Treatment of HCV Infection. Molecular Therapy. 21, 588-601 (2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

MikroRNA ModülleriGlioblastoma TedavisiYapay Pol Sistronik TransgenlermiR-17-92 İskeletiTargetScan AnaliziToppGene SuiteVenn Diyagramı FonksiyonuRNA Yapı TahminiTemozolomid DirenciNöral Kök Hücreler
Glioblastoma'da İşlevsel İlişkili MiRNA'ların Ve Bunların Mühendisliğinin Gen Tedavisi İçin Yapay Kümelere Dönüştürülmesi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.