Glioblastoma'da İşlevsel İlişkili MiRNA'ların Ve Bunların Mühendisliğinin Gen Tedavisi İçin Yapay Kümelere Dönüştürülmesi

Vivek Bhaskaran; Pierpaolo Peruzzi

doi:10.3791/60215

Yöntem makalesi

Glioblastoma'da İşlevsel İlişkili MiRNA'ların Ve Bunların Mühendisliğinin Gen Tedavisi İçin Yapay Kümelere Dönüştürülmesi

DOI:

10.3791/60215

⸱

4 Ekim 2019

Vivek Bhaskaran¹ , Pierpaolo Peruzzi¹

¹Department of Neurosurgery, Brigham and Women's Hospital-Harvard Medical School

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada tanımlanan biyolojik sinerjik miRNA'ların modüllerini ve bunların kısa transgenlere dönüştürülmesiiçin bir protokoldür, bu da gen terapisi uygulamaları için eşzamanlı aşırı ekspresyon sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MikroRNA'ların (miRNA'ların) sağlık ve hastalıktaki biyolojik önemi, tek bir miRNA'nın eylemi yerine aynı anda deregüle edilmiş birçok miRNA'nın belirli kombinasyonlarına dayanır. Bu özel miRNA modüllerinin karakterizasyonu, tedavide kullanımlarını en üst düzeye çıkarmada temel bir adımdır. Bu son derece alakalıdır, çünkü kombinatoryal öznitelikleri pratik olarak kullanılabilir. Burada açıklanan glioblastoma onkojenik kromatin represörlerin kontrolü ile ilgili belirli bir miRNA imza tanımlamak için bir yöntemdir. Yaklaşım ilk olarak tümörlerde normal dokuya göre deregulated olan genel bir miRNA grubunu tanımlar. Analiz, diferansiyel kültür koşullarına göre daha da rafine edilerek, belirli hücresel durumlar sırasında aynı anda ifade edilen miRNA'ların bir alt grubunun altını çizer. Son olarak, bu filtreleri karşılayan miRNA'lar, doğal olarak var olan miRNA kümelerinin genlerinin bir iskelesine dayanan ve daha sonra bu miRNA modüllerinin alıcı hücrelere aşırı ekspresyonu için kullanılan yapay bir polikistronik transgende birleştirilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

miRNA'lar birçok hastalığa geniş bir gen terapisi yaklaşımının geliştirilmesi için eşsiz bir fırsat sunuyoruz¹^,²^,³, kanser dahil⁴^,⁵. Bu küçük boyutu⁶dahil olmak üzere bu biyolojik moleküllerin çeşitli benzersiz özellikleri dayanmaktadır, basit biyogenez⁷, ve ilişki içinde işlev doğal eğilim⁸. Birçok hastalık genellikle karmaşık biyolojik fonksiyonların düzenlenmesi üzerinde yakınsama belirli miRNA ekspresyon desenleri ile karakterizedir

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Glioblastoma'da Fonksiyonel İlişkili MiRNA'ların Karakterizasyonu

Glioblastoma vs beyinde geniş diferansiyel miRNA ekspresyonunun analizi
1. İlk olarak, tümörde en önemli deregulated miRNA'ları belirleyin. Bu, en az üç farklı yöntem kullanılarak elde edilebilir:
  1. Mine Kanser Genom Atlası, https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga bulunan, veri sıralama için¹¹.
  2. Taze bir operatif numuneden mikrodizi analizi yapın^12.
  3. Daha önce yayımlanmış veri kümelerini kullanın¹³.
    NOT: H....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yöntem, beyin tümörlerinde sürekli olarak aşağı teregüle edilen ve özellikle nöronal farklılaşma sırasında(Şekil 1)birlikte ifade edilen ve daha sonra tümör sağkalım yanıtında yer alan üç miRNA'dan oluşan bir modülün karakterizasyonuna olanak sağladı. tedavi (Şekil 2). Bu karmaşık bir onkojenik kromatin baskıcı yolu düzenleyerek gerçekleştirilir. Bu ko-ifade deseni bu üç miRNA arasında güçlü bir sinerjik aktivite önerdi (

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, miRNA'ların izole olarak çalışmak yerine, biyolojik olarak gruplar halinde çalışarak ilgili olduğu ve bu grupların transkripsiyon olarak belirli hücresel bağlamlar tarafından belirlendiği fikrine dayanmaktadır²⁶. Bu yaklaşımı çevirisel açıdan haklı göstermek için, hücrelerde/dokularda bu çoklu miRNA deseninin rekreasyonuna olanak tanıyan bir takip protokolü getirilmiştir. Bu miRNA'ların nispeten basit biyogenezinden yararlanarak mümkündür, böylece karakteristik miRNA saç tokasının mik.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar çıkar çatışması bildirmez.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar destek ve yapıcı eleştiri için Harvey Cushing Nöro Onkoloji Laboratuvarı üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma NINDS tarafından desteklenmiştir K12NS80223 ve K08NS101091 P. P.

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
% 0.4 düşük erime sıcaklığı agaroz &	IBI Bilimsel	IB70058
0.45 & M steril filtre ünitesi	Merck Millipore	SLH033RS
1.5 mL Mikrosantrifüj tüpü	Eppendorf	22431081
6 Kuyulu plakalar	Greiner Bio-One	657160
Atimik fareler (FoxN1 nu/nu)	Envigo	069(nu)/070(nu/+)
B-27 Takviyesi	Thermo Fisher Scientific	12587010
Hücre kültürü şişesi	Greiner Bio-One	660175
Hücre Sıyırıcı, 16cm	Sarstedt	83.1832
Sezyum 137 ışınlayıcı	JL Sheperd and Associates	Çekirdek Tesisi (Harvard Tıp Okulu)
Kloroform	Sigma-Aldrich	439142-4L
DMEM, yüksek glikoz, piruvat ve nbsp;	Thermo Fisher Bilimsel	11995040
Dulbecco' S Fosfat Tamponlu Salin	Gibco	14190144
Eosin Y çözümü	Sigma-Aldrich	E4009
Fetal Sığır Serumu	Sigma-Aldrich	F9665
Formalin çözeltisi	Sigma-Aldrich	HT501128
GlutaMAX Takviyesi	Thermo Fisher Scientific	35050061
HEK-293	Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu	ATCC CRL-1573
Hematoksilen çözeltisi	Sigma-Aldrich	1051750500
İnsan primer glioma kök benzeri hücreleri (GBM62)			Dr. EA Chiocca (Brigham ve Kadınlar ' s Hastanesi, Boston, MA)
İnsan primer glioma kök benzeri hücreler (MGG4)			Dr. Hiroaki Wakimoto (Massachusetts General Hospital, Boston, MA) tarafından sağlanmıştır
Lentiviral vektör pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP	Sistemi Biosciences	CD511B-1
Lipofektamin 2000 & nbsp;	Thermo Fisher Scientific	11668019
Mikrosantrifüj soğutmalı	Eppendorf	model no. 5424 R, kat. no.5404000138
Montaj ortamı	Thermo Fisher Scientific	4112APG
Nalgene Yüksek Hızlı Polikarbonat Yuvarlak Tabanlı Santrifüj Tüpleri	Thermo Fisher Bilimsel	3117-0380PK
NanoDrop	Thermo Fisher Scientific	2000c
Nöral Progenitör hücreler (NPC)			Dr. Jakub Godlewski (Brigham ve Kadınlar s Hastanesi, Boston, MA)
Nörobazal Ortam	Thermo Fisher Scientific	21103049
Nikon eclipse Ti motorlu floresan mikroskop sistemi	Nikon, Japonya	14314
Opti-MEM	Thermo Fisher Scientific	31985088
PCR tüpleri	Sigma-Aldrich	CLS6571-960EA
Penisilin-Streptomisin	Thermo Fisher Scientific	15140122
Petri Kapları 94/16	Greiner Bio-One	632180
Poli-D-Lizin	Sigma- Aldrich	P4707
Rekombinant İnsan EGF	PeproTech	AF-100-15
Rekombinant İnsan FGF-temel	PeproTech	AF-100-18B
Retinoik asit	Gibco	12587-010
RNA Miniprep Kiti	Direct-zol	R2050
S1000 Termal Döngüleyici	Bio-Rad	1852196
Küçük Hayvan Görüntü Kılavuzlu Mikro Işınlayıcı	Xstrahal Yaşam Bilimleri, Birleşik Krallık	Çekirdek tesisi (Dana-Farber Kanser Enstitüsü, Boston, MA)
Sorvall WX+ Ultrasantrifüj ve nbsp;	Thermo Fisher Bilimsel
StemPro Accutase	Thermo Fisher Scientific	A1110501
StepOne Gerçek Zamanlı PCR Sistemi	Uygulamalı Biyosistemler
SterilGARD biyogüvenlik kabini	The Baker Company	SG403A-HE
Sükroz	Sigma-Aldrich	S9378
T98-G	Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu	ATCC CRL-1690
TaqMan MicroRNA Ters Transkripsiyon Kiti	Thermo Fisher Scientific	4366596
TaqMan Universal PCR Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4324018
Temozolomide	Tocris Bioscience	2706
Tissue-Tek optimum kesme sıcaklığı	Fisher Scientific	NC9636948
TRIzol Reaktifi	Thermo Fisher Scientific	15596026	Lizis reaktifi
U251-MG	Amerikan Tipi Kültür Collecti	ATCC HTB-17
U87-MG	Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu	ATCC HTB-14
ViraPower Lentivector İfade sistemi	Thermo Fisher Scientific	K4970-00
Su, HPLC sınıfı	Fisher	W54
Ksilen	Sigma-Aldrich	534056

750001004376357

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wu, Y. E., Parikshak, N. N., Belgard, T. G., Geschwind, D. H. Genome-wide, integrative analysis implicates miRNA dysregulation in autism spectrum disorder. Nature Neuroscience. 19, 1463-1476 (2016).
Esteller, M. Non-coding RNAs in human disease. Nature Reviews Gene....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

MikroRNA Mod lleri Glioblastoma Tedavisi Yapay Pol Sistronik Transgenler miR 17 92 skeleti TargetScan Analizi ToppGene Suite Venn Diyagram Fonksiyonu RNA Yap Tahmini Temozolomid Direnci N ral K k H creler

Glioblastoma'da İşlevsel İlişkili MiRNA'ların Ve Bunların Mühendisliğinin Gen Tedavisi İçin Yapay Kümelere Dönüştürülmesi

Bu makalede

Özet

Özet

Giriş

Protokol

Sonuçlar

Tartışma

Açıklamalar

Teşekkürler

Malzemeler

Kaynaklar

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

İlgili makaleler