Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Drosophila Erkek Aksesuar Bezlerinin Sekonder Hücrelerinden RNA'yı Izole etmek için FACS tabanlı Protokol

6.6K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/60218

⸱

5 Eylül 2019

 ,  , 
1Department of Genetics and Evolution, University of Geneva

Bu makalede

Özet

Burada, RNA dizilimi ve RT-qPCR için Drosophila erkek aksesuar bezlerinden (ikincil hücreler) belirli bir hücre popülasyonunu ayrıştırmak ve sıralamak için bir protokol sıyoruz. Hücre izolasyonu, diseksiyon gerektiren çok aşamalı bir ayrışma sürecinden sonra GFP ifade eden ikincil hücrelerin FACS saflaştırılması ile gerçekleştirilir, proteozs sindirim ve mekanik dağılım.

Özet

Bir organın işlevini anlamak için, genellikle kurucu hücre popülasyonlarının rolünü anlamak yararlıdır. Ne yazık ki, bireysel hücre popülasyonlarının nadirlik genellikle zor moleküler çalışmalar için yeterli malzeme elde etmek için yapar. Örneğin, Drosophila erkek üreme sisteminin aksesuar bezi iki farklı salgı hücre tipleri içerir. Ana hücreler bezin salgı hücrelerinin %96'sını oluştururken, ikincil hücreler (SC) hücrelerin kalan %4'ünü (erkek başına yaklaşık 80 hücre) oluşturur. Her iki hücre tipi de meni sıvısının önemli bileşenlerini üretse de, sadece birkaç genin SC'lere özgü olduğu bilinmektedir. SCs nadir, şimdiye kadar, bu önemli hücre tipinin transkripsiyonanalizi çalışma engelledi. Burada, RNA çıkarma ve sıralama için SCs saflaştırma sağlayan bir yöntem sunulmaktadır. Protokol, sc'ye özgü gfp muhabirini ifade eden sineklerin bezlerini ilk olarak incelemekten ve daha sonra bu bezleri sindirimi ve mekanik ayrışmayı tek tek hücreler elde etmek için proteaz etmek için maruz bırakmaktan oluşur. Bu adımları takiben, bireysel, canlı, GFP işaretli hücreler RNA arınması için floresan aktif hücre ayırıcı (FACS) kullanılarak sıralanır. Bu işlem, bir gün içinde aşağı RT-qPCR ve/veya RNA dizilimi için koşul başına ~40 erkekten SC'ye özgü RNA'lar verir. Prosedürün hızı ve basitliği, farklı genotiplerden veya çevre koşullarından birçok farklı sineğin transkriptomlarının kısa sürede belirlenmesini sağlar.

Giriş

Organlar, her biri ayrı ayrı işlevlere sahip ve bazen çok farklı gen kümelerini ifade eden birden fazla hücre tipinden oluşur. Bir organın nasıl işlediğini tam olarak anlamak için, bu organı oluşturan her farklı hücre türünü incelemek genellikle önemlidir. Olası fonksiyonu araştırmak için kullanılan birincil yöntemlerden biri transkriptom analizidir. Bu güçlü yöntem, aktif süreçleri ve yolları ortaya çıkarmak için, bir hücredeki gen ekspresyonunun anlık görüntüsünü sağlar. Ancak, bu tür analizler genellikle çok daha bol komşu hücrelerden arındırılmış olması gereken nadir hücre popülasyonları için zordur. Örneğin, Drosophila erkek aksesuar bezi öncelikle iki salgı hücre tiplerinden oluşan bir organdır. Bu iki hücre tipinin nadiri bu bezin hücrelerinin sadece %4'ünü oluşturduğundan, bu hücrelerin işlevini belirlemeye yardımcı olmak için hücre tipi spesifik transkripsiyon analizi kullanılmamıştır.

Aksesuar bezleri (AGs) böceklerde erkek üreme yolu organlarıdır. Meni sıvısı (seminal sıvı proteinleri (SP) ve aksesuar bezi proteinleri (PSEP) proteinlerinin çoğunun üretiminden sorumludurlar. Bu SP'lerden bazılarının çiftleşme sonrası çiftleşme yanıtı (PMR) olarak adlandırılan çiftleşmeli kadınlarda fizyolojik ve davranışsal tepkileri tetiklemeleri bilinmektedir. Bazı PmR şunlardır: artan yumurtlama ve yumurta döşeme oranı, depolama ve sperm serbest bırakılması, kadın diyetbir değişiklik, ve ikincil kur erkeklere kadın alıcılık bir azalma1,2. Böcekler insan sağlığından (ölümcül hastalıklar için vektörler olarak) tarıma (böcekler zararlı olabilir, ancak tozlaşma ve toprak kalitesi için kritik tir) gibi birçok önemli toplumsal sorunları etkilediğinden, böcek üremesinin anlaşılması önemli bir araştırma alanıdır. AGs ve PPS çalışma model organizma Drosophila melanogaster ile önemli ölçüde ilerletilmiştir. Bu çalışmalar, Hastalık vektörü Aedes aegypti3,4ve diğer böcekler 1 gibi diğer türlerde çalışmayı etkileyen, PMR oluştururken ürettikleri AG'lerin ve bazı bireysel proteinlerin rolünü vurgulamıştır. ,5. Ayrıca, AGs meni sıvısı bileşenleri salgılar gibi1,6 genellikle memeli prostat bezi ve seminal vezikül fonksiyonel analog olarak düşünülmektedir. Bu fonksiyon benzerliği iki doku tipi arasındaki moleküler benzerlikler ile birlikte, AGs sinekler prostat bezi için bir model yaptık7.

Drosophila erkek içinde, aksesuar bezleri iki loblar vardır. Her lob merkezi bir lümen çevreleyen salgı hücrelerinin bir monolayer oluşan bir kese benzeri bir yapı olarak görülebilir, ve düz kaslar tarafından sarılmış. Yukarıda belirtildiği gibi, bu bezi oluşturan iki morfolojik, gelişimsel ve işlevsel olarak farklı salgı hücre tipleri vardır: poligonal şekilli ana hücreler (hücrelerin ~% 96'sını oluşturan) ve daha büyük, yuvarlak ikincil hücreler (SC) (oluşturan hücrelerin kalan% 4, ya da lob başına yaklaşık 40 hücre). Her iki hücre türünün de PMR'yi ikna etmek ve korumak için farklı AcP kümeleri ürettiği gösterilmiştir. Bugüne kadar elde edilen verilerin çoğu PMR karakteristik davranışlarının çoğunu tetikleyen tek bir proteinin rolünü vurgulamaktadır. Bu protein, cinsiyet peptid, ana hücreleri tarafından salgılanan küçük, 36 amino asit peptid8,9,10. Seks peptid PMR önemli bir rol oynamak gibi görünse de, diğer AcPs, hem ana hem de ikincil hücreler tarafından üretilen, ayrıca PMR çeşitli yönlerini etkilediği gösterilmiştir11,12,13,14 ,15,16,17. Örneğin, mevcut bilgidayanarak, SCs, ürettikleri proteinler aracılığıyla, ilk gün18sonra SP sinyal sürekliliği için gerekli gibi görünüyor.

SCs nadir göz önüne alındığında (erkek başına sadece 80 hücre), bu hücreler ve ürettikleri proteinler hakkında tüm bilgi genetik ve aday yaklaşımlar geliyor. Şimdiye kadar, genlerin sadece nispeten küçük bir liste SC özgü olduğu gösterilmiştir. Bu liste homeodomain protein Defective proventriculus içerir (Dve)19, lncRNA MSA20, Rab6, 7, 11 ve 1921, CG1656 ve CG1757511, 15,21 ve homeobox transkripsiyon faktörü Abdominal-B (Abd-B)18. Daha önce, ikincil hücrelerde Abd-B ve lncRNA MSA ifadesiiçin bir mutant eksikliği göstermiştir ~10 gün sadece bir gün12 PMR süresini kısaltır , 18.000 , 20. Bu fenotip kadın üreme sisteminde SP uygunsuz depolama neden gibi görünüyor12,18,20. Hücresel düzeyde, Bu mutant ikincil hücreler anormal morfoloji sevesi, karakteristik vakuol benzeri yapıları kaybetme18,20,21. Bu mutant hattı kullanarak, daha önce ya vahşi tip veya mutant aksesuar bezleri12tüm AGs transkripsiyonel profilleri karşılaştırarak SC fonksiyonu dahil genleri tanımlamak için çalıştı. Ayrıca, diğer laboratuvarlar SC numarası, morfolojisi ve vakuolar içerik erkek diyet, çiftleme durumu ve yaş21,25,26bağlıdır gösterdi .

Bu yaklaşımlar kullanılarak olumlu ilerleme kaydedilen rağmen, tam bir SC transkripsiyonu elde edilemedi. Bu organdaki bu hücrelerin nadirliği, yabani tip hücrelerden daha da ilerlemesini zorlaştırdı. Gen ekspresyonunu test etmek için, belirli çevresel uyaranlardan sonra bu hücrelerdeki değişiklikler daha da zor olacaktır. Böylece, farklı genetik arka planlar ve çevre koşulları altında gerçekleştirmek için yeterince hızlı ve basit olan SC RNA'yı izole etmek ve arındırmak için bir yönteme ihtiyaç duyuldu.

Hem Abd-B ve MSA genleri Drosophila Bithorax Kompleksi belirli bir 1.1 kb arttırıcı gerektirir (D1 arttırıcı denir) SCs kendi ifade için18,20. Bu artırıcı daha önce bir GAL4 sürücüsü oluşturmak için kullanılmıştır, bir UAS-GFPile ilişkili olduğunda , Özellikle SCs güçlü GFP ifade sürücü yapabiliyor. Böylece, bu hücreleri hem vahşi tipten hem de iab-6cocuD1 AĞ'larından ayırmak için bir FACS protokolünün temeli olarak bu satırı kullandık). iab-6cocuD1 mutant SC'leri farklı bir hücresel morfoloji sergilediklerinden, bu protokolün çok farklı koşullar altında bu nadir hücre tipinden transkripsiyonlarının belirlenmesi için hücreleri izole etmek için kullanılabileceğini gösteriyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Kullanılan Drosophila Hatları ve Erkek Koleksiyonu

  1. Bu protokol için, ana hücrelerde değil, SC'lerde GFP ifade eden erkekleri kullanın. Burada, bir AbdB-GAL4 sürücüsü (referans18'deaçıklanan), UAS-GFP (kromozom 2 üzerinde) ile yeniden birleştirilir. Diğer uygun sürücüler de kullanılabilir. Farklı mutant koşullar altında SC'lerin izolasyonu için mutasyonu SC'ye özgü GFP çizgisini içeren çizgilere geçin.
  2. Her genotip için yaklaşık 25 sağlıklı, bakire erkek ten iki parti toplayın ve taze yapılmış Drosophila gıda ile şişelerde 3-4 gün boyunca 25 °C'de yaşlayın.
    NOT: Yaş, miyetelik durumu, beslenme ve sosyal çevre üreme biyolojisini etkilediği için, bu parametrelerin kontrolü için sıkı protokoller izlenmelidir. Bakire erkekler, 25 °C'de pupal klopiyondan sonra, standart mısır unu-agar mayalı gıdalarda, şişe başına 20-25 erkek gruplar halinde, 12 h/12 h açık/koyu çevrimile 3-4 gün yaşlanırlar.

2. Çözümler ve Malzeme Hazırlama

  1. Aşağıdaki çözümleri hazırlayın.
    1. Hazırlayın Serum Takviyeli Orta (SSM): Schneider's Drosophila orta ile tamamlanmaktadır 10% ısı inaktive fetal sığır serum ve 1% Penisilin-Streptomisin.
    2. 1x tripsin enziminin aliquotlarını hazırlayın (örneğin, TrypLE Express Enzimi) ve oda sıcaklığında saklayın.
    3. Papain [50 U/mL] (-20 °C'de depolanır ve sadece bir kez çözülür) aliquots hazırlayın.
    4. 1x fosfat tampon salin (PBS, oda sıcaklığında saklanır) hazırlayın.
  2. Aksesuar bezlerinin fiziksel ayrışması için birden fazla alev yuvarlak pipet ipucu hazırlayın.
    NOT:     İşlenmemiş plastiklere yapışma eğiliminde olan aksesuar bezlerini işlemek için düşük tutma ipuçları kullanın. Alev yuvarlama işlemi uç açılmasını azaltır ve ucun kenarlarını yumuşatır. Bu hücre zarları kesme olmadan peptidaz sindirim sonrası etkili bir dissosiasyon sağlar.
    1. Keskin bir bıçakla 200 μL'lik bir ucu kesin ve 3.7 adımda açmanın daha geniş ama düzgün olması için ucunu yuvarlamak için bir alevin üzerine hafifçe geçirin.
    2. Bir alevin yanında açılan ucu bir saniyeden daha kısa bir süre geçirerek birden fazla 1.000 μL ipucunun açılmasını daraltın. Aşırı erimeyi veya tıkanmayı önlemek için ucu hafifçe döndürün. Daha dardan daha geniş lere doğru yapılan ipuçlarını sıralayın. Bu aspirasyon hızı zamanlama ile yapılabilir. En dar ipuçlarının verimliliğini test etmek için KÜÇÜK ölçekli BIR ÖRNEK AG'yi ayırmaya çalışın.
      NOT: Bu ipuçları mekanik ajitasyon için önemlidir (adım 5.2 ve 5.3). Kaliteli alev yuvarlak pipet uçları hücre canlılığını korurken tam bir dissociation sağlar. Bu nedenle, bu ipuçları yeniden kullanım için prosedürün sonunda iyice su ile yıkanır. Bu gün tekrarlanabilir dissociation gün sağlar.

3. Aksesuar Bezlerinin Diseksiyonu

  1. 20-25 erkek Drosophila'yı buz üzerinde cam bir tabağa koyun.
  2. SSM'de 1 erkeği inceleyin. Onun üreme yolu çıkarın ve boşalma kanalı dışında tüm diğer dokulardan aksesuar bezi çifti temizleyin.
    NOT: Serbest bırakılan sperm kümeler oluşturabilir ve dissociation sürecini bozabilir, çünkü testisler kaldırın. Boşalma ampulü çıkarın, bu da yüzdüğünde kullanımı zorlaştırır.
  3. Forceps ile, oda sıcaklığında SSM ile dolu bir cam plaka aksesuar bezleri aktarın. SSM'de 20 çift bezden oluşan bir parti elde etmek için adımları 3,2-3,3 20 kez tekrarlayın.
    NOT: Bu adımlar 15-20 dakika içinde elde edilecektir. GFP floresan mikroskop kullanılarak izlenebilir.
  4. Oda sıcaklığında 1-2 dk yıkama için aksesuar bezlerini 1x PBS'ye aktarın.
    NOT: Daha iyi ayrışma için, PBS ile bezleri durulamak zorunludur. Ancak bu adımın süresi, hücreler PBS'de stres belirtileri gösterdiğinden sınırlandırılmalıdır; PBS'deki ayrışmış ikincil hücreler hızla şişip ölür.
  5. Seyreltmek 20 μL papain [50 U/ mL] içine 180 μL 1x tripsin enzimi (ölçeklendirmek veya küçültmek için 9 μL tripsin enzimi ve her erkek için 1 μL papain tutmak). Forseps ile aksesuar bezlerini bu solüsyonuna aktarın.
  6. Aksesuar bezlerinin ucunu (ikincil hücreler içeren) proksimal parçadan izole edin. Glandüler lobun ortasını sıkıca çimdiklemek ve ikinci bir bütsepsin keskin ucuyla kesmek için ince bütüller kullanın. Dissociation geliştirmek ve hücre sıralama süresini azaltmak için aksesuar bezleri ve boşalma kanalının proksimal kısmını çıkarın.
    NOT: 20 çift bezden distal kısmının kesilmesi 15-20 dakika sürer ve peptidazlar tarafından sindirim böylece oda sıcaklığında başlayacaktır.
  7. Tüm bez uçları kesildikten sonra, Adım 2.2.1'de hazırlanan özel 200 μL pipet ucu kullanılarak 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın. Bezleri işlemeden önce geniş, yuvarlak ve ıslak olmalıdır.
    NOT: Boru aksesuar bezi dokusu için, ipuçları her zaman uygun çözelti ile önceden ıslak olmalıdır (tripsin enzim veya SSM, bu amaç için her biri bir tüp tutmak). Kontaminasyonu önlemek için numuneler arasındaki uçları dikkatlice durulayın.

4. Doku Sindirim

  1. Mikrotüpü 37 °C'lik bir çalkalayıcıya 60 dakika boyunca yerleştirin ve 1.000 rpm'de sallayın.
    NOT: Hem ajitasyon hem de sindirim süresi başarılı ayrışma için çok önemlidir. Kısa veya hareketsiz sindirim kötü ayrışma verecektir, muhtemelen çünkü dış kas tabakası ve iç viskoz meni alkan peptidases aksesuar bezi hücreleri korumak.
  2. Sindirimi durdurmak için oda sıcaklığında 1 mL SSM ekleyin ve hemen adım 5'e geçin.

5. Hücrelerin Mekanik Olarak Dissociasyonu

  1. SSM ile önceden ıslak olan geniş yuvarlak 1.000 μL uçlu bir uç kullanarak numuneyi 24 kuyulu bir plakaya aktarın. GFP floresansını mikroskop altında izleyin: çoğu bez ucu sağlam görünmeli ve birkaç SC koparılmalıdır.
  2. Step 2.2.2'de oluşturulan yuvarlak dar pipet ucu kullanılarak, aksesuar bezi dokusunu bozmak için 3-5 kez yukarı ve aşağı borular takın.
    NOT: Büyük doku yamaları kırık olduğundan emin olmak için floresan izleyin. Bu durumda değilse adım 5.2'yi tekrarlayın.
  3. Çok dar bir yuvarlak pipet ucu (Adım 2.2.2'de oluşturulan) kullanarak, pipet yukarı ve aşağı 1-2 kez.
    NOT: Adım 5.3'ten sonra yalnızca tek tek hücreler görünür olmalıdır. İşlemin kolay izlenmesini sağladığından 24 kuyulu plakakullanılması önerilir. Birkaç örnek işlendiğinde ve tatmin edici sonuç verildiğinde (sağlıklı görünümlü ikincil hücreler mükemmel bir şekilde ayrıştırıldı), pipetleme adımları mikrotüpte gerçekleştirilecektir.
  4. Hücrelerin kuyunun dibine yerleşmesini sağlamak ve sıralama süresini kısaltmak için fazla SSM'yi kaldırmak için en az 15 dakika bekleyin.
    NOT: Hücrelerin yerleşmesine izin vermek santrifüj gibi alternatif yöntemlerden daha üstün olduğunu kanıtladı ve FACS'dan hemen önce hücrelerin son görsel incelemesine olanak sağlıyor.
  5. Hücreleri temiz bir 1,5 mL tüpe yerleştirin ve aynı örnekleri (her durum için 20 erkekten oluşan iki toplu iş) havuza yerleştirin. Son hücreleri kurtarmak için kuyuları SSM ile yıkar ve tüpe boruyla yerleştirin (küçük bir hacim kullanın).
  6. 1,5 mL mikrotüplerde, 300 μL Hücre Lisis Çözeltisi ve 1 μL Proteinaz K [50 μg/μL] ekleyin (RNA arıtma kitinde sağlanan çözeltiler, bkz. Adım 7). Her numune için iki tüp hazırlayın (biri MM'ler için, diğeri sc'ler için).

6. FACS (Floresan-aktive Hücre Sıralama)

  1. Sıralamadan birkaç dakika önce (0,3 mM Draq7) sıralanacak her örneğe canlılık işaretçisi ekleyin.
    DİkKAT: Draq7 dikkatli ele alınmalıdır.
  2. Canlı sekonder hücrelerin homojen popülasyonunu (GFP-pozitif, Draq7-negatif hücreler) sıralayın. Başka bir mikrotüp, ana hücrelerin bir nüfus sıralamak (küçük, GFP-negatif, Draq7-negatif hücreler). Aşağıdaki FACS gating stratejisini kullanın:
    NOT:     Hücre ayırıcı basıncını 25 PSI olarak ayarlayın ve hücreleri 100 μm'lik bir memeden geçirin. Sıralama oranı yaklaşık 2.000 hücre/s'dir.
    1. Enkazı hariç tonur ve enkazı dışlamak için FSC-SSC(Şekil 2E)tabanlı toplam hücreleri seçin.
    2. Ölü hücreleri hariç tut. 640 nm lazer ile Draq7 heyecanlandırmak ve 795/70 bant-pass filtre ile yayılan floresan toplamak. Kapı Draq7-pozitif hücreler (Şekil 2F).
    3. SSC-H vs SSC-W ve FSC-A vs FSC-H(Şekil 2H)üzerinde çift kaplama kullanarak doublet'leri çıkarın.
      NOT: Ana hücre kontaminasyonunu azaltmak için çift emerek hücre çiftlerini katı bir şekilde dışlayın.
    4. ~550 GFP pozitif hücreleri Lysis tamponu ve Proteinaz K ile 1,5 mL'lik bir mikrotüp halinde sıralayın. Bu popülasyon ikincil hücreler olarak kabul edilir (SC, Şekil 2G). 488 nm'de GFP'yi heyecanlandırın ve 526/52 bant geçişli filtreyle yayılan floresan'ı toplayın.
    5. Sıralama ~ 1,000 GFP-negatif hücreleri, homojen ve boyutu küçük, Bir 1.5 mL mikrotüp içine Lysis tampon ve Proteinaz K ile. Bu popülasyon ana hücreler olarak kabul edilir (MC, Şekil 2G).
    6. Girdap tüm örnekleri.
      NOT: 40 erkekten (~40 x 80 SC = 3.200 sekonder hücre), 600-800 canlı singlet ikincil hücre elde edilir (%yaklaşık %20-25 alma). Örnekleri normalleştirmek için 550 SC ve 1.000 MC civarında sıralama yapmayı bırakın.

7. RNA Çıkarma

NOT: Biz Aşağıdaki adaptasyonları ile, RNA çıkarma için Epicentre MasterPure RNA Arıtma Kiti kullanılır. Verim ~ 500 hücrelerinden (2 ng RNA burada kullanılmıştır) sıralama için bir kütüphane hazırlamak için yeterince yüksek olduğu sürece diğer kitleri kullanılabilir.

  1. Hücre lisisini tamamlamak için 65 °C'de 15 dakika ve her 5 dakikada bir girdap olarak ısı örnekleri.
  2. Örnekleri 5 dakika boyunca buza yerleştirin. Üreticinin nükleik asit çökeltmeleri için tavsiyelerine uyun ("Toplam Nükleik Asitlerin Yağışı" ve "Total Nükleik Asit Preparatlarından Kirletici DNA'nın Çıkarılması" parçaları) izleyin.
  3. RNA peletini 10 μL RNase içermeyen TE tamponunda askıya alın.
  4. RNase inhibitörü ekleyin (isteğe bağlı).
  5. Örnekleri -80 °C'de saklayın.

8. RNA Miktar, Kalite ve Özgüllük Kalite Kontrolleri

  1. Tahmin RNA kalitesi ve konsantrasyonu. Küçük hacim ve konsantrasyon nedeniyle, burada RNA 6000 Pico yongaları kullanın. Kaliteli RNA, rRNA'lara karşılık gelen keskin zirveleri olan düşük taban çizgisi olarak görülebilen, bozulmayan olarak tanımlanır.
  2. Sıralanmış hücrelerin kimliğini kontrol etmek için RT-qPCR
    1. Rasgele hexamer'ları astar olarak kullanarak toplam RNA'ların 2 ng'si ile ters transkripsiyon gerçekleştirin. İkincil hücre RNA ve ana hücre RNA üzerinde RT gerçekleştirin.
      NOT: cDNA'lar seyreltilebilir, seyreltilebilir ve daha sonra kullanılmak üzere dondurulabilir.
    2. Ev tutma genlerini(alfa-Tubulin, 18S rRNA),sekonder hücre spesifik genleri(MSA, Rab19, Abd-B)ve ana hücrespesifik geni(Cinsiyet peptidi)ölçmek için uygun astar çiftlerini kullanarak gerçek zamanlı kantitatif PCR gerçekleştirin.

9. Sıralama (cDNA Kitaplık Hazırlama, Sıralama ve Veri Analizi)

  1. POLYDT astarları ile cDNA sentezlemek için toplam RNA 2 ng kullanın. Amplifikasyon için onları yükseltmek için SMARTer teknolojisini kullanın.
  2. Kitaplığı hazırlamak için Nextera XT kiti kullanın.
  3. Birden çokkatlı, 100 nükleotit tek bir sıralama okur (50 nükleotit okuma çoğu amaç için uygun olsa bile) her örnek için yaklaşık 30 milyon okuma verim.

10. Veri Analizi

  1. FastQC çalıştırın.
  2. UCSC dm6 Drosophila referans genomundaki okumaların haritasını çıkarmak ve .bam dosyaları oluşturmak için STAR hizalayıcısını kullanın. Genom tarayıcıdaki okumaları görselleştirmek için Tümleştirici Genomik Görüntüleyici'yi (IGV) kullanın.
  3. Gen sayımlarını gerçekleştirmek için HTSeq'yi kullanın.
  4. Gen sayılarını normalleştirmek için Kırpılmış M değerleri Ortalaması (TMM) yöntemini kullanın22. Diferansiyel ifade, MA çizimleri ve PCA'nın istatistiksel analizini yapmak için edgeR'ı kullanın.
  5. Gen ekspresyonu analizi ve istatistikleri için, Yanlış Algılama Oranı (FDR) ve Benjamini & Hochberg düzeltme (BH) ile Genel Doğrusal Model, yarı olasılıklı F-testi kullanın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Burada sunulan protokol, bir deneycinin Drosophila erkek aksesuar bezlerinden ikincil hücreleri izole etmesini ve rnalarını tek bir gün içinde çıkarmasını sağlar(Şekil 1).

Abd-B-GAL4 construct18'i ikincil hücreleri (SC) etiketlemek için kullanıyoruz, ancak ana hücreleri (MC) GFP ile etiketlemek için(Şekil 2A). B...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Hayali diskler gibi Drosophila dokusundan hücre ayrıştırma yöntemleri zaten23açıklanmıştır . Bu prosedürleri aksesuar bezleri üzerinde kullanma girişimlerimiz başarısız oldu ve bu yeni protokolü geliştirmemiz için bizi cesaretlendirdi. Proteaz sindirim ve mekanik triturasyon biz prosedürün başarısı için sorun shot kritik adımlar vardı, ve böylece deneyciler tatmin edici sonuçlar elde etmek için yardımcı olmak için bölüm 2-5 birçok notlar yerleştirilir. Dissosilasyonun başarılı olabilmesi ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların hiçbir açıklaması yok.

Teşekkürler

Karch laboratuvarı üyelerine, iGE3 genomik plaka formuna, Cenevre Üniversitesi'nin Flow Cytometry çekirdek tesisine ve FACS protokolünü belirleyen Dr. Jean-Pierre Aubry-Lachainaye'ye minnettarız. Luca Stickley'e IGV'deki okumaları görselleştirmedeki yardımları için teşekkür ederiz. Biz rakamlar yeniden kullanmak için nazik izni için kendimize teşekkür ederiz, ve editörler bize yazma ile yaratıcı olmak isteyen için.

Bu araştırma Cenevre Eyaleti (CI, RKM, FK), İsviçre Ulusal Araştırma Fonu (www.snf.ch) (FK ve RKM) ve Claraz Vakfı'nın (FK) bağışları tarafından finanse edilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
24 oyuklu Doku Kültürü plakasıVWR734-2325
Diseksiyon
Plastik mikrotüpler 1.5 mLEppendorf
FACS,Beckman, Coulter,MoFlo, Strios
, İnce diseksiyon, forseps
Fetal sığır serumuGibco, 10270-106kullanımdan önce ısıyla etkisiz hale getirilir
Diseksiyon
, Buz kovası
ImProm-II, Ters Transkripsiyon SistemiPromegaA3800
MasterPure RNA Saflaştırma KitiEpicentreMCR85102
Nextera XT kitiilluminahttps://emea.illumina.com/products/by-type/sequencing-kits/library-prep-kits/nextera-xt-dna.html
P1000Gilson
P20Gilson
P200Gilson
Papain50U/mL stok
PBSev yapımı
Penisilin-StreptomisinGibco15070-063
PolydT primerler
Rastgele heksamer primerleri
RNA 6000 Pico kitiAgilent
Schneider' s Drosophila ortaGibco21720-001
SMARTer cDNA sentez kitiTakarahttps://www.takarabio.com/products/cdna-synthesis/cdna-synthesis-kits/smarter-cdna-synthesis-kits
SYBR select CFX için ana karışımuygulandı biyosistemler4472942
Thermo ShakerHangzhou Allsheng enstrümanlarıMS-100
Tipone 1250 & mu; L dereceli uçStarlabS1161-1820
Tipone 200 μ L eğimli uçStarlabS1161-1800
TrypLE Express EnzimGibco12604013
Vorteks
için binoküler mikroskop GFP Bunsen Draq7 için ışık kaynaklı dürbün 0.3 mM BioStatus DR71000 , , , , için cam tabaklar, , ,

Kaynaklar

  1. Avila, F. W., Sirot, L. K., LaFlamme, B. A., Rubinstein, C. D., Wolfner, M. F. Insect seminal fluid proteins: identification and function. Annual Review of Entomology. 56, 21-40 (2011).
  2. Carmel, I., Tram, U., Heifetz, Y. Mating induces developmental changes in the insect female reproductive tract. Current Opinion in Insect Science. 13, 106-113 (2016).
  3. League, G. P., Baxter, L. L., Wolfner, M. F., Harrington, L. C. Male accessory gland molecules inhibit harmonic convergence in the mosquito Aedes aegypti. Current Biology. 29 (6), R196-R197 (2019).
  4. Degner, E. C., et al. Proteins, Transcripts, and Genetic Architecture of Seminal Fluid and Sperm in the Mosquito Aedes aegypti. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (Suppl 1), S6-S22 (2019).
  5. Wedell, N. Female receptivity in butterflies and moths. Journal of Experimental Biology. 208 (Pt 18), 3433-3440 (2005).
  6. Laflamme, B. A., Wolfner, M. F. Identification and function of proteolysis regulators in seminal fluid. Molecular Reproduction and Development. 80 (2), 80-101 (2013).
  7. Wilson, C., Leiblich, A., Goberdhan, D. C., Hamdy, F. The Drosophila Accessory Gland as a Model for Prostate Cancer and Other Pathologies. Current Topics in Developmental Biology. 121, 339-375 (2017).
  8. Kubli, E., Bopp, D. Sexual behavior: how Sex Peptide flips the postmating switch of female flies. Current Biology. 22 (13), R520-R522 (2012).
  9. Kubli, E. Sex-peptides: seminal peptides of the Drosophila male. Cellular and Molecular Life Sciences. 60 (8), 1689-1704 (2003).
  10. Liu, H., Kubli, E. Sex-peptide is the molecular basis of the sperm effect in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (17), 9929-9933 (2003).
  11. Ram, K. R., Wolfner, M. F. Sustained post-mating response in Drosophila melanogaster requires multiple seminal fluid proteins. PLoS Genetics. 3 (12), e238(2007).
  12. Sitnik, J. L., Gligorov, D., Maeda, R. K., Karch, F., Wolfner, M. F. The Female Post-Mating Response Requires Genes Expressed in the Secondary Cells of the Male Accessory Gland in Drosophila melanogaster. Genetics. 202 (3), 1029-1041 (2016).
  13. Avila, F. W., Wolfner, M. F. Acp36DE is required for uterine conformational changes in mated Drosophila females. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15796-15800 (2009).
  14. Adams, E. M., Wolfner, M. F. Seminal proteins but not sperm induce morphological changes in the Drosophila melanogaster female reproductive tract during sperm storage. Journal of Insect Physiology. 53 (4), 319-331 (2007).
  15. Singh, A., et al. Long-term interaction between Drosophila sperm and sex peptide is mediated by other seminal proteins that bind only transiently to sperm. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 102, 43-51 (2018).
  16. Avila, F. W., Wolfner, M. F. Cleavage of the Drosophila seminal protein Acp36DE in mated females enhances its sperm storage activity. Journal of Insect Physiology. 101, 66-72 (2017).
  17. Chapman, T., Davies, S. J. Functions and analysis of the seminal fluid proteins of male Drosophila melanogaster fruit flies. Peptides. 25 (9), 1477-1490 (2004).
  18. Gligorov, D., Sitnik, J. L., Maeda, R. K., Wolfner, M. F., Karch, F. A novel function for the Hox gene Abd-B in the male accessory gland regulates the long-term female post-mating response in Drosophila. PLoS Genetics. 9 (3), e1003395(2013).
  19. Minami, R., et al. The homeodomain protein defective proventriculus is essential for male accessory gland development to enhance fecundity in Drosophila. PLoS One. 7 (3), e32302(2012).
  20. Maeda, R. K., et al. The lncRNA male-specific abdominal plays a critical role in Drosophila accessory gland development and male fertility. PLoS Genetics. 14 (7), e1007519(2018).
  21. Prince, E., et al. Rab-mediated trafficking in the secondary cells of Drosophila male accessory glands and its role in fecundity. Traffic. 20 (2), 137-151 (2019).
  22. Robinson, M. D., Oshlack, A. A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data. Genome Biology. 11 (3), R25(2010).
  23. Khan, S. J., Abidi, S. N., Tian, Y., Skinner, A., Smith-Bolton, R. K. A rapid, gentle and scalable method for dissociation and fluorescent sorting of imaginal disc cells for mRNA sequencing. Fly (Austin). 10 (2), 73-80 (2016).
  24. Corrigan, L., et al. BMP-regulated exosomes from Drosophila male reproductive glands reprogram female behavior. Journal of Cell Biology. 206 (5), 671-688 (2014).
  25. Leiblich, A., et al. Bone morphogenetic protein- and mating-dependent secretory cell growth and migration in the Drosophila accessory gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (47), 19292-19297 (2012).
  26. Kubo, A., et al. Nutrient conditions sensed by the reproductive organ during development optimize male fecundity in Drosophila. Genes to Cells. 23 (7), 557-567 (2018).
  27. Immarigeon, C., Karch, F., Maeda, R. K. FACS-based isolation and RNA extraction of Secondary Cells from the Drosophila male Accessory Gland. bioRxiv. , 630335(2019).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Drosophila Aksesuar BeziFACS S ralamasRNA EkstraksiyonuGFP Raporlay cDoku SindirimiH cre DisosyasyonuFloresan MikroskopisiRT qPCRRNA Dizileme
Drosophila Erkek Aksesuar Bezlerinin Sekonder Hücrelerinden RNA'yı Izole etmek için FACS tabanlı Protokol
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.