Kollajen Kaynaklı Artrit Modelinde Doku İltihabının Moleküler Yollarını Değerlendirmek Için Fare Patilerinin İşlenmesi için Kriyo-pulverizasyon Protokolü

Summary

Dokulardan çıkarılan RNA veya proteinin verimini ve kalitesini artırmak ve inflamatuar profillerle ilişkili moleküler profillerin analizini sağlamak için sıvı nitrojen dondurucu değirmeni kullanarak murine patilerini işlemek için kriyojenik pulverizasyon yöntemi geliştirilmiştir. Yanıt.

Abstract

Lokal dokularda moleküler değişikliklerin profilini çıkarmak, terapötik adayların in vivo eylem mekanizmasını anlamak için çok önemlidir. Artrit araştırma alanında, birçok çalışma kemik, kıkırdak, kas, stromal hücreleri ve bağışıklık hücrelerinin karmaşık bir karışımından oluşan iltihaplı eklemler üzerinde durulmuştur. Burada, iltihaplı fare patilerini kriyojenik kontrollü bir ortamda homojen toz haline getirmek için güvenilir ve sağlam bir mekanik yöntem oluşturduk. Proteomik ve transkripsiyonel uç noktaları ve lokal dokudaki ilgili hastalık yollarının moleküler karakterizasyonu için protein ve RNA lysates işlendi.

Introduction

Romatoid artrit (RA) eklemlerde kalıcı simetrik sinovit ve deri, kalp, akciğer ve göz gibi organların ekstra eklem tutulumu ile kronik sistemik inflamatuar bir hastalıktır¹. Bağışıklık yanıtının sistemik bulguları insan hastalarda belirgin olmakla birlikte, RA patolojisinin özelliklerinden biri sinovyal dokuda immün hücrelerin infiltrasyonu ve sinovyal fibroblast hücrelerinin çoğalmasıdır².

Insan RA benzer, fare kollajen indüklenen artrit (CIA) modeli sinovyal dokular ve sistemik bölmelerde aktif bağışıklık yanıtları ile güçlü doku iltihabı ortaya çıkarır. Cia modeline farklı fare suşlarının duyarlılığı Majör Histokompatibilite Kompleksi (MHC) haplotip ve antijen spesifik T hücresi ve B hücre etkileşimleri^3,4bağlantılar . Buna ek olarak, otoantikor üretimi, immün kompleks birikimi, miyeloid hücre aktivasyonu, poliartiküler bulgular ve sinovyal immün infiltrasyon ile pannus oluşumu da dahil olmak üzere insan RA birçok patojenik yollar da bu modelde belirgindir ^5,6. Müfettişler anti-inflamatuar sitokin tedavileri etkilerini araştırmak için bu köklü CIA modeli istihdam var⁷. Anti-TNFα ve anti-IL-6 gibi otoimmün veya inflamatuar hastalıklar için onaylanmış birçok biyolojik, CIA modeli nde etkili olduğu bulunmuştur^8,9.

Sinovyal dokuda bağışıklık sisteminin etkileşimlerinin profilini ra patogenezi ile ilişkili moleküler mekanizmaları açıklamak için çok önemlidir. İnsan klinik ortamında, yaygın bir uygulama ultrason görüntüleme gözetiminde iğne sinovyal biyopsi yapmaktır. Preklinik ortamlarda, murine eklemlerin küçük mimarisi imkansız olmasa bile biyopsi prosedürleriçok daha zor hale getirir. Son zamanlarda, farklı uç noktaları etkilemek ve bir kombinatoryal yaklaşım¹⁰hastalığı çözmek için ilaçların kombinasyonları değerlendirmek için murine CIA modelinin kullanımını gösterdi. Bir kriyojenik dondurucu değirmen tabanlı pulverizasyon yöntemi homojen ince tozlar içine iltihaplı murine pençeleri işlemek için kullanılan ve RNA ve proteinleri ayıklamak için aşağı süreçleri kuruldu. Bu yöntem, RNA ve proteini enzimatik ve kimyasal degratif proseslerden korur ve tek bir homojenize örnek kaynağına birden fazla analitik yöntem uygulamamızı sağlar.

Protocol

Tüm hayvan deneyleri Janssen Ar-Ge Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) politikaları doğrultusunda yapılmıştır.

1. Kriyojenik Dondurucu Değirmen bazlı Pulverizasyon Yöntemi

1. CIA çalışmasının sona ermesiyle, %1.5 isofluran ile kurban fareleri ve ardından servikal çıkış lar devam eder.
2. Doku işleme gününde, en az 10 dakika boyunca kuru buz üzerinde tüm aletleri (spatulalar, öğütme şişeleri, vb.) önceden soğutun.
3. Şekil 1A'datasvir edildiği gibi kürk hattında bir makas ile kesilmiş arka pençeleri .
4. Her pençeyi bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın, sıvı nitrojende hemen dondurun ve dondurulmuş pençeleri -80 °C'de saklayın. Örnekleri bir haftadan fazla dondurulmayın.
5. Dondurucu değirmenini Şekil 1B'de gösterildiği gibi sıvı nitrojenle doldurun ve en az 10 dakika boyunca dengelesin.
6. İşlenmemiş numuneyi kuru buzda saklayın ve donma-çözülme döngülerinden kaçının.
7. Bir arka pençeyi, bir alt çelik fiş ile önceden soğutulmuş büyük polikarbonat taşlama şişesine aktarın, önceden soğutulmuş çelik darbeciyi takın ve polikarbonat taşlama şişesini önceden soğutulmuş üst çelik fiş ile kapatın(Şekil 1C).
8. Numunelerle birlikte büyük polikarbonat taşlama şişelerini önceden sıvı dolu dondurucu değirmenine aktarın ve kapağı enstrümanın önünde bulunan kauçuk tokayla kapatın.
9. Numuneler sıvı nitrojende 1 dakika soğumaya bırakın.
10. Dondurucu değirmenini saniyede 10 döngü ile 1 dakikalık programa ayarlayın ve başlat düğmesine basın. Dondurucu değirmeninin döngüsünü tamamlamasını bekleyin.
    NOT: Makine, çelik darbeci ileri geri hareket ettikçe bir davul sesi çıkarır. İşitme kaybını önlemek için kulak tıkacı kullanın.
11. Dondurucu değirmeninin kapağını açın, büyük polikarbonat öğütme şişesini çıkarve Şekil 1D'detasvir edildiği gibi bir çıkarıcıya yerleştirin. Çelik fiş polikarbonat tüpten kayana kadar siyah tutamak üzerine aşağı doğru basınç yerleştirerek üst çelik fişi çıkarın.
12. Açılan büyük polikarbonat öğütme şişesini kuru buzüzerine aktarın. Önceden soğutulmuş çalgılarla çelik darbeyi çıkarın.
13. Dondurulmuş tozu önceden soğutulmuş 50 mL konik tüpe aktarın.
14. Ağırlık 30-50 mg dondurulmuş toz bir katranlı dondurulmuş içine mg 1.5 RNa ekstraksiyon ve protein ekstraksiyonu için dondurulmuş toz 100-200 mg.
    NOT: Dondurulmuş toz Şekil 1E'debetimlenen beyaz veya açık pembe ince kum gibi görünmelidir.
15. Toz haline getirilmiş numuneleri -80 °C'de saklayın ve 24 saat içinde RNA ve protein izolasyonlarına ilerleyin.

2. RNA Çıkarma

1. RLT tamponunun 1 mL'si başına 10 μL β-mercaptoetanol (β-ME) ekleyin.
2. Doku 23.3 mL/mg oranına karşılık gelen RLT Tampon hacmini hesaplayın ve dondurulmuş toz ile tüpe β-ME ile uygun RLT Tampon hacmini ekleyin. Bu oran deneysel olarak fare pençeleri için ideal olarak belirlenmiştir.
3. 10 s için 3.000 RPM de örnek girdap.
4. 1 mL pipettor ile 10 kat daha güçlü bir şekilde yukarı ve aşağı boru lar oluşturarak iyice karıştırın.
5. 20 s için 3.000 RPM tekrar örnek girdap.
6. Tüpü 13.000 x g'de 2 dk santrifüj edin.
7. Süpernatantların 700 μL'sini yeni bir tüpe aktarın ve %70 etanol 700°L ekleyin.
   NOT: Eğer <700 μL tüpteyse, %70 etanol eşdeğer hacim ekleyerek devam etmek kabul edilebilir.
8. Numunenin 700 μL'sini bir RNA arıtma sütununa yükleyin.
9. Tüpü ≥10.000 x g'de 30 s için santrifüj edin.
10. Akış tan atın ve numunenin kalan kısmını RNeasy sütununa yükleyin.
11. Tüpü ≥10.000 x g'de 30 s için santrifüj edin.
12. 30 s için ≥10.000 x g santrifüj ile 700 μL RW1 tampon ekleyerek akışı atın ve yıkayın. DNASE sindirimi seçeneği gerçekleştirilmesi durumunda, DNASE tedavisinden önce 350 μL RW1 eklenir.  DNASE tedavisinden sonra 350 μL rw1 ilave edilir.
13. İsteğe bağlı) Üreticinin talimatlarına uyarak bir DNase sindirim adımı gerçekleştirin.
14. Tüpü 500 μL RPE tamponu ekleyerek iki kez yıkayın ve ardından 30 s. Her seferinde akışı atın ≥10.000 x g'de santrifüj edin.
15. 2 dk için ≥10.000 x g'de kolona santrifüj ile kurutun.
16. Elute RNA 2 dk. için ≥10.000 x g santrifüjlü 50 μL su ekleyerek akışı toplayın ve yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın.
17. Daha fazla analiz den önce araştırmacının tercih edilen yöntemini kullanarak RNA miktarını belirleyin ve -80 °C'de saklayın.

3. Protein Ekstraksiyonu

1. Hücre kültürü sınıf su kullanarak 1x hücre lisis stok çözeltisi 10x hücre lisis stok çözeltisi seyreltin.
2. 100x proteaz inhibitör stok yapmak için 1 mL su ile Proteaz Inhibitör Kokteyl Seti I yeniden.
3. 1x son stok çözeltisi yapmak için 9,9 mL 1x Hücre lisisine 100 μL proteaz inhibitörü ekleyin.
4. Mg doku tozu başına 4 μL buz gibi 1x Hücreli Lysis Tampon ekleyin (örneğin, 800 μL lysis tampon 200 mg doku tozu).
5. Boruya bir adet 5 mm paslanmaz çelik boncuk ekleyin.
6. Girdap tüp 3.000 RPM 60 s. ıslak buz için tüp aktarın ve bir sonraki örnek devam.
7. Tüm numune tüplerini bir kutuya yerleştirin ve santrifüj kutusunu 1.000 RPM,4 °C'de bir rockçının üzerinde 1 saat boyunca sallayın.
   NOT: Araştırmacılar kutuyu dikey olarak yerleştirmenin boncukla daha iyi karışmayı kolaylaştırabileceğini görebilirler.
8. Tüpleri 10.000 x g ve 4 °C'de 15 dakika santrifüj edin.
9. Supernatants taze bir tüp içine aktarın ve üst yağ tabakası kaçının.
10. Toplam protein konsantrasyonu belirleyin. 10-30 kat protein lisatseyreltmeleri BCA testi için idealdir.
11. Numuneyi 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe yerleştirin ve daha fazla analiz den önce -80 °C'de saklayın.

Results

Burada, Şekil 2A'daCIA farelerinin ön pençelerinden çıkarılan RNA'nın temsili bir jel görüntü görselleştirmesini gösteriyoruz. 28S rRNA ve 18S rRNA bandı tüm numunelerin yeterli miktarda sağlam RNA'ya sahip olduğunu göstermektedir. Daha sonra Şekil 2B'deprotein BCA analizine dayalı toplam protein konsantrasyonlarının temsili bir dağılım çizimi gösteriş. Çeşitli tedaviler altında naif fareler, CIA...

Discussion

Sinovyal dokularda moleküler yolları değerlendirmek için güçlü bir bilimsel mantık olmasına rağmen, murine CIA modelinin immün profilleme birçok rapor periferik kan üzerinde duruldu, iltihaplı pençeleri protein ve RNA analiz verileri oldukça sınırlıdır iken. Bu önyargı için birkaç olası nedeni vardır: murine ayak bileği eklemleri ~ 2 cm daha büyüktür; etkilenen alanlar genellikle doku öğütücüler, havaneli ve harç, silika boncuk bozulması, triturasyon veya enzimatik sindirim gibi geleneksel yöntemler kullanılarak homojeni...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 mm paslanmaz çelik boncuk	Qiagen	69989
beta-merkaptoetanol	Sigma	M6250	RNASE enzimlerini inhibe eden numune azaltıcı ajan
Biyoanalizör Kiti	Agilent	5067-1511	RNA yeterlilik kiti
b-merkaptoetanol	Sigma	M6250
Hücre Kültürü Sınıfı Su	Corning	25-055-CI	Su
Hücresi lizis stok çözeltisi	Hücre Sinyalizasyonu	9803
Eppendorf Tüpü	Eppendorf	22363204	Mikrofüj tüpleri
Eppendorf tüp santrifüj kutusu	Nalgene	5055	Eppendorf tüplerini yatay boru düzeninde tutmak için kutu
Everlast 247 Değişken Hızlı Rocker	Benchmark Scientific	BR5000
Dondurucu Değirmen	Spex Sample Prep	6875	Pençeleri toz haline getirmek için Dondurucu/Değirmen Pençeleri toz haline getirmek için
Öğütme Flakonu	Spex Numune Hazırlama	6801	Pençeleri toz haline getirmek için polikarbonat şişe
Pierce BCA kiti	Pierce	23225	Toplam Protein Miktar Tayini Kiti
Proteaz İnhibitörü Kokteyl seti 1	Calbiochem	539131	Proteaz İnhibitörleri
Protein BCA Kiti	Pierce	23225
Quantigene Kiti	Thermofisher	QP1013	bDNA analiz Kiti
Soğutmalı mikrosantrifüj	Eppendorf	5417R	Santrifüj RLT
Tamponu	Qiagen	79216	RNA ekstraksiyon tamponu
RNeasy mini kiti	Qiagen	74104	, RNeasy sütunu, RLT Tamponu ve RW1 Tamponu dahil
Shaker	Benchmark Scientific	BR5000	Rocker/Shaker
Spatula	VWR	10806-412	Toz transferi için spatula
Paslanmaz Çelik Boncuk	Qiagen	69989	Protein ekstraksiyonu sırasında karıştırmak için boncuk
Tüp Çıkarıcı	Spex Numune Hazırlama	6884	Öğütme şişesinin üst kısmını çıkarmak için çıkarıcı
Vortexer	VWR	10153-838	Numune karıştırma