Kan-beyin bariyerbütünlüğü sinir sistemi fonksiyonu için çok önemlidir. Drosophila melanogasterolarak, kan-beyin bariyeri geç embriyogenez sırasında glial hücreler tarafından oluşur. Bu protokol, D. melanogaster embriyolarında ve üçüncü instar larvalarında kan-beyin bariyeri oluşumu ve bakımı için taht yöntemlerini açıklamaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Drosophila melanogaster Kan-beyin Bariyer Bütünlüğü için Tahse
Bu makalede
Özet
Özet
Uygun sinir sistemi gelişimi kan-beyin bariyerinin oluşumunu içerir, sıkı sinir sistemine erişimi düzenleyen ve toksinler ve patojenlerden nöral doku korur difüzyon bariyeri. Bu bariyerin oluşumundaki bozukluklar nöropatilerle ilişkilendirilmiştir ve bu bariyerin bozulması birçok nörodejeneratif hastalıkta gözlenmiştir. Bu nedenle, potansiyel terapötik hedefleri belirlemek için kan-beyin bariyerinin oluşumunu ve bakımını düzenleyen genlerin belirlenmesi önemlidir. Bu genlerin nöral gelişimde tam rollerini anlamak için, değişmiş gen ekspresyonunun kan-beyin bariyerinin bütünlüğü üzerindeki etkilerini tetkik etmek gerekir. Kan-beyin bariyerinin kurulmasında işlev moleküllerin çoğu ökaryotik türler arasında korunmuş olduğu bulunmuştur, meyve sinek de dahil olmak üzere, Drosophila melanogaster. Meyve sinekleri sinir sistemi gelişimi ve işlevini düzenleyen moleküler mekanizmaları incelemek için mükemmel bir model sistemi olduğu kanıtlanmıştır. Bu protokol, D. melanogaster gelişiminin embriyonik ve larva evrelerinde kan-beyin bariyerinin bütünlüğünü test etmek için adım adım bir prosedürü tanımlar.
Giriş
Gelişim sırasında hücre-hücre iletişimi ve etkileşimleri doku ve organ yapısı nın ve fonksiyonunun kurulması açısından kritik öneme sahiptir. Bazı durumlarda, bu hücre-hücre etkileşimleri uygun organ fonksiyonu sağlamak için çevreden organları mühür. Bu kan-beyin bariyeri (BBB) tarafından izole edilir sinir sistemi için durumdur. İnsanlarda BBB disfonksiyonu epilepsi de dahil olmak üzere nörolojik bozukluklar ile bağlantılı olmuştur, ve bariyerin arıza multipl skleroz ve amiyotrofik lateral skleroz dahil nörodejeneratif hastalıklarda gözlenmiştir1. Memelilerde, BBB endotel hücreleri arasında sıkı kavşaklar oluşur2,<....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Örneklerin Toplanması
- Embriyo koleksiyonu
- Her embriyo toplama kafesinde, koleksiyonlar için 20−25 erkek ile en az 50 bakire dişi kullanın. Bu sinekleri, toplamaya başlamadan önce 1−2 gün boyunca mısır unu-agar gıdası(Malzeme Tablosu)ile bir şişede kuluçkaya yatırın23.
NOT: Daha fazla sinek kullanılabilir, ancak kadın-erkek oranı 2:1 tutulmalıdır. - Önceden ısıtılmış elma suyu agar tabakları(Tablo 1) 25 °C gecede.
NOT: Bu embriyoların uygun evreleme için gereklidir. Plakalar hızlı bir şekilde kuruyorsa, odanın nemini artırmak....
- Her embriyo toplama kafesinde, koleksiyonlar için 20−25 erkek ile en az 50 bakire dişi kullanın. Bu sinekleri, toplamaya başlamadan önce 1−2 gün boyunca mısır unu-agar gıdası(Malzeme Tablosu)ile bir şişede kuluçkaya yatırın23.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Burada açıklanan yöntemler, D. melanogaster embriyoları ve larvalarında CNS boyunca BBB'nin bütünlüğünün görselleştirilmesine olanak sağlar (Şekil 1). Geç embriyogenezde BBB oluşumunun tamamlanmasından sonra, BBB fonksiyonları beyin ve VNC5büyük molekülleri dışlamak için . Bu protokol BBB oluşumunu test etmek için bu işlevden yararlanır. Yabani tip (Oregon R) geç evre 17 (20−21 saat eski) embriyolara sulforhodamine 101 asit klorür floresan boyaya konjuge 10 k.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu protokol, Geç embriyonik ve D. melanogaster gelişiminin üçüncü instar larva aşamalarında BBB bütünlüğü için test etmek için gereken adımların kapsamlı bir açıklamasını sağlar. Benzer yaklaşımlar başka bir yerde geliştirme sırasında BBB bütünlüğünü titretmek için tarif edilmiştir, yanı sıra yetişkin aşamalarında5,7,29,30. Ancak, malzeme ve yöntem bölümlerindeki prosedürlerin açıklama.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
Yazarlar enjeksiyon için ekipman kullanımı için Dr F. Bryan Pickett ve Dr Rodney Dale teşekkür ederiz. Bu çalışma Loyola University Chicago'dan M.D., D.T., ve J.J.'e kadar araştırma fonu ile finanse edilmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 10 kDa sülforhodamin 101 asit klorür (Texas Red) Dextran | ThermoFisher Scientific | D1863 | Dekstran, otoklavlanmış ddH2O içinde 25 mg / mL konsantrasyona seyreltilmelidir. |
| 20 μ L Jel Yüklemeli Pipet Uçları | Eppendorf | 22351656 | |
| %100 Etanol (200 geçirmez) | Pharmco-Aaper | 11000200 | |
| Aktif Kuru Maya Red | Star | ||
| Agar | Fisher Scientific | BP1423 | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Hava Kompresörü | DeWalt | D55140 | |
| Elma Suyu | Mott'un Doğal Elma Suyu | ||
| Çamaşır | Suyu Ev Tipi Çamaşır Suyu | %1-5 Hipoklorit | |
| Borosilikat Cam Kılcal | Damarlar Dünyası Hassas Aletler | 1B100F-4 | |
| Şişe Tapaları | Fisher Scientific | AS-277 | |
| Hücre Süzgeçleri | BD Falcon | 352350 | |
| Konfokal Mikroskop | Olympus | FV1000 | 20x objektif kullanılarak görüntülenen örnekler (UPlanSApo 20x/ 0.75) |
| Pamuk Uçlu Aplikatör | Puritan | 19-062614 | |
| Çift Taraflı Bant 1/2" | Scotch | ||
| Dumont Cımbız; Desen #5; .05 x .01 mm Tip | Roboz | RS-5015 | |
| Fly Gıda Şişeleri | Fisher Scientific | AS-355 | |
| Fly Gıda Şişeleri | Fisher Scientific | AS-515 | |
| Ayak Pedalı | Treadlite II | T-91-S | |
| Jel Teker | Bio-Rad | 1704422 | |
| Jel Tepsisi | Bio-Rad | 1704436 | |
| Cam Pipet | VWR | 14673-010 | |
| Gliserol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Toz şeker | Marketten satın alındı. | ||
| Halokarbon Yağ | Laboratuvarı Scientific, Inc. | FLY-7000 | |
| Işık Kaynağı | Schott | Ace I | |
| Manipülatör Standı Dünya | Hassas Aletler | M10 | |
| Mikromanipülatör | Dünyası Hassas Aletler | KITE-R | |
| Mikropipet Çektirme | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| İğne Tutucu | Dünya Hassas Aletler | MPH310 | |
| Gece Filtre Setleri Elektron | Mikroskobu Bilimi | SFA-LFS-CY | YFP |
| Nightsea Tam Adaptör Sistemi, Kraliyet Mavisi Renk Işık Kafası | Elektron Mikroskobu Bilimi | SFA-RB'nin | görselleştirilmesi için GFP |
| Boya Fırçası | Simply Simmons | Keski Blender #6'nın | |
| Pipetleyici | Fisher Scientific | 13-683C | |
| Pnömatik Pompa | Dünyası Hassas Aletler | PV830 | Bu aynı zamanda mikroenjektör veya basınç regülatörü olarak da adlandırılır. Çalışmamızda kullanılan model artık mevcut olmadığından, bu bir alternatiftir. |
| Potasyum Klorür | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Potasyum Fosfat Dibazik | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Küçük Embriyo Toplama Kafesleri | Genesee Scientific | 59-100 | |
| Sodyum Klorür | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodyum Fosfat Dibazik Susuz | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Çelik Taban Plakası Dünya | Hassas Aletler | 5052 | |
| Stereomikroskop | Carl Zeiss | Stemi 2000 | Doku diseksiyonu için kullanılır. |
| İletilen ışık kaynağı ile stereomikroskop | Baytronix | Enjeksiyon için kullanılır. | |
| Tegosept (p-hidroksibenzoik asit, metil ester) | Genesee Scientific | 20-258 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | Noniyonik yüzey aktif madde |
| Flakon Tıkaçları | Fisher Scientific | AS-273 |
Kaynaklar
- Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nature Medicine. 19 (12), 1584-1596 (2013).
- Brightman, M. W., Reese, T. S. Junctions between intimately apposed cell membranes in the vertebrate br....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
