Method Article

Metaorganizma Araştırma ve Koruma için Biyoremediasyon ve Probiyotikler Gelişimi için Mikrobiyal Suşların Prospektileri

DOI:

10.3791/60238

⸱

October 31st, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1LEMM, Laboratory of Molecular Microbial Ecology, Institute of Microbiology Paulo de Góes, Federal University of Rio de Janeiro (UFRJ), 2Genome Center, University of California, Davis, 3IMAM-AquaRio - Rio de Janeiro Aquarium Research Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kirlilik tüm biyomları etkiler. Deniz ortamları özellikle, özellikle mercan resifleri, dünya üzerindeki en hassas ekosistemler biri etkilenmiştir. Biyoremediasyon, organizmaların kirleticileri bozabilme kapasitesidir. Burada, mercanlar için biyoremediasyon yeteneği ve potansiyel probiyotik özellikleri sunan mikropları izole etmek ve test etmek için metodolojileri tanımlıyoruz.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kirlilik tüm biyomları etkiler. Deniz ortamları özellikle, özellikle mercan resifleri, dünya üzerindeki en hassas ekosistemler biri etkilenmiştir. Küresel olarak, 4,5 milyar insan ekonomik olarak denize bağımlıdır ve geçim kaynaklarının çoğu mercan resifleri tarafından sağlanır. Mercanlar çok önemlidir ve bu nedenle soylarının tükenmesi felaket sonuçlara yol açar. Biyoremediasyon da dahil olmak üzere, deniz kirleticileri ve yerel kontaminasyonu düzeltmek için çeşitli olası çözümler vardır. Biyoremediasyon, organizmaların kirleticileri bozabilme kapasitesidir. Bu yaklaşım, sürdürülebilirlik, nispeten düşük maliyet ve farklı ekosistemlerde uygulanabilmesi gibi çeşitli avantajlar sunarak çevreye en az etkiye neden olmaktadır. Ekstra bir avantaj olarak, endojen mikrobiyomların manipülasyon, mercanlar için putatif yararlı mikroorganizmalar da dahil olmak üzere (pBMCs), deniz hayvanları için probiyotik etkileri olabilir. Bu bağlamda, biyoremediasyon ve pBMC aşılama kombine iki yaklaşımın kullanımı, umut verici olabilir. Bu strateji, mercanlar ve diğer metaorganizmalar için zararlı olabilecek belirli kirleticilerin bozulmasını teşvik ederken, aynı zamanda kirlilik ve diğer tehditlerle başa çıkmak için ev sahibi direncini ve dayanıklılığını da artıracak. Sentetik östrojen 17a-ethinylestradiol (EE2) ve ham petrol: Bu yöntem iki kirletici leri bozacak pBMCs seçimi üzerinde duruluyor. Her ikisinin de mercanlar ve insanlar da dahil olmak üzere deniz hayvanlarını olumsuz etkilediği bildirildi. Protokol, belirli kirleticimaddeleri bozabilecek bakterilerin nasıl izole edilip test edilebildiğini açıklar ve ardından bu ilişkili mikropların mercan konaklarına bazı putatif yararlı özelliklerinin nasıl tespit edilebildiğini açıklar. Burada açıklanan metodolojiler nispeten ucuz, gerçekleştirmek kolay ve son derece uyarlanabilir. EE2 ve yağ yerine hemen hemen her türlü çözünür hedef bileşiği kullanılabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kirlilik dünya çapında insan, hayvan ve bitki sağlığını etkileyen önemli bir konudur. Kirlilik doğal olabilir rağmen, volkanik küller gibi1,insan faaliyetleri en kirliliğin birincil nedenidir. Antropojenik faaliyetler toprak, su ve havayı kirletiyor ve bu da doğrudan veya dolaylı olarak yaklaşık 20 milyon erken insan ölümüne yol açıyor2 ve her yıl milyarlarca diğer yaşam formunu yok ediyor. Kirleticiler gezegenin en ücra bölgelerinde bile bulunur. Örneğin, ağır metaller ve kalıcı organik bileşikler derin deniz omurgasızlar ve kutup memelileri, sırasıyla tespit edilmiştir3,4.

Deniz ortamları özellikle kirliliktarafından etkilenmiştir. Uzun bir süre için, bu okyanus etkilenmemiş kalır vesu5 onun büyük hacmi nedeniyle malların sonsuz bir kaynak kaynağı olduğu kabul edildi. Bu nedenle, sanayi ve kurumların her türlü serbestçe yüzyıllar boyunca su organlarında atık serbest6,7. Plastik8,sentetik hormonlar9,pestisitler10,yağ11,besin12,ağır metaller3ve radyoaktif atık13 gibi her türlü çeşitli kirleticiler, etkileyen olarak bildirilmiştir okyanus ekosistemleri. Bu bağlamda mercan resifleri deniz ortamlarının en önemli ve hassas ekosistemleri arasında dır14. Resifler kıyı koruyucuları, besin bisiklet ve iklim kontrolü önemli roller oynayarak deniz türlerinin binlerce gelişimi için çok önemlidir. Resifler de diğerleri arasında balık, mal ve turizm sağlayarak ekonomiye katkıda15. Örneğin, 4.5 milyar insan büyük ölçüde mercan resifleri tarafından desteklenen ana besin kaynağı16olarak okyanus balığı bağlıdır.

Ne olursa olsun onların ekolojik, sosyal ve ekonomik önemi, mercan resifleri yok ediliyor17,18. Antropojenik faaliyetler öncelikle mercanların ölümünün üç ana nedenine katkıda bulunmaktan sorumludur: iklim değişikliği, aşırı avlanma ve su kirliliği19. Küresel ısınmanın azaltılması üzerinde çalışmak önemli olsa da, aynı zamanda kritik mercan düşüş20katkıda bulunabilir su kirliliği de dahil olmak üzere, yerel kontaminasyon, en aza indirmek üzerinde çalışmak önemlidir. Bu nedenle, mercanların yaşam süresini artırmak için stratejilergeliştirilmesi için acil bir ihtiyaç vardır, bu da onlara uyum sağlamaları ve hayatta kalmaları için fazladan zaman sağlayabilir.

Bu bağlamda kontaminasyonu en aza indirecek çözümler bulmak ve mercanların zindeliğini artırmak için stratejiler geliştirmek son derece önemlidir. Deniz kirleticilerini iyileştirici stratejiler son derece çeşitlidir ve fiziksel, kimyasal ve biyolojik yaklaşımlar olarak gruplandırılabilir. Fiziksel yaklaşımlar yararlıdır. Ancak, her zaman verimli değildir. Örneğin, plastik atıklar fiziksel olarak uzaklaştırılarak en aza indirilebilirken, suda çözünen bileşiklerin ortadan kaldırılması için başka metodolojilere ihtiyaç duyar. Bu tür bileşiklerin örnekleri ham petrol, petrol endüstrisi faaliyetleri ve dökülmeleri tarafından yayımlanan yanı sıra sentetik hormonlar gibi diğer mikro kirleticiler, normalde oral kontraseptif östrojenik bileşeni olarak kullanılan ve kanalizasyon mevcut21, 22. Kontaminasyonu azaltmak için kimyasal maddelerin kullanımı belirli bir sorunu çözebilir, ancak aynı zamanda ekstra bir kirlilik kaynağı olabilir. Bu durum, deniz ekosistemleri için petrol kontaminasyonundan daha zehirli olarak tanımlanan petrol kontaminasyonunu azaltmak için kimyasal dağıtıcılar için geçerlidir23. Bu nedenlerden dolayı, biyolojik yaklaşımlar diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında çeşitli avantajlar sunar. Biyoremediasyon canlı organizmaların kapasitesi, ya da metabolik ürünler, daha az toksik veya toksik olmayan formları içine kirletici dönüştürmek için24. Biyolojik yöntemler kullanarak temel avantajları sürdürülebilirlik, göreceli düşük maliyet, onlar ekolojik dostu olması, ve farklı ekosistemlerde uygulanabilir, çevreye en az veya daha az etkiye neden21, 25,26,27.

Ayrıca, bir ortamda mevcut mikrobiyal topluluk manipülasyon ekstra bir potansiyel avantaj sağlar. Ev sahipleri ile ilişkili ve sağlık için gerekli olan mikrobiyomlar vardır. Bu ilişkili simbiyotik mikrobiyomların ev sahibi homeostaz19korumak için gerekli olduğu bilinmektedir. Bu ilişkili mikroorganizmaların manipülasyon iyi bitki ve memeliler28gibi konaklar için araştırılmıştır28,29, ama mercan probiyotiklerin kullanımı hala yeni15. Mercanlar da barındırmak, etkileşim ve mikroorganizmaların büyük ve belirli popülasyonları bağlıdır19hayatta kalmak için . Mercanların sağlık ve dysbiosis bu mikrobiyal toplulukların rolü aktif çalışma altında, ama yine de tam olarak anlaşılmış olmaktanuzaktır 30. En popüler hipotezlerden biri mercan probiyotik hipotezi denir. Bu simbiyotik mikroorganizmalar ve en avantajlı mercan metaorganizmaların seçimi hakkında getiren çevre koşulları arasında dinamik bir ilişkinin varlığını göstermektedir31. Bu bilgilere dayanarak, anahtar potansiyel probiyotik mekanizmalar, yanı sıra izolasyon için stratejiler, manipülasyon, ve mercanlar için yararlı mikroorganizmaların teslim (BmCs) çeşitli amaçlar için, önerilmiştir32 ve test33. Bu potansiyel yararlı özellikleri sıcaklık artışına karşı direnç, reaktif oksijen türlerine karşı koruma (ROS), azot fiksasyonu, kirleticilere karşı direnç ve patojenlere karşı biyolojik kontrol, diğerleri arasında32.

Bu çalışma, deniz ortamlarında yaygın olarak bulunan iki kirletici maddeyi bozabilme yeteneğini sunan KBM'lerin ve serbest yaşayan mikroorganizmaların seçimine odaklanmaktadır: sentetik östrojen 17a-ethinylestradiol (EE2) ve ham petrol. Hormon aktif maddeler içeren kirleticiler genellikle su kütlelerinde mevcuttur34,35,36,37,38,39,40, 41,42. Bunlar arasında, sentetik östrojenik endokrin bozucu bileşikler (EDCs) hedef hücreler üzerinde östrojen lerin eylem taklit, hayvanlar üzerinde çeşitli etkilere neden, meme kanseri de dahil olmak üzere, kısırlık, ve hermafroditizm9. EE2 oral kontraseptif kullanımı nedeniyle insanlar tarafından atılır. Geleneksel atıksu arıtma tesisleri tarafından kanalizasyondan çıkarılmaz ve çok düşük konsantrasyonlarda bile olumsuz etkileri vardır (örn. ng/L veya μg/L)43,44,45. Az mercan fizyolojisi üzerinde östrojen etkileri hakkında bilinmektedir46,47. Bununla birlikte, süngerler, kabuklular ve yumuşakçalar gibi diğer deniz omurgasızlarında östrojenlerin, gametlerin geliştirilmesi ve/veya uyarılması, enzimatik ve protein eylemleri, embriyonik süreçlerde sorunlar, ve diğerleri48,49,50,51,52. EE2 kontaminasyonundan kaynaklanan olumsuz sonuçlar, deniz yaşamını etkilemeden bu bileşiği çevreden çıkarmak için sürdürülebilir yaklaşımlar geliştirme gereğini vurgulamaktadır.

Buna paralel olarak, petrol şu anda dünyanın tüketilen enerji kaynaklarının yaklaşık% 40 muhasebeile 53, kronik kontaminasyon ve petrol sızıntıları genellikle resif alanları11yakınında meydana. Petrol kirlenmesi deniz hayvanları, kuşlar, bitkiler ve insanlar54,55,56,57çeşitli türlerde olumsuz etkilere neden olduğu bildirilmiştir. Mercanlarda ağartma neden olur, larvaların termal strese karşı direncini azaltır58, mikrobiyal ilişkili toplulukları bozar21, ve doku nekrozu neden olur. Buna ek olarak, kimyasal dispersantlar, yaygın dökülmeleri düzeltmek için petrol şirketleri tarafından kullanılan bir petrol ıslah tekniği, petrol kendisi23daha mercanlar için daha zehirlidir. Mercanlardan izole edilen yararlı mikroorganizmalar, buna karşılık, konak sağlığı üzerinde önemli roller oynamaları ile bilinirler. Ancak, Bu potansiyel probiyotiklerin manipülasyon daha iyi amacıyla olası olumsuz yan etkileri ve metaorganizmanın uygunluğunu artırmak için taranabilir metabolik kapasiteleri araştırmak için araştırılmalıdır. Bu bağlamda, mercan patojenlerine karşı antimikrobiyal aktivite, oksidatif stresle mücadele de katalaz üretimi, üreyi bozabilme yeteneği (kireçlenme sürecinde önemli rolleri olabilir) ve genlerin varlığı gibi özellikler bu potansiyel yararlı özellikleri, diğerleri arasında, soruşturma nın odak noktası olmalıdır. Burada, biyoremediasyon ve probiyotikler birlikte kirliliğin etkilerini azaltmak ve mercan sağlığını geliştirmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Deniz türlerinin kalıcılığını artırmak için müdahale olarak kullanılabilecek yenilikçi yaklaşımların geliştirilmesi, daha sürdürülebilir ve sağlıklı bir gezegene doğru atılmış bir adımı temsil etmektedir.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Mikrobiyal izolasyon için su ve mercan toplama ve depolama

NOT: Örnekleme alanlarının koordinatlarını ve sıcaklığını almak esastır. Mümkünse, tuzluluk, pH, derinlik ve ışık yoğunluğu gibi meta veriler de ince ayarlı yetiştirme yaklaşımları ve verilerin gelecekteki yorumlanması bulma da yardımcı olabilir. Güvenilir sonuçlar için, numuneleri mümkün olan en az süre boyunca saklayın. Numuneler doğru sıcaklıkta tutulmaz ve/veya uzun süre saklanırsa su/mercan mikrobiyomları önemli ölçüde değişebilir. İzolasyon adımı toplama işleminden hemen sonra yapılmazsa, numunelerin işlenmesine kadar 4 °C'de tutulması çok önemlidir. Numuneler 4 °C'de bile ne kadar uzun süre saklanırsa, mikrobiyal topluluk o kadar değişir.

  1. Deniz suyunu örnekleyin ve saklayın.
    1. Her hedeflenen örnekleme alanından en az üç etekli olarak 500 mL su örneği toplayın. Tercihen vida kapaklı steril şişeler kullanın.
    2. Suyu topladıktan hemen sonra işliyorsanız, şişeleri kısa bir süre için RT'de tutun. Numune işleme daha sonra gerçekleşiyorsa, şişeleri 4 °C'de tutun.
  2. Örnek ve mercan saklayın.
    1. Su örneklerinin aynı örnekleme alanından mercan parçalarını kesmek için steril bir çift kaya çavarı kullanın. Kontaminasyonu önlemek için mercanlara sadece steril eldivenlerle dokunun.
    2. Deniz suyunun gevşek bağlanmış serbest yaşayan bakterilerinden kurtulmak için örneklenen mercan parçasını 20 mL steril tuzlu çözelti (distile suda %3 NaCl) veya yapay deniz suyu kullanarak durulayın.
    3. Forseps kullanarak, her mercan parçasını steril tuzlu çözelti içeren bir vida kapağı ile steril 250−500 mL konteyner içine yerleştirin.
    4. Laboratuvarda steril büşreler ve pliers kullanılarak, tartım ölçeğinde steril 100 mm x 20 mm Petri kapları kullanılarak 5 g mercan parçası tartılır.
    5. 5 g mercan örneğini steril bir harça aktarın ve steril bir havaneli kullanarak yerleştirin.
    6. Steril bir spatula kullanarak, serpiştirilen numuneyi 45 mL 3 NaCl steril çözeltisi ve 5 mm'lik 10−15 cam boncuk içeren steril kültür şişesine aktarın.
    7. Şişeleri numune alma alanının su sıcaklığında 16 saat boyunca sürekli ajitasyon (150 x g)altında tutun.
      NOT: Sığ su mercanları için optimum sıcaklık 24−28 °C arasında değişmektedir. Bu adım, mikroorganizmaları konak hücrelere bağlı olanlar veya doku ve iskelet içinde yaşayanlar gibi farklı mercan bölmelerinden ayıracaktır. Bu adımdan sonra mercan macerates depolanmamalıdır ve izolasyon adımı anında yapılmalıdır.

2. EE2-aşağılayıcı bakterilerin deniz suyundan ve/veya mercanlardan izole edilmesi

  1. Bakterileri seçin.
    NOT: 1.1.2 ve 1.2.7 adımlarından sonra, farklı mercan macerates'lerinden ayrılan deniz suyundaki mikroorganizmaların konsantrasyonu bilinmez ve değişken olacaktır. Agar ortam içeren Petri kaplarında tek tek mikrobiyal kolonilerin izolasyonunun garanti altına alınabilmesi için seri seyreltmelere ihtiyaç vardır.
    1. Mercan numuneleri için steril tuzlu çözeltide 10-9'a kadar, su numuneleri için 10-6'ya kadar seri seyreltme ler yapın. Pipet ucu atmadan önce yukarı ve aşağı 5x seyreltme. Bir sonraki seri seyreltme gerçekleştirmeden önce her seferinde 5 s için girdap örnekleri.
    2. % 3 NaCl lysogeny suyu (LB) agar orta içeren Petri kaplarda her seyreltme 100 μL pipet ve onları plaka.
      NOT: Alternatif bir ortam olarak deniz agar (MA) kullanın. Güvenilir sonuçlar için her seyreltmenin triplicates gereklidir.
    3. Plakaları hedef sıcaklıkta (örn. 26 °C) 1−3 gün kuluçkaya yatırın. Günde bir kez tabakları kontrol edin.
    4. Çizgi plaka tekniğini kullanarak yeni plakalarda farklı büyüme morfolojileri sunan kolonileri seçin ve izole edin. Plakalarda büyüyen saf koloniler için bu adımı gerektiği kadar tekrarlayın.
    5. İşlem eve 2.3.1 adımını anında devam etmezse, bölüm 2.2'de açıklandığı gibi 4 °C'de veya gliserolde saklanır.
  2. Gliserol stokları hazırlayın.
    NOT: Bu adım isteğe bağlıdır ve uzun süreli bakteri stokları depolama için kullanılabilir.
    1. Taze plakadan veya 4 °C'de saklanan tabaklardan tek kolonları seçin ve 2 mL steril LB ortamda bağımsız olarak aşılamak.
    2. Tüpleri gece boyunca (ON) 24−28 °C'de sürekli ajitasyon (150 x g)altına yerleştirin.
    3. Adım 2.2.2 ve steril gliserol 2 mL cryovials için% 20 son konsantrasyoniçin bakteri kültürlerinin 1 mL ekleyin.
    4. Cryovials 4 °C'de aveya bırakın.
    5. Gliserol bakteri stoklarını ihtiyacli olana kadar -80 °C'ye yerleştirin.
  3. EE2 bozunma yeteneği testini gerçekleştirin.
    1. İzole leri LB suyu veya alternatif ortamda etkinleştirin. Bunun için, 4 °C'de depolanan taze tabaklardan veya plakadan tek bir koloni seçin ve 2 mL steril LB ortamı nı aşılamak. Gliserol stoğu olması durumunda, ilk olarak LB agar plakaları üzerinde çizgi ve 24−28 °C ON'da tek kolonilerin büyümesi için kuluçkaya yatırın. LB orta sını içeren tüpü 24−28 °C AİLE'de sürekli ajitasyon (150 x g)altına yerleştirin.
    2. Bakteri üremesi sonrasında, 8.000 x g oda sıcaklığında 8 dk (RT) için santrifüj ederek hücreleri pelet. Supernatant atın ve yavaşça yukarı ve aşağı borulama, kalan LB suyu yıkamak için tuzlu su eşit hacimli (2 mL) hücreleri yeniden askıya.
    3. Karbon kaynağının iz bırakmamasını garanti etmek için 2.3.2 adımını iki kez tekrarlayın ve hücreleri eşit miktarda tuzlu çözeltide yeniden susulara geçin. Örneğin, 2 mL kültürle başlatılırsa, 2 mL tuzlu çözeltinin son hacmindeki hücreleri yeniden askıya alın.
    4. Tek karbon kaynağı59olarak EE2 içeren minimum Bushnell Haas kültür ortamı (BH Broth) yıkanmış ve resuspended hücreleri aşılın .
      NOT: EE2 kültür ortamında 5 mg/L'lik son konsantrasyonda etanol içinde çözülür. Gerekirse kirletici türünde ve/veya konsantrasyonunda değişiklikler yapın.
    5. 16−72 saat kuluçka için LB agar orta33'tebirim (CFU) oluşturan 600 nm ve/veya koloniler optik yoğunluğuna göre bakteri büyümesini değerlendirin.
      NOT: Alternatif olarak, mikroorganizmalar doğrudan ee2 içeren minimum ortamda izole edilebilir, veya diğer bileşikler, tek karbon kaynağı olarak. Bu adım seçimi yönlendirecek ve istenmeyen büyümeyi önleyeceği gibi.

3. Petrol düşürücü bakterilerin deniz suyundan ve/veya mercanlardan izole edilmesi

  1. Tek karbon kaynağı olarak bir yağ suda çözünür fraksiyonu (oWSF) ve yağ suda çözünmez fraksiyonu (oWIF) içeren minimum ortam hazırlayın21.
    1. 500 mL steril distile suya %1−2 ham petrol ekleyin. Çözünmez fraksiyonun üst tabakasını bozmadan çözünen fraksiyonu çıkarmak için alt tanınansı açılan bir filtre şişesi kullanın.
    2. Karışımı 24−28 °C'de 150 x g'de 48 saat boyunca sürekli ajitasyon altında tutun.
    3. Ham yağ fraksiyonlarını içeren filtre şişesini sabit bir yüzeye yerleştirin ve çözünür ve çözünmez kesir ayrımına izin vermek için 10−20 dk bekleyin.
    4. OWSF'yi yeni bir steril şişeye aktarın, alt filtre şişesini açarak ve çözünür fraksiyonu çıkararak oWIF'i kaydedin.
    5. Önceki adımda (~400 mL) kurtarılan tüm oWSF'yi kullanarak, tek karbon kaynağı olarak oWSF içeren BH agar minimum ortasının 1 L'sini hazırlayın.
    6. Adım 3.1.4 gelen şişede kalan oWIF kullanarak, tek karbon kaynağı olarak oWIF içeren BH agar minimum orta 1 L hazırlamak.
  2. OWSF ve oWIF-aşağılayıcı bakterileri izole edin.
    1. Sırasıyla 1.1.2 ve 1.2.7 adımlarından su ve mercan macerate'yi kullanarak, numuneleri 2.1.1'de açıklandığı gibi steril tuzlu çözeltide 10-6'ya kadar seyreltin.
    2. Bh-oWSF ve BH-oWIF agar ortam içeren Petri kaplarında her seyreltme 100 μL pipet ve plaka.
    3. Adım 2.1.3'ten adım 2.1.5'e kadar açıklanan yordamları tekrarlayın.

4. Konsorsiyum üye seçimi

  1. Taksonomik tanımlama için DNA'yı ayıklayın ve dizilin.
    1. Adım 2.3.1 açıklandığı gibi gliserol stoklanmış izole etkinleştirin.
    2. DNA çıkarma kiti kullanarak DNA ayıklayın (Bkz. Malzemeler Tablosu).
    3. 16S rRNA geninin amplifikasyonu için astar 27f (5′-AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG-3′) ve 1492r (5′-GTT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′) kullanın.
    4. Aşağıdaki protokole göre 50 μL PCR reaksiyonu gerçekleştirin: 5 μL 10x polimeraz tampon, 2 mM MgCl2, 0.2 mM dNTPs, her astar 5 mM, genomik DNA 10 ng ve Taq DNA polimeraz 2.5 U. Kontaminasyon olmadığından emin olmak için negatif kontroller (örneğin, boş DNA ekstraksiyonları ve şablon DNA olmadan PCR reaksiyonları) ekleyin.
    5. Aşağıdaki termal bisiklet adımlarını ayarlayın: 94 °C'de 4 dk için ilk denatürasyon döngüsü; 94 °C'de 1 dk için 35 devir, ardından 1 dk için 50 °C ve 2,5 dk için 72 °C; 72 °C'de 10 dakika için son uzatma döngüsü.
    6. 80 V kullanarak % 1.2 agarose jel amplicon bütünlüğünü kontrol edin.
    7. Jel bir jel arıtma kiti kullanarak örnekleri arındırmak (Malzemeler Tablosubakınız).
    8. PCR ürünlerini florometre kullanarak ölçün.
    9. Sıralama için ürün gönderin.
      NOT: Daha iyi taksonojik sınıflandırmalar için, Uzun diziler sağladığından Sanger yöntemi60önerilir. Evrensel astarlar 27f ve 1492r 16S rRNA gen61neredeyse tüm uzunluğu yükseltmek için kullanılabilir. Bir çift astar kullanılarak kontigler bir araya getirilemezse, dizinin ortasında fazladan bir çift düşünülmelidir.
  2. Büyüme eğrisini belirleyin.
    1. Adım 2.3.1'de açıklandığı gibi gliserol stoklarındaki izoleleri 2.3.1 adımdan ancak 2 mL yerine 5 mL kullanarak etkinleştirin.
    2. Yetişkin 5 mL kültürünün %1'ini (v/v) triplicates'teki 4.2.1 adımdan 100 mL LB medya içeren 250 mL'lik bir şişeye ekleyin. Negatif kontrol (no inoculum) triplicates hazırlamak için de emin olun.
    3. Şişeleri 24−28 °C'de sürekli ajitasyon (150 x g)altında bir kuvözde yerleştirin.
    4. 48 saat için her 4 saat 1 mL aliquots alın. Suşlar yüksek bir büyüme hızı mevcutsa, 4 saat aralığını azaltın.
    5. Optik yoğunluk (OD) tahminini 600 nm dalga boyu ve koloni şekillendirme üniteleri (CFU) açısından ölçün zengin ortam plakaları üzerinde kaplanmış seri seyreltmelerden sayıldığında (100°L her plakaya aşılanmalıdır ve 1 mL hacmine normalleştirilmelidir).
    6. OD ve CFU eğrilerini çizin ve her bir suştaki OD/CFU korelasyonunun analizini analiz edin. Şu andan itibaren, OD değerlerini temel alan hücre sayısını hesaplayın.
  3. Düşmanlık testi yapın.
    1. Adım 2.3.1'de açıklandığı gibi yalıtmaları etkinleştirin.
    2. Agar media ve merkezi bir dik diğer olanlar içeren plakaların ortasında bir seferde bir zorlanma aşılamak. Seçilen her mikrobiyal suşu diğerlerine karşı test edilene kadar tekrarlayın.
    3. Plakaları 24−28 °C'de kuluçkaya yatırın ve antagonistik aktiviteyi gösteren potansiyel haleleri gözlemlemek için günlük olarak izleyin. İki suş arasında antagonistik aktivite gösteren haleler gözlenirse, bunlardan biri dışlanmalıdır.
  4. Konsorsiyum montaj gerçekleştirin.
    1. Adım 2.3.1'de açıklandığı gibi yalıtmaları etkinleştirin.
    2. 3.500 x g'deki hücreleri peletleyin ve eşit miktarda tuzlu çözeltide 2 kat hafifçe yıkayın. Hücreleri eşit hacimde yeniden askıya alın (yani, son hacim 2 mL hücre ise, 2 mL tuzlu çözelti kullanarak yıkayın ve 2 mL'lik son hacimde yeniden askıya alın).
    3. 100 mL %3 NaCl LB orta ve inkübat ON 150 x g'de 1 mL kültürü aşıla.
    4. Adımı 4.5.2'yi tekrarlayın, 10 L kültüründe yetiştirilen, yıkanan ve yeniden askıya alınan 100 mL'lik kültürleri aşılamak. Steril hava asansörü biyoreaktörlerde ON'a inkübül, bir pompadan filtrelenmiş hava alın. Daha fazla kültüre ihtiyaç duyulsa, her zaman taze medyada yetiştirilen kültürün %1'ini aşılamak.
    5. Santrifüj 4 °C'de 8 dk 8.000 x g'da yetiştirilen kültürler. Santrifüjden sonra supernatant atın.
    6. 500 mL steril salin çözeltisinde hücreleri hafifçe yeniden suyaalarak peleti yıkayın.
    7. 4.5.5 ve 4.5.6 adımlarını tekrarlayın.
    8. Her bir kültürü 100 mL tuzlu çözeltide yeniden askıya alın ve hücre sayısını tahmin etmek için OD'yi ölçün.
    9. 107 hücrem-1'likson konsantrasyona ulaşmak için gerekli olan her kültürün hacmini hesaplayın.
    10. Hücre canlılığı ve konsantrasyonunun son teyidi için zengin ortama CFU sayıları gerçekleştirin.
    11. Steril şişelerde her bir kültürün eşit hacmini karıştırın ve konsorsiyumu 50 mL steril tüplere dönüştürün.
    12. Aşı olana kadar 4 °C'de tutun.
      NOT: Hücrelerin hala uygulanabilir olacağını garanti etmek için konsorsiyum montajını mümkün olduğunca taze hazırlayın. Alternatif olarak, CFU sayımları aşılamadan önce yapılabilir. İdeal bir konsorsiyum oluşturmak için, farklı ve tamamlayıcı metabolik kapasiteleri sunan izole kullanmak gereklidir. Genellikle, 6−10 izolasyonlar konsorsiyum oluşturmak için kullanılır, ancak bu sayı üyelerin özelliklerine ve amaçlarına bağlı olarak değişir.

5. Mercanlar için putatif yararlı özelliklerin saptanması

  1. Tek koloniler büyümek için 24−28 °C'de inkübe ederek gliserol stoklarındaki izoleleri aktive edin. Plakalardan tek bir koloni seçin ve 2 mL steril LB orta ile aşılamak. Sürekli ajitasyon (150 x g)altında 24−28 °C AYA doğru eğimli LB orta içeren tüpü yerleştirin.
  2. PCR tarafından yararlı olabilecek genlerin tespiti için bölüm 4.1'de açıklandığı gibi DNA ekstraksiyonu gerçekleştirin.
    NOT: PCR reaksiyon koşulları ve astarlar hedeflenen gen bağlıdır. Bireysel suşların BMC özelliklerini test etmek için metodolojiler ve potansiyel olarak yararlı genler için PCR tespiti Tablo 1'deaçıklanmıştır.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan yöntemlere dayanarak, mikroorganizmaları farklı su kaynaklarından ve putatif BMC karakteristikleri sunan ve farklı kirletici sınıflarını bozabilecek mercan nubbinlerinden ayırmak mümkün oldu(Şekil 1). Bir kanalizasyon arıtma tesisinde toplanan su örneklerini kullanarak, CESA-UFRJ 'den (Rio de Janeiro Federal Üniversitesi Çevre Sanitasyon Deneysel Merkezi) alınan ve burada sunulan prosedüre dayanarak, 33 bakteri suşları EE2 düşürmek mümkün 5mg/L'lik son konsantrasyon izole edildi (Şekil 2A). Ayrıca, yağ bozan bakterilerin seçimi tekniği kullanılarak, hem oWSF(Şekil 2B)hem de oWIF(Şekil 2C)bozabilecek 20 suş izole edildi.

Putatif BMC karakteristikleri farklı mercan türlerinden farklı koşullarda izole edilen mikroorganizmalarda tarandı. Bunlar arasında, mercan patojeni Vibrio coralliilyticus (Şekil 3A),üreyi bozabilen suşlara karşı güçlü bir antagonistik aktivite sunan bir suşu (Şekil 3B), iyi bir katalaz üreticisi (Şekil 3 C), ve potansiyel olarak yararlı genler sunan mikroorganizmalar(Şekil 3D)bulundu.

İki yaklaşımın birleştirilmesi (biyoremediasyon ve BMC aşısı) sayesinde mercanları yağa maruz kalma etkilerinden korumak mümkün olmuştur. Bunun için, bir petrol bioremediator pBMC konsorsiyumu, mercan Mussismilia harttiiizole , mercan nubbins üzerinde aşılanmış oldu 1% yağ triplicates21. Yağa maruz kalan tedaviler, dördüncü günden itibaren Fv/Fm'de ilerleyici bir düşüş sunarak onuncu güne kadar sıfıra yakın değerlere ulaştı. Değişken floresans/maksimum floresans (Fv/Fm), mercan sağlığının dolaylı bir ölçümlerini temsil eden zooxanthellae'nin maksimal fotosistem II (PSII) fotokimyasal verimliliğini ölçtü. Öte yandan, konsorsiyum ile aşılanmış akvaryumlarda bulunan mercan nubbins daha iyi korunmuş fotokimyasal yetenek gösterdi(Şekil 4).

figure-results-1
Şekil 1: Bir biyoemediator-pBMC konsorsiyum seçimi ve montajının ana adımlarının özeti. Kirletici aşağılayıcı mikroorganizmaların seçim adımlarının şeması (gri) ve konsorsiyum mikrobiyal seçimi (DNA dizilemesi, büyüme eğrisi, antagoizm testi ve kırmızı konsültasyonu) için kullanılan son adımlar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Kirletici aşağılayıcı bakterilerin seçimi. (A) Bakteriyel izole minimum medya plakaları eE2 içeren tek karbon kaynağı olarak büyüyen. (B) Tek karbon kaynağı olarak oWSF içeren minimum ortam plakaları üzerinde büyüyen bakteri kolonileri. (C) Tek karbon kaynağı olarak oWIF içeren minimum ortam plakaları üzerinde büyüyen bakteri kolonileri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: PBMC özelliklerinin saptanması. (A) Mercan patojeni Vibrio coralliilyticus (siyah) ve bir kontrol suş (yeşil) karşı antagonistik aktivite sunan gerginlik triplicates lekeleri. (B) Tek karbon kaynağı olarak üre içeren ortamlarda yetişen suşlar. (C) Strain üreten katalaz (+) ve kötü bir katalaz üretici suşu (-). (D) NirK geninin PCR tespiti örneği (şerit 1 = 1kb merdiven; şerit 2 = boş DNA çıkarma negatif kontrolü; şerit 3 = nirK algılama; şerit 4 = ŞABLON DNA olmadan PCR reaksiyonları). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: M. harttii nubbins'in Fv/Fm ölçümleri saat 17:00'de, dalış-PAM klorofil florometresi kullanılarak uyarlanmıştır. Tedavi kontrol konsorsiyumu, petrol ve yağ konsorsiyumunun Fv/Fm ölçümleri 10 gün boyunca her gün üç etekli olarak gerçekleştirildi. Standart sapma gösterilir. Grafiğin özellikleri önceki sonuçlardan izin ile değiştirildi21, https://www.nature.com/articles/srep18268 bir Creative Commons Attribution 4.0 altında kullanılabilir. http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/'da tam vade. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

MoaMikroorganizmaAlgılama tekniğiBaşvuru
İklim düzenlemesi; surfur bisiklet; antimikrobiyal bileşikler; hücrelerin antioksidan koruma artırmak.Aspergillus sydowiidddP geni için PCR81
Psödovibrio sp. P12DMSP ile kültür ortamı82
Pseudoalteromonas sp.dmdA geni için PCR33
Patojenlerin biyolojik regülasyonu.Acropora palmata mukus gelen mikrobiyomİnhibisyon net bölge83
Mercanlardan alıntılarBüyüme inhibisyonu tartışımı84
Marinobacter sp.Swarming tahliller85
Pseudoalteromonas sp.Agar plaka çapraz çizgili86
Pseudoalteromonas sp.Agar difüzyon yöntemi33
Kireçlenme sürecine fayda; skleractinian mercanlar için azot kaynağı.Simbiyodyum spp.Kolorimetrik yöntem87
Stylophora pistillata mukus mikrobiyom___88
Acropora alciminata gelen mikrobiyomYöntem Bolland ve ark.80 tarafından89
Azot döngüsü; azot fiksasyonunu arttırır.Mikrobiyal toplulukqPCR90
Mikrobiyal toplulukPcr91
Mikrobiyal toplulukqPCR92
Mikrobiyal toplulukUyarlanmış asetilen (C2H2) azaltma tekniği93
Pseudoalteromonas sp. ve Halomonas taeanensisPcr33
Azot döngüsü; amonyum konsantrasyonunun azalması.Pseudoalteromonas sp.Pcr33
Tubastraea coccinea gelen mikrobiyomPcr94
Xestospongia testudinaria gelen mikrobiyomPrediktif metagenom analizi95
Reaktif oksijen türlerine (ROS) karşı holobiont koruması.Pseudoalteromonas sp., Cobetia marina ve Halomonas taeanensisKatalaz testi33
Simbiyodyum spp.Amplex kırmızı96
Vibrio pelagius ve Sync- chococcus sp.Horseradish peroksidaz-scopoletin yöntemi97
Vibrio fischeriBirden fazla yöntem98

Tablo 1: Putatif BMC karakteristiklerinin saptanması, etki mekanizması (MOA), karakteristik özelliğini saptamak için kullanılan potansiyel ve tekniği sunan mikroorganizmalar rapor edilmiştir.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biyoremediasyon yaklaşımları son 50 yılda büyük ölçüde araştırılmıştır. Örneğin, birkaç farklı habitatlarda bakteri, siyanobakteri, mikroalg ve mantarlar arasında 200'den fazla mikrop, varlığını göstermek ve / veya yağ hidrokarbonlar62,63,64 göstermek mümkün olarak belirlenmiştir . Ayrıca, plastik, bisfenol A, endokrin bozucular ve ağır metaller gibi çevre ve insanlar için etkilere neden bileşiklerin diğer sınıflar, biyoremediasyon tekniği geliştirme için hedefler65,66, 67'ye kadar. Öte yandan, deniz probiyotik gelişimi ekonomi üzerinde bariz bir etkiye sahip alanları ile sınırlı olmuştur, kültür balıkçılığı balık probiyotikler gibi68,69. Ancak mercan resiflerini korumak için yararlı mikroorganizmaların izolasyonu ve karakterizasyonu, balıkçılık, turizm ve diğer karlı faaliyetleri destekleyen deniz ekosistemleri15değerlenmeye başlanmaktadır. Burada, yerel deniz ekosistemlerine, özellikle mercanlara (pBMCs) zararlı yararlı mikroorganizmalar da sunabilen kirletici aşağılayıcı mikroorganizmaların seçilmesi için ucuz, kolay ve erişilebilir bir protokol Açıklanan.

Ayrıca, burada gösterilen yöntem son derece çeşitli bileşikler ve mikrobiyal kaynakların çeşitli türleri için uyarlanabilir. Minimum ortama eklenen tek karbon kaynağını değiştirerek farklı kirleticileri hedeflemek mümkündür. Bunun için, yağ veya EE2 yerine, diğer bileşikler istenilen konsantrasyonda eklenmelidir. Bu, hedeflenen kirleticilerin bozulanlarını izole etmek için seçici bir basınç olacaktır. Örneğin, endokrin bozucuların diğer sınıfları aşağılama yeteneğine sahip mikroorganizmalar zaten seçilmiş ve aynı metodoloji70kullanılarak test edilmiştir. Ayrıca, sünger ve bitkiler71,72gibi diğer deniz ve karasal organizmalar, yanı sıra toprak, yakıt ve kayalar gibi çevresel örneklerin farklı türleri, aşağılayıcı-mikrobiyal kaynaklar25olarak kullanılabilir, 73,74. Örneğin, farklı toprak ve tortu örneklerinden hidrokarbon bozan bakterileri tespit etmek ve izole etmek mümkün oldu25,54,63,64,75. Son olarak, medyada hafif değişiklikler yaparak, bakteriler dışındaki mikroorganizmalar kolayca aşağılayıcı-mikroplar olarak seçilebilir. Örneğin, etkili östrojen bileşikleri düşürmek için yeteneği ile bir mikroalg suşubildirilmiştir 76.

İdeal olarak, biyoremediasyon-probiyotik konsorsiyum her özel bileşik veya alan için monte edilmelidir. Belirli bir ortamda yetişen mikroplar, yerel koşullarına kıyasla yeni bölgelerde de büyüyemeyebilir. Araştırmacılar tüm farklı çevre koşullarında verimli bir şekilde uygulanabilecek bir ürün bulamadıklarından, her durum için yeni konsorsiyum montajı yapılmalıdır. Bu çevreye özel kurtarma için kişiselleştirilmiş tıp benzer olacaktır. Bu nedenle, potansiyel probiyotik özellikleri ve bozulma kapasitesi ile mikrobiyal suşları bir merkez bankası oluşturulması bu alanın ilerlemesi için önemli bir adımdır. Bu girişim, dünya çapında yeni özel konsorsiyumların montajına katkıda bulunarak zamandan ve işten tasarruf edece.

Mercanlar ile ilişkili mikroorganizmalar (yani, mikroalg, bakteri, arke, mantar, ve virüsler) ev sahibi homeostaz bakımında karmaşık ve karmaşık bir role sahiptir19. Çevre stres, kirlilik gibi, aynı zamanda mercan mikrobiyomu istikrarsızlaştırmak olabilir, disbiyoz ile sonuçlanan, hangi hastalık ve mortaliteye neden olabilir30. Mercan mikrobiyomlarının mercan sağlığını destekleyebilecek mekanizmaları ortaya çıkmaya başladı. Bu mekanizmalar mercan direnci ve çevresel strese karşı dayanıklılığı anlamak ve sonuç olarak, resif kalıcılığı ve korunması teşvik etmek için anahtardır. Ayrıca, alanında bulgular genel konak-mikrobiyom etkileşimleri anlamak için yardımcı olacaktır, hangi diğer alanlarda daha iyi probiyotikler ve sağlık teşvik stratejilerinin geliştirilmesine katkıda bulunabilir. Ayrıca daha iyi nasıl bu probiyotikler aşıları stres olayları sırasında metaorganizmanın sağlığı üzerinde müdahale edebilir araştırmak önemlidir. Örneğin, mercan performansı nda büyütme probiyotikler ve sadece mercan bir gıda kaynağı olarak bakteri kullanarak kaynak olduğunu gösteren çalışma hala gereklidir.

Buna paralel olarak, yeni konsorsiyum teslim yaklaşımlarının geliştirilmesi ve mevcut olanların iyileştirilmesi büyük önem taşımaktadır. Konsorsiyum immobilizasyonu için alternatif yöntemlerin yanı sıra mercan gıda (yani, artemia ve rotifers) aşılama ve vektör olarak kullanarak gibi yenilikçi yaklaşımlar, umut verici. Bu dağıtım sistemleri de diğer deniz organizmaları hedef değiştirilebilir ve deniz probiyotikler alanının başarısı için gerekli olacaktır.

Kirlilik azaltma ve mercan resifi kalıcılığı şu anda düzenli olarak çevre konferanslarında vurgulanan ana konulardan ikisidir. Birleşmiş Milletler tarafından yayınlanan ve toplumun sürdürülebilir bir geleceğe olanak sağlamak için ulaşması gereken küresel hedefleri açıklayan Gündem 2030, her konu için belirli hedefler ayırıyor. Hedef 6 kirliliği azaltarak su kalitesinin iyileştirilmesinin önemini vurgularken, Hedef 14 okyanusların, denizlerin ve deniz kaynaklarının korunması ve sürdürülebilir kullanımının önemini güçlendirmektedir77. Bu bağlamda, mercan resiflerinin korunması, kirlilik azaltma da dahil olmak üzere yakın gelecekte elde edilmesi gereken değişikliklere bağlıdır. Bu büyük önem taşımaktadır, çünkü en büyük mercan kayıpları diğer faktörler iklim olaylarına eklendi oluştu, yerel habitat imha ve kirlenme gibi78,79. Bu makale, belirli kirleticileri alçaltmak için biyoremediasyon ve pBMC aşısını birleştirmenin mümkün olduğunu, mercanLarın kirleticiler ve diğer sorunlarla başa çıkma direncini ve direncini artırabileceğini göstermiştir. Mevcut protokollerin optimizasyonu ve/veya birlikte veya bağımsız olarak uygulanan yenilikçi yöntemlerin geliştirilmesi, deniz ekosistemlerinin geleceğini belirlemek için çok önemli olacaktır.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma, ANP 21005-4 olarak tescil edilen devam eden Ar-Ge projesi ile birlikte yapılmıştır, "PROBIO-DEEP - Derin deniz limanlarında petrol ve gaz aramalarının neden olduğu potansiyel etkilerin araştırılması ve potansiyel biyogöstergelerin seçimi ve bu ekosistemler için biyoremediation süreçleri" (UFRJ / Shell Brasil / ANP) - "PROBIO-DEEP - Levantamento de potenciais impactos causados pela exploração de óleo e gás em holobiontes marinhos em mar profundo e seleção de potenciais bioindicadores eos process biorremediadores para esses ecossistemas", Shell Brasil sponsorluğunda ANP Ar-Ge vergisi altında "Compromisso de Investimentos com Pesquisa e Desenvolvimento. Yazarlar ayrıca Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) ve Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) mali destek için teşekkür ve Camila Messias, Phillipe Rosado ve HFraenriquegoso dos Santos, sağlanan görüntüler için.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
500 mL PYREX Medya Saklama Şişesithomas scientific/Corning1743E20/1395-500Su numunesi almak için kullanılır.
500 mL Aspiratör Şişelerithomas scientific/Corning1234B28/1220-2XYağ fraksiyonlarını ayırmak için kullanılır.
6 inç tel kesici pensethomas scientific/Restek1173Y64/23033Mercan parçalarını kesmek için kullanılır.
17a-EtinilistradiolLGC StandartlarıDRE-C13245100Seçici ortamı yapmak için tek karbon kaynağı olarak kullanılır.
AgarHimediaPCT0901-1KGKatı ortam yapmak için kullanılır.
Bushnell Haas Et SuyuHimedia M350-500GKarbon kaynakları ile desteklenecek minimum ortam olarak kullanılır.
Erlenmeyer Şişesithomas scientific/DWK Yaşam Bilimleri (Kimble)4882H35/26500-125Mercan maseratını cam boncuklarla inkübe etmek için kullanılır.
GFX PCR DNA ve Jel Bant Saflaştırma kitiGE Healthcare28903470PCR ürünlerini dizileme için göndermeden önce saflaştırmak için kullanılır.
CamBoncuklar MP Biyomedikal1177Q81/07DP1070Mikroorganizmaları mercan yapılarından ayırmak için kullanılır.
Laminer Akış BaşlığıSteril koşullarda çalışmak için gereklidir.
Luria Bertani Et Suyu, Miller (Miller Luria Bertani Et Suyu)HimediaM1245-1KGBakteri yetiştirmek için zengin ortam olarak kullanılır.
Marine Agar 2216 (Zobell Marine Agar)HimediaM384-500GBakteri yetiştirmek için zengin ortam olarak kullanılır.
Orbital Çalkalayıcı İnkübatörSıvı ortamı ve yağı inkübe etmek için kullanılır.
Plaka İnkübatörüPlakaları inkübe etmek için kullanılır.
Porselen Harç ve HavaneliThomas Scientific/United Scientific Supplies1201U69/JMD150Mercan parçalarını yumuşatmak için kullanılır.
Qubit 2.0 FlorometreInvitrogen: Nükleik asitlerin DNA ve PCR ürünlerinin miktar tayini için kullanılır.
Soğutmalı SantrifüjBakteri kültürlerini santrifüjlemek için kullanılır.
SpektrofotometreBakteri kültürlerinin optik yoğunluğunu ölçmek için kullanılır.
Sihirbaz Genomik DNA Saflaştırma kitiPromegaA1120Mikrobiyal suşların DNA ekstraksiyonu için kullanılır.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Durand, M., Grattan, J. Effects of volcanic air pollution on health. Lancet. 357, 164(2001).
  2. Ramaswami, A., Russell, A. G., Culligan, P. J., Sharma, K. R., Kumar, E. Meta-principles for developing smart, sustainable, and healthy cities. Science. 352, 940-943 (2016).
  3. Dökmeci, A. H., Yildiz, T., Ongen, A., Sivri, N. Heavy metal concentration in deepwater rose shrimp species (Parapenaeus longirostris, Lucas, 1846) collected from the Marmara Sea Coast in Tekirdağ. Environmental Monitoring and Assessment. 186, 2449-2454 (2014).
  4. Skaare, J. U., et al. Ecological risk assessment of persistent organic pollutants in the arctic. Toxicology. 181-182, 193-197 (2002).
  5. Garstang, W. The impoverishment of the sea. A critical summary of the experimental and statistical evidence bearing upon the alleged depletion of the trawling grounds. Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom. 6, 1-69 (1900).
  6. Korajkic, A., Brownell, M. J., Harwood, V. J. Investigation of human sewage pollution and pathogen analysis at Florida Gulf coast beaches. Journal of Applied Microbiology. 110, 174-183 (2011).
  7. Liu, J., Yang, W. Water sustainability for China and beyond. Science. 337, 649-650 (2012).
  8. Eriksen, M., et al. Plastic pollution in the world’s oceans: more than 5 trillion plastic pieces weighing over 250,000 tons afloat at sea. PLoS One. 9, 111913(2014).
  9. Vilela, C. L. S., Bassin, J. P., Peixoto, R. S. Water contamination by endocrine disruptors: Impacts, microbiological aspects and trends for environmental protection. Environmental Pollution. 235, 546-559 (2018).
  10. Ueno, D., et al. Global pollution monitoring of PCBs and organochlorine pesticides using skipjack tuna as a bioindicator. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 45, 378-389 (2003).
  11. Villela, H. D. M., Peixoto, R. S., Soriano, A. U., do Carmo, F. L. Microbial bioremediation of oil contaminated seawater: A survey of patent deposits and the characterization of the top genera applied. Science of the Total Environment. 666, 743-758 (2019).
  12. Rabalais, N. N., et al. Eutrophication-driven deoxygenation in the coastal ocean. Oceanography. 27, 172-183 (2014).
  13. Calmet, D. P. Ocean disposal of radioactive waste. Status report. IAEA Bulletin. 31, 47-50 (1989).
  14. Swart, P. K. Coral Reefs: Canaries of the Sea, Rainforests of the oceans. Nature Education Knowledge. 4, 5(2013).
  15. National Academies of Sciences and Medicine, E. A Research Review of Interventions to Increase the Persistence and Resilience of Coral Reefs. , The National Academies Press. Washington, D.C. (2019).
  16. Béné, C., et al. Feeding 9 billion by 2050-Putting fish back on the menu. Food Security. 7, 261-274 (2015).
  17. Hughes, T. P., et al. Global warming and recurrent mass bleaching of corals. Nature. 543, 373(2017).
  18. Hughes, T. P., et al. Spatial and temporal patterns of mass bleaching of corals in the Anthropocene. Science. 359, 80-83 (2018).
  19. Rosenberg, E., Koren, O., Reshef, L., Efrony, R., Zilber-Rosenberg, I. The role of microorganisms in coral health, disease and evolution. Nature Reviews Microbiology. 5, 355(2007).
  20. Shaver, E. C., Burkepile, D. E., Silliman, B. R. Local management actions can increase coral resilience to thermally-induced bleaching. Nature Ecology & Evolution. 2, 1075-1079 (2018).
  21. Santos, H., et al. Impact of oil spills on coral reefs can be reduced by bioremediation using probiotic microbiota. Scientific Reports. 5, 18268(2015).
  22. Whitman, W. B. Bacteria and the fate of estrogen in the environment. Cell Chemical Biology. 24, 652-653 (2017).
  23. DeLeo, D. M., Ruiz-Ramos, D. V., Baums, I. B., Cordes, E. E. Response of deep-water corals to oil and chemical dispersant exposure. Deep-Sea Research. Part II Topical Studies in oceanography. 129, 129-147 (2016).
  24. Zinicovscaia, I., Cepoi, L. Cyanobacteria for bioremediation of wastewaters. , Springer. Berlin, Germany. (2016).
  25. Cury, J. C., et al. Microbial diversity and hydrocarbon depletion in low and high diesel-polluted soil samples from Keller Peninsula, South Shetland Islands. Antarctic Science. 27, 263-273 (2015).
  26. Sinha, R. K., Valani, D., Sinha, S., Singh, S., Herat, S. Bioremediation of contaminated sites: a low-cost nature’s biotechnology for environmental clean up by versatile microbes, plants, earthworms. Solid Waste Management and Environmental Remediation. , 971-978 (2009).
  27. Maila, M. P., Cloete, T. E. Bioremediation of petroleum hydrocarbons through landfarming: Are simplicity and cost-effectiveness the only advantages. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology. 3, 349-360 (2004).
  28. Madsen, K., et al. Probiotic bacteria enhance murine and human intestinal epithelial barrier function. Gastroenterology. 121, 580-591 (2001).
  29. Saleem, M., Arshad, M., Hussain, S., Bhatti, A. S. Perspective of plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) containing ACC deaminase in stress agriculture. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 34, 635-648 (2007).
  30. Sweet, M. J., Bulling, M. T. On the importance of the microbiome and pathobiome in coral health and disease. Frontiers in Marine Science. 4, 9(2017).
  31. Reshef, L., Koren, O., Loya, Y., Zilber-Rosenberg, I., Rosenberg, E. The coral probiotic hypothesis. Environmental Microbiology. 8, 2068-2073 (2006).
  32. Peixoto, R., Rosado, P. M., Leite, D. C. deA., Rosado, A. S., Bourne, D. G. Beneficial Microorganisms for Corals (BMC): Proposed Mechanisms for Coral Health and Resilience. Frontiers in Microbiology. 8, 341(2017).
  33. Rosado, P., et al. Marine probiotics: increasing coral resistance to bleaching through microbiome manipulation. The The ISME Journal. 13, 921-936 (2019).
  34. Heberer, T., Reddersen, K., Mechlinski, A. From municipal sewage to drinking water: fate and removal of pharmaceutical residues in the aquatic environment in urban areas. Water Science and Technology. 46, 81-88 (2002).
  35. Barel-Cohen, K., et al. Monitoring of natural and synthetic hormones in a polluted river. Journal of Environmental Management. 78, 16-23 (2006).
  36. Balest, L., Mascolo, G., Di Iaconi, C., Lopez, A. Removal of endocrine disrupter compounds from municipal wastewater by an innovative biological technology. Water Science and Technology. 58, 953-956 (2008).
  37. Liu, Z., Kanjo, Y., Mizutani, S. A review of phytoestrogens: Their occurrence and fate in the environment. Water Research. 44, 567-577 (2010).
  38. Chapman, H. F., et al. A national approach to health risk assessment, risk communication and management of chemical hazards from recycled water. Waterlines. 48, (2011).
  39. Rocha, M. J., Cruzeiro, C., Ferreira, C., Rocha, E. occurrence of endocrine disruptor compounds in the estuary of the Iberian Douro River and nearby Porto Coast (NW Portugal). Toxicological and Environmental Chemistry. 94, 252-261 (2012).
  40. Nie, M., et al. Environmental estrogens in a drinking water reservoir area in Shanghai: occurrence, colloidal contribution and risk assessment. Science of the Total Environment. 487, 785-791 (2014).
  41. Ribeiro, C., Ribeiro, A. R., Tiritan, M. E. Priority substances and emerging organic pollutants in Portuguese aquatic environment: a review. Reviews of Environmental Contamination and Toxicology. 238, 1-44 (2016).
  42. Wu, C., Huang, X., Lin, J., Liu, J. Occurrence and fate of selected endocrine-disrupting chemicals in water and sediment from an urban lake. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 68, 225-236 (2015).
  43. Shi, W., Wang, L., Rousseau, D. P. L., Lens, P. N. L. Removal of estrone, 17α-ethinylestradiol, and 17ß-estradiol in algae and duckweed-based wastewater treatment systems. Environmental Science and Pollution Research. 17, 824-833 (2010).
  44. Ternes, T., Bonerz, M., Schmidt, T. Determination of neutral pharmaceuticals in wastewater and rivers by liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 938, 175-185 (2001).
  45. Ternes, T. A., Andersen, H., Gilberg, D., Bonerz, M. Determination of estrogens in sludge and sediments by liquid extraction and GC/MS/MS. Analytical Chemistry. 74, 3498-3504 (2002).
  46. Tarrant, A. M., Atkinson, M. J., Atkinson, S. Effects of steroidal estrogens on coral growth and reproduction. Marine Ecology Progress Series. 269, 121-129 (2004).
  47. Atkinson, S., Atkinson, M. J., Tarrant, A. M. Estrogens from sewage in coastal marine environments. Environmental Health Perspectives. 111, 531-535 (2003).
  48. Schoenmakers, H. J. N., Van Bohemen, C. G., Dieleman, S. J. Effects of Oestradiol-17 β on the Ovaries of the Starfish Asterias rubens. Development Growth and Differentiation. 23, 125-135 (1981).
  49. Sarojini, R., Jayalakshmi, K., Sambashivarao, S. Effect of external steroids on ovarian development in freshwater prawn, Macrobrachium lamerrii. Journal of Advanced Zoology. 7, 50(1986).
  50. Hathaway, R. R., Black, R. E. Interconversions of estrogens and related developmental effects in sand dollar eggs. General and Comparative Endocrinology. 12, 1-11 (1969).
  51. Ghosh, D., Ray, A. K. Subcellular action of estradiol-17β in a freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii. General and Comparative Endocrinology. 90, 274-281 (1993).
  52. Aris, A. Z., Shamsuddin, A. S., Praveena, S. M. occurrence of 17α-ethynylestradiol (EE2) in the environment and effect on exposed biota: a review. Environment International. 69, 104-119 (2014).
  53. International Energy Agency. Key World Energy Statistics (KWES). , (2018).
  54. Carmo, F. L., et al. Bacterial structure and characterization of plant growth promoting and oil degrading bacteria from the rhizospheres of mangrove plants. Journal of Microbiology. 49, 535-543 (2011).
  55. Piatt, J. F., Lensink, C. J., Butler, W., Kendziorek, M., Nysewander, D. R. Immediate impact of the'Exxon Valdez'oil spill on marine birds. The Auk. 107 (2), 387-397 (1990).
  56. White, H. K., et al. Impact of the Deepwater Horizon oil spill on a deep-water coral community in the Gulf of Mexico. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 20303-20308 (2012).
  57. Abdel-Shafy, H. I., Mansour, M. S. M. A review on polycyclic aromatic hydrocarbons: source, environmental impact, effect on human health and remediation. Egyptian Journal of Petroleum. 25, 107-123 (2016).
  58. Negri, A. P., Hoogenboom, M. O. Water contamination reduces the tolerance of coral larvae to thermal stress. PLoS One. 6, 19703(2011).
  59. Brown, E. J., Resnick, S. M., Rebstock, C., Luong, H. V., Lindstrom, J. UAF radiorespirometric protocol for assessing hydrocarbon mineralization potential in environmental samples. Biodegradation. 2, 121-127 (1991).
  60. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74, 5463-5467 (1977).
  61. Vergin, K. L., et al. Screening of a Fosmid Library of Marine Environmental Genomic DNA Fragments Reveals Four Clones Related to Members of the Order Planctomycetales. Applied and Environmental Microbiology. 64 (8), 3075-3078 (1998).
  62. Yakimov, M. M., Timmis, K. N., Golyshin, P. N. Obligate oil-degrading marine bacteria. Current Opinion in Biotechnology. 18, 257-266 (2007).
  63. Santos, H. F., Cury, J. C., Carmo, F. L., Rosado, A. S., Peixoto, R. S. 18S rDNA sequences from microeukaryotes reveal oil indicators in mangrove sediment. PLoS One. 5, 12437(2010).
  64. Jurelevicius, D., Cotta, S. R., Peixoto, R., Rosado, A. S., Seldin, L. Distribution of alkane-degrading bacterial communities in soils from King George Island, Maritime Antarctic. European Journal of Soil Biology. 51, 37-44 (2012).
  65. Paço, A., et al. Biodegradation of polyethylene microplastics by the marine fungus Zalerion maritimum. Science of the Total Environment. 586, 10-15 (2017).
  66. Zhang, W., Yin, K., Chen, L. Bacteria-mediated bisphenol A degradation. Applied Microbiology and Biotechnology. 97, 5681-5689 (2013).
  67. Gadd, G. M. Metals, minerals and microbes: geomicrobiology and bioremediation. Microbiology. 156, 609-643 (2010).
  68. Balcázar, J. L., et al. The role of probiotics in aquaculture. Veterinary Microbiology. 114, 173-186 (2006).
  69. Gatesoupe, F. J. The use of probiotics in aquaculture. Aquaculture. 180, 147-165 (1999).
  70. Ren, Y. X., Nakano, K., Nomura, M., Chiba, N., Nishimura, O. Effects of bacterial activity on estrogen removal in nitrifying activated sludge. Water Research. 41, 3089-3096 (2007).
  71. Santos-Gandelman, J. F., Giambiagi-deMarval, M., Muricy, G., Barkay, T., Laport, M. S. Mercury and methylmercury detoxification potential by sponge-associated bacteria. Antonie Van Leeuwenhoek. 106, 585-590 (2014).
  72. Yamaga, F., Washio, K., Morikawa, M. Sustainable biodegradation of phenol by Acinetobacter calcoaceticus P23 isolated from the rhizosphere of duckweed Lemna aoukikusa. Environmental Science & Technology. 44, 6470-6474 (2010).
  73. Soriano, A. U., et al. Microbiological aspects of biodiesel and biodiesel/diesel blends biodeterioration. International Biodeterioration & Biodegradation. 99, 102-114 (2015).
  74. Da Cunha, C. D., Rosado, A. S., Sebastián, G. V., Seldin, L., Von der Weid, I. Oil biodegradation by Bacillus strains isolated from the rock of an oil reservoir located in a deep-water production basin in Brazil. Applied Microbiology and Biotechnology. 73, 949-959 (2006).
  75. Prantera, M. T., Drozdowicz, A., Leite, S. G., Rosado, A. S. Degradation of gasoline aromatic hydrocarbons by two N 2-fixing soil bacteria. Biotechnology Letters. 24, 85-89 (2002).
  76. Lai, K. M., Scrimshaw, M. D., Lester, J. N. Biotransformation and bioconcentration of steroid estrogens by Chlorella vulgaris. Applied and Environmental Microbiology. 68, 859-864 (2002).
  77. United Nations. Transforming our World: The 2030 Agenda for Sustainable Development. , (2015).
  78. Bellwood, D. R., Hughes, T. P., Folke, C., Nyström, M. Confronting the coral reef crisis. Nature. 429, 827(2004).
  79. Pandolfi, J. M., et al. Global trajectories of the long-term decline of coral reef ecosystems. Science. 301, 955-958 (2003).
  80. Bolland, E. G., Cook, A. R., Turner, N. A. Urea as a sole source of nitrogen for plant growth. I. The development of urease activity in Spirodela oligorrhiza. Planta. 83, 1-12 (1968).
  81. Kirkwood, M., Todd, J. D., Rypien, K. L., Johnston, A. W. B. The opportunistic coral pathogen Aspergillus sydowii contains dddP and makes dimethyl sulfide from dimethylsulfoniopropionate. The ISME Journal. 4, 147-150 (2010).
  82. Raina, J., Tapiolas, D., Motti, C., Foret, S., Seemann, T. Isolation of an antimicrobial compound produced by bacteria associated with reef-building corals. Peer J. 4, 2275(2016).
  83. Ritchie, K. B. Regulation of microbial populations by coral surface mucus and mucus-associated bacteria. Marine Ecology Progress Series. 322, 1-14 (2006).
  84. Gochfeld, D. J., Aeby, G. S. Antibacterial chemical defenses in Hawaiian corals provide possible protection from disease. Marine Ecology Progress Series. 362, 119-128 (2008).
  85. Alagely, A., Krediet, C. J., Ritchie, K. B., Teplitski, M. Signaling mediated cross-talk modulates swarming and biofilm formation in a coral pathogen Serratia marcescens. The ISME Journal. 5, 1609-1620 (2011).
  86. Kvennefors, E. C. E., et al. Regulation of bacterial communities through antimicrobial activity by the coral holobiont. Microbial Ecology. 63, 605-618 (2012).
  87. Biscere, T., et al. Enhancement of coral calcification via the interplay of nickel and urease. Aquatic Toxicology. 200, 247-256 (2018).
  88. Grover, R., Maguer, J., Allemand, D., Ferrier-Pages, C. Urea uptake by the scleractinian coral Stylophora pistillata. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 332, 216-225 (2006).
  89. Crossland, C. J., Barnes, D. J. The Role of Metabolic Nitrogen in Coral Calcification. Marine Biology. 28, 325-332 (1974).
  90. Olson, N. D., Ainsworth, T. D., Gates, R. D., Takabayashi, M. Diazotrophic bacteria associated with Hawaiian Montipora corals: diversity and abundance in correlation with symbiotic dinoflagellates. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 371, 140-146 (2009).
  91. Lema, K. A., Willis, B. L., Bourneb, D. G. Corals form characteristic associations with symbiotic nitrogen-fixing bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 78, 3136-3144 (2012).
  92. Santos, H. F., et al. Climate change affects key nitrogen-fixing bacterial populations on coral reefs. The ISME Journal. 8, 2272-2279 (2014).
  93. Cardini, U., et al. Functional significance of dinitrogen fixation in sustaining coral productivity under oligotrophic conditions. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 282, 20152257(2015).
  94. Yang, S., Sun, W., Zhang, F., Li, Z. Phylogenetically diverse denitrifying and ammonia-oxidizing bacteria in corals Alcyonium gracillimum Tubastraea coccinea. Marine Biotechnology. 15, 540-551 (2013).
  95. de Voogd, N. J., Cleary, D. F. R. M., Polonia, A. R. M., Gomes, N. C. M. Bacterial community composition and predicted functional ecology of sponges, sediment and seawater from the thousand islands reef complex, West Java, Indonesia. FEMS Microbiology Ecology. 91, (2015).
  96. Suggett, D. J., et al. Photosynthesis and production of hydrogen peroxide by Symbiodinium (Pyrrhophyta) phylotypes with different thermal tolerances. Journal of Phycology. 44, 948-956 (2008).
  97. Petasne, R. G., Zika, R. G. Hydrogen peroxide lifetimes in south Florida coastal and offshore waters. Marine Chemistry. 56, 215-225 (1997).
  98. McFall-Ngai, M. J. Consequences of evolving with bacterial symbionts: insights from the squid-Vibrio associations. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 30, 235-256 (1999).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

BioremediationProbiotic DevelopmentCoral MicrobiomeEE2 DegradationOil DegradationBacterial IsolationSerial DilutionColony ScreeningMinimum MediaAntagonistic Activity

Related Articles