Fare Karaciğerinde Hücre Tipine Özgü Gen Ekspresyonu Profiloluşturma

Omurgalılarda ana metabolik organ olarak, karaciğer glikoz homeostazı sorumludur, serum protein sentezi, safra asidi salgılanması, ve kksorubiyotik metabolizma ve detoksifikasyon. Karaciğer acil karaciğer yetmezliği önlemek için toksinlere maruz kalma üzerine yaralı parankim yeniden olağanüstü bir kapasiteye sahiptir¹. Ancak, rejenerasyon yetmezliği asetaminofen veya alkol aşırı tüketimi ayarında oluşabilir, hangi akut karaciğer yetmezliğine yol açabilir². Ayrıca, viral hepatit enfeksiyonu, yağlı karaciğer hastalığı ve steatohepatit neden olduğu kronik karaciğer hasarı karaciğer fibrozis, siroz ve hepatosellüler karsinom neden olabilir³. Son dönem karaciğer hastalığı için mevcut tek küratif tedavi transplantasyondur ancak organ yetersizliği ile sınırlıdır, tüm hastalar için verimli tedaviyi önler⁴. Toksik karaciğer hasarı sonrası iyileşme sürecinin daha iyi anlaşılması bu nedenle hastalıklı organda fonksiyon kurtarmak için yeterli rejenerasyon uyarmak için tedavilerin geliştirilmesi için çok önemlidir.

Karaciğer rejenerasyon çalışmaları için en geniş uygulanan model sistemi kemirgenlerde kısmi hepatektomi, hangi karaciğer in büyük bir kısmı hızlı hepatosit genişlemesi ni uyarmak için rezeke edilir⁵. Ancak, parsiyel hepatektomi, immün hücre infiltrasyonu ve hepatosit hücre nekrozunun eksikliği nedeniyle toksik karaciğer hasarı sonrasında hepatosit genişlemesini tekrarlamaz⁶. Organ yenileme bu formu modellemek için daha uygun bir sistem Fah^-/- fare, fonksiyonel fumarylacetoacetate hydrolase yoksun (FAH) uygun tirozin metabolizması için gerekli ve ölüme yol açan ciddi karaciğer hasarı gelişir⁷. Bu fareler içme suyunda ilaç nitisinone ile tedavi ile süresiz olarak sağlıklı bir durumda muhafaza edilebilir. Alternatif olarak, FAH ekspresyonu hepatosit bir alt kümesine transgen teslimi ile geri yüklenebilir, hangi nitisinone kaldırma üzerine karaciğer yeniden genişletmek olacak⁸.

Yeniden popülasyon hepatositlerin gen ekspresyonundaki değişikliklerin profilini çıkarmak için, komşu yaralı hepatositlerden ve diğer hücre tiplerinden kirlenme olmadan Fah^-/- faredeki çoğalan hepatositleri özellikle izole etmek için bir araç gereklidir. Ne yazık ki, hepatositfloresan destekli hücre tasnifi (FACS) zordur çünkü (1) karaciğer perfüzyonu sonrası karaciğer perfüzyonu sonrası geri lüzeleme kırılganlık, (2) hepatosit çoğaltma boyutu son derece değişkendir, izolasyon yapma FACS tarafından saf bir popülasyonun zor, ve (3) karaciğer perfüzyonu RNA izolasyoniçin işlem süresi 2 h daha büyüktür, bu nedenle gen ekspresyonu profilleri örnekleri elde edilmeden önce önemli yapay değişikliklere uğrayabilir⁹.

Alternatif olarak, epitop etiketli ribozomların özellikle hepatositlerin yeniden doldurulmasında ekspresyonu, organ hasattan hemen sonra, toplu karaciğer ile, ribozomlarla bağlı mRNA'nın aktif olarak çevrilmesine olanak sağlar. doku lysates. Burada, translating-ribozom afinite (TRAP)¹⁰ ve ardından yüksek iş itimli RNA-sıralama (TRAP-seq) gerçekleştirmek için bir protokol açıklar, özellikle izole etmek ve fahhepatositler yeniden doldurma mRNA profil^-/- fare⁹. Fah ile yeşil floresan protein etiketli ribozomal proteinin (GFP:RPL10A) birlikte ekspresyonu, GFP:RPL10A içeren polizomlarla bağlanan mRNA'nın çevrilmesine olanak sağlar. Bu yöntem, kırılgan yeniden popülasyon hepatositleri izole etmek için karaciğer perfüzyonu gibi herhangi bir hücre ayrışma adımlarını önler. Bunun yerine, tüm organ dokusu ve antikorların lysis hızla hedef hücrelerden özellikle RNA ayıklamak için kullanır. Son olarak, bol, yüksek kaliteli mRNA'nın TRAP-seq ile izolasyonu, yeniden popülasyon sürecinde gen ekspresyonunun dinamik değişimini profillemek için sıralama analizi gibi aşağı akım uygulamaları sağlar.

Farelerin kullanımını içeren tüm yöntemler Pennsylvania Üniversitesi'ndeki Penn Hayvan Refahı Ofisi'nin IACUC tarafından sağlanan kurallarla uyumludır.

1. Reaktif Hazırlama

1. Siklohekmid
   1. 0.1 g/mL siklohekamid 500 μL yapmak için, metanol 500 μL sikloheximid 50 mg askıya.
      DİkKAT: Siklohekmid çevre için son derece toksik ve konjenital malformasyona neden olabilir. Siklohekmid içeren tüm atıklar ve tamponlar uygun bertaraf için toplanmalıdır.
      NOT: Siklohekamid 4 °C'de 1 güne kadar saklanabilir. Siklohekamid çeviriyi inhibe eder.
2. Dithiothreitol (DTT)
   1. 1 mL 1 M DTT yapmak için, RNase içermeyen suda 0,15 g DTT tozu askıya alın.
      DİkKAT: DTT cilt, göz ve solunum yollarında tahrişe neden olabilir.
      NOT: DTT bir deterjandır. DTT -20 °C'de saklanabilir. 1 M DTT'nin tek kullanımlık 50 μL'lik aliquotlarda sakkullanılması tavsiye edilir.
3. Deoksikolat (DOC)
   1. %10 DOC yapmak için, 50 mL konik bir tüpte 1 g DOC'u askıya alın ve 10 mL'ye kadar RNase içermeyen su ekleyin. Toz eriyene kadar şiddetle çalkalayın.
      NOT: %10 DOC çözeltisi biraz sarıdır ve oda sıcaklığında (RT) 1 yıla kadar saklanabilir. DOC nükleer lysis için kullanılır.
4. GFP antikorları
   1. Aliquot GFP antikorları ilk kez kullanırken. Snap aliquots dondurma ve -80 °C'de saklayın.
      NOT: 50 g gg gfp antikorlarının tek kullanımlık aliquotlarda sakkullanılması tavsiye edilir.
5. B biyotinylated protein L
   1. Son konsantrasyonu 1 μg/μL yapmak için 1x fosfat tamponlu salin (PBS) biyotinylated protein L'yi yeniden askıya alın.
      NOT: Resuspended çözeltisi -20 °C'de 6 aya kadar saklanabilir.

2. Tampon Hazırlama

1. Sığır serum albumini (BSA) tampon
   1. %3 BSA tamponunun 50 mL'sini yapmak için 40 mL PBS'ye 1,5 g IgG ve proteease içermeyen BSA tozu ekleyin ve ardından girdap. BSA çözüldükten sonra, 50 mL'lik son bir hacme PBS ekleyin.
      NOT: BSA tamponu 4 °C'de altı aya kadar saklanabilir.
2. Diseksiyon tamponu
   1. 50 mL diseksiyon tampon stoku yapmak için, 5 mL 10x Hank'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS), 125 μL 1 M 4-(2-hidroksitil)-1-piperazineeesulfonik asit (HEPES), 1.750 μL 1 M Glukoz ve 200 μL 1 M NaHCO_3. Son 50 mL hacmine RNase içermeyen su ekleyin.
      NOT: Diseksiyon tampon stoku 4 °C'de altı aya kadar saklanabilir.
   2. Kullanımdan hemen önce, 0,1 g/mL sikloheximid'e 100 μg/mL ekleyin ve buzüzerinde tutun.
3. Yüksek tuz tamponu
   1. 50 mL yüksek tuz tampon stoku yapmak için, 1 mL 1 M HEPES, 8,75 mL 2 M KCl, 500 μL 1 M MgCl₂ve 500 μL % 100 nonylphenyl polietilen glikol(Malzeme Tablosu)rNase içermeyen suya ekleyin.
      NOT: Yüksek tuz tampon stoku 4 °C'de altı aya kadar saklanabilir.
   2. Kullanımdan hemen önce 0,5 μL/mL 1 M DTT ve 1 μL/mL 0,1 g/mL siklohekamid ekleyin. Taze yüksek tuz tamponu buzda saklayın.
4. Düşük tuz tamponu
   1. 50 mL düşük tuzlu tampon stok yapmak için 1 mL 1 M HEPES, 3,75 mL 2 M KCl, 500 μL 1 M MgCl₂ve 500 μL %100 nonylphenyl polietilen glikol ila ve 44,25 Ml RNase içermeyen su ekleyin.
      NOT: Düşük tuz tampon stoku 4 °C'de altı aya kadar saklanabilir.
   2. Kullanmadan önce 0,5 μL/mL 1 M DTT ve 0,1 g/mL siklohekamid 1 0,5 l/mL ekleyin. Taze düşük tuz tamponu buzda saklayın.
5. Doku lysis tampon
   1. 50 mL doku lysis tampon stoku yapmak için 1 mL 1 M HEPES, 3,75 mL 2 M KCl ve 500 μL 1 M MgCl₂birleştirin. 50 mL'lik finale RNase içermeyen su ekleyin.
      NOT: Diseksiyon tampon stoku 4 °C'de altı aya kadar saklanabilir.
   2. 1 tablet/10 mL EDTA içermeyen proteaz inhibitörü, 1 μL/mL 0.1 g/mL siklohekamid, 10 μL/mL RNase inhibitörleri her kullanımdan hemen önce ekleyin. Taze doku lysis tampon buz üzerinde tutun.

3. Antikorların Manyetik Boncuklara Çekimi

1. Antikor
   1. Tüm numuneler için gerekli GFP antikormiktarını hesaplayın ve bir ekstra numune için hazırlayın.
      NOT: Her örnek için her GFP antikordan 50 μg gereklidir.
   2. GFP antikorlarını buzüzerinde eritin ve maksimum hızda (>13.000 x g)4 °C'de 10 dakika boyunca döndürün ve süpernatantları yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
      NOT: Antikor hazırlama adımı boncuk hazırlığından önce yapılabilir ve çözülmüş antikorlar buzüzerinde tutulabilir. Alternatif olarak, bu bölüm manyetik boncuk ve biyotinylated protein L inkübasyonu sırasında yapılabilir.
2. Manyetik boncukları yeniden askıya almak
   1. Manyetik boncukları(Malzeme Tablosu)nazik pipetleme ile yeniden askıya alın.
   2. Her numune için 150 μL manyetik boncuk kullanın. Tüm numuneler için gerekli olan manyetik boncuk hacmini hesaplayın ve bir ekstra hazırlayın. Yeniden askıda asılı manyetik boncukları 1,5 mL veya 2 mL mikrosantrifüj tüpe aktarın. Bir deneme için 1 mL'den fazla gerekirse, toplam tutarı eşit birimlere bölün.
   3. >1 dk için manyetik bir stand üzerinde boncuk toplamak ve supernatant kaldırın. Mikrosantrifüj tüpünü manyetik standdan çıkarın ve boncukları yıkamak için yukarı ve aşağı borular ekleyerek 1 mL PBS ekleyin. >1 dk için manyetik bir standüzerinde boncuk toplamak ve PBS kaldırın.
3. Protein L kaplı boncukların hazırlanması
   1. Her örnek için 60 μL biyotinylated protein L kullanın. L proteini daha önce yeniden askıda ve -20 °C'de depolanırsa, buzdaki L proteinini eritin. L proteini kullanılmadan önce askıya alınmışsa, tüm numuneler için gerekli miktarı alın ve bir ekstra hazırlayın.
   2. Resuspended ve yıkanmış manyetik boncuklar için biyotinylated protein L hesaplanan hacmi ekleyin. 1,5 mL mikrosantrifüj tüp kullanıyorsanız son hacmi 1 mL yapmak için 1x PBS veya 2 mL mikrosentrifuge tüp kullanıyorsanız 1,5 mL ekleyin. Bir tüp rotator üzerinde RT 35 dakika için biyotinylated protein L ile inkübat manyetik boncuklar.
      NOT: Boncuklar biyotinylated protein L ile kuluçka iken antikorlar bu adımda hazırlanabilir.
   3. >1 dk için manyetik bir stand üzerinde protein L kaplı boncuktoplamak ve supernatant kaldırın. Mikrosantrifüj tüpünü manyetik standdan çıkarın ve 1 mL %3 BSA tampon ekleyin ve ardından protein L kaplı boncukları yıkamak için en az 5 kez hafif pipetleme ekleyin.
   4. >1 dk için manyetik bir stand üzerinde kaplamalı boncuktoplamak ve supernatant kaldırın. Yıkama adımlarını %3 BSA ile 4 kez daha (toplam 5 kez) tekrarlayın.
4. Antikor bağlanması
   1. Protein L kaplı boncuklar içine GFP antikorları hesaplanan miktarda ekleyin ve bir tüp rotator üzerinde 4 ° C 1 saat için kuluçka.
      NOT: Antikor kuluçka sonra, yakınlık matris girdap değil özel dikkat edin.
   2. Kuluçka sırasında, tüm numuneler için gerekli olan toplam hacmi hesaplayarak düşük tuz tamponu hazırlayın ve kullanmadan önce düşük tuz tampon stokuna 0,5 μL/mL 1 M DTT ve 0,1 g/mL sikloheximid ekleyin.
      NOT: GFP konjuge boncukların her tüpünü yıkamak için 3 mL düşük tuz tamponu ve GFP konjuge boncukların yeniden süspansiyonu için 200 μL/numune gereklidir. Taze düşük tuz tamponbirkaç saat buz üzerinde tutulabilir.
   3. >1 dk için bir manyetik stand üzerinde yakınlık matris toplamak ve supernatant kaldırın. Afiyet matrisini yıkamak için 1 mL düşük tuz tamponu ve hafifçe pipet ekleyin. >1 dk için bir manyetik stand üzerinde yakınlık matris toplamak ve düşük tuz tampon kaldırın. Yıkama adımlarını 2 kez daha (toplam 3 kez) düşük tuz tamponuyla tekrarlayın.
   4. Düşük tuz tamponundaki boncukları yeniden askıya alın, böylece her numune200 μL yakınlık matrisine sahip olur.
      NOT: Yakınlık matrisi % 0.02 NaN₃ 4 °C'de 2 haftaya kadar saklanabilir. Yakınlık matrisi, yakınlık matrisi 1 hafta dan fazla saklanırsa, yakınlık matrisi 1 hafta içinde veya gece boyunca hazırlanırsa, yakınlık matrisi 3 kez düşük tuz tamponu içinde hızlı bir şekilde yıkanmalı ve 4 °C'de bir tüp rotatörü üzerinde en az 10 dakika süreyle hafifçe askıya alınmalıdır. Bu adımdan sonra protokol duraklatılabilir.
      DİkKAT: Sodyum azit çevre için son derece zehirlidir. Asitlerle temas zehirli gaz üretir. Tüm atıklar uygun bertaraf için toplanmalıdır.

4. Karaciğer Doku Lysis

1. Tampon hazırlama ve ekipman kurulumu
   1. Gerekli mikrosantrifüj tüplerinin sayısını hesaplayın, buz üzerinde etiket ve soğuk.
      NOT: Genellikle her örnek için yedi adet 1,5 mL mikrosantrifüj tüpü gereklidir: Kalan parçalanmış karaciğer için 1, homojenize edilmiş karaciğer lisate'nin 4 mL'si için 4 ve süpernatantların transferi için 2 adet.
   2. Tüm numuneler için gerekli olan toplam hacmi hesaplayarak taze diseksiyon tamponu hazırlayın ve 0,1 g/mL siklohekamid 1 μL/mL ekleyin. Deney boyunca soğuk tutmak için buz üzerinde taze diseksiyon tampon yerleştirin.
      NOT: Her numune için 10 mL diseksiyon tamponu gereklidir.
   3. Tüm numuneler için gerekli olan toplam hacmi hesaplayarak taze lisis tamponu hazırlayın ve 1 tablet/10 mL EDTA içermeyen proteaz inhibitörü, 1 μL/mL 0,1 g/mL siklohekamid ve 10 μL/mL RNase inhibitörlerini ekleyin. Deney boyunca lysis tamponu buz üzerinde tutun.
      NOT: Her numune için 4 mL lysis arabelleği gereklidir.
   4. Doku öğütücüyü(Malzeme Tablosu)ayarlayın, böylece politetrafloroetilen (PTFE)-cam tüpler karaciğer parçalarının homojenizasyonu sırasında buz üzerine yerleştirilebilir. PTFE-cam tüplere 4 mL soğuk lysis tampon koyun.
2. Karaciğer homojenizasyonunun yeniden doldurulma
   1. TRAP vektörü ile enjekte edilen ve onaylanmış hayvan deneysel yönergelerine göre anestezi ve servikal çıkığı ile 1−4 hafta boyunca yeniden doldurulan 8−12 haftalık bir Fah^-/- farenin ötenazisi.
   2. Bir diseksiyon tahtası üzerinde fare yerleştirin ve% 70 etanol ile karın sprey. Çadır cilt ve periton düşük karın forceps kullanarak ve bir enine kesi yapmak için makas kullanın. Geniş bir U şeklinde periton flebi yapmak için makas ile kesmeye devam edin, vissera kesmemeye özen ile. Karaciğeri ortaya çıkarmak için periton flebi göğüs kafesinin üzerine çevirin.
   3. Dikkatle ince makas ve forceps kullanarak karaciğer kaldırmak ve hızlı bir şekilde durulama soğuk diseksiyon tampon doku yerleştirin. Dondurulmuş dokuları homojenize etmek için, istenilen miktarda karaciğer dokusunu, dokuyu eritmeden soğuk lysis tamponu ile PTFE-cam tüplere hızlı bir şekilde taşıyın.
      NOT: Diseksiyon lu doku, diseksiyon tamponu ile yıkandıktan sonra flaş dondurulmuş ve -80 °C'de saklanabilir. Bu adımdan sonra protokol duraklatılabilir.
   4. Bir Petri kabında karaciğer tartın ve karaciğer parçaları 200−500 mg izole ve PTFE-cam tüpler içine hareket. Bir önceden soğutulmuş mikrosantrifüj tüp ve flaş dondurma içine kalan karaciğer dokusu yerleştirin.
   5. 300 rpm'den başlayan motorlu homojenerdeki numuneleri homojenize edin ve hepatositleri karaciğer yapısından en az 5 vuruş la ayırın. Her seferinde cam tüpü düşürün, ancak protein denatürasyonuna neden olabilecek havalandırmayı önlemek için zararlının çözeltinin üzerine çıkmasına izin vermemeye özen inin.
   6. En az 12 tam vuruş için karaciğer dokularını tamamen homojenize etmek için hızı 900 rpm'ye yükseltin.
   7. 1,5 mL mikrosentrifuge tüp başına en fazla 1 mL lysate ile etiketli ve önceden soğutulmuş tüpler içine lysate aktarın. 4 mL lysis tampon kullanılırsa, 1 tüp ve flaş kalan 3 tüp dondurma tutun.
      NOT: Lysates bir sonraki hayvan ın incelenmesi ve taze lysates hazırlanırken 1 saate kadar buz üzerinde tutulabilir. Homojenleştirilmiş karaciğer, lysis adımından sonra dondurulup -80 °C'de saklanabilir. Eğer dondurulmuş lysates kullanılırsa izole RNA%50 azalma olabilir. Bu adımdan sonra protokol duraklatılabilir.
3. Nükleer lysis
   1. 10 dakika boyunca 4 °C'de 2.000 x g'de karaciğeri senttrifüjelayın ve supernatant'ı buz üzerinde yeni, önceden soğutulmuş mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
   2. Son konsantrasyon % 1 nonylphenyl polietilen glikol yapmak ve mikrosantrifüj tüpleri yavaşça ters çevirerek karıştırın% 10 nonylphenyl polietilen glikol süpernatant hacminin 1/9 ekleyin.
   3. Mikrosentrifüj tüplerini hızla aşağı doğru döndürün ve son konsantrasyonu %1 DOC yapmak ve mikrosentrifuge tüplerini yavaşça ters çevirerek karıştırmak için %10 DOC numune hacminin 1/9'u ekleyin. Hızlı bir şekilde mikrosantrifüj tüpleraşağı spin ve 5 dakika boyunca buz üzerinde kuluçka.
   4. 10 dakika boyunca 4 °C'de 20.000 x g'de nükleer lysate'yi santrifüj edin ve supernatant'ı buz üzerinde yeni, önceden soğutulmuş mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
      NOT: Mitokondri tükenen süpernatant, kalan numuneler toplanırken birkaç saat buzun üzerine yerleştirilebilir.

5. İmmünyağış

1. Her tüp için, yakınlık matrisi ile kuluçka sonrası hedef zenginleştirme karşılaştırmak için bir pre-immünopresidasyon kontrolü olarak supernatant toplam hacminin% 1 çıkarmak. İmmünprepitite öncesi kontrolleri, immünopsipitated numunelerin işlendiği gibi, gece boyunca 4 °C'de bir tüp rotatörüne yerleştirin.
2. Her numuneye 200 μL yakınlık matrisi ekleyin. Her numuneye yakınlık matrisi eklemeden önce nazik pipetleme ile boncukları yeniden askıya almaya ekstra özen. Bir tüp rotator üzerinde nazik karıştırma ile 4 ° C gecede yakınlık matris ile lysates incubate.
   NOT: Protokol bu adımdan sonra bir gün kadar duraklatılabilir.

6. RNA İzolasyon

1. Tampon hazırlama ve ekipman kurulumu
   1. Manyetik rafı 4 °C'de en az 30 dakika önceden soğutun ve deney boyunca rafı buzüzerinde tutun.
   2. Gerekli mikrosantrifüj tüplerinin sayısını hesaplayın ve buzda veya 4 °C'de önceden soğutun.
      NOT: Genellikle, her örnek son saflaştırılmış RNA için 1 mikrosantrifüj tüp gerektirir.
   3. Hızlı bir şekilde adım 5.2 tüpler aşağı spin ve en az 1 dakika için manyetik raf üzerine yerleştirerek boncuk toplamak.
      NOT: Sınırsız fraksiyon içeren toplanan supernatant flaş dondurulmuş ve -80 °C'de saflaştırma sonrası transkript zenginleştirme için bağlı fraksiyonu ile karşılaştırmak için saklanabilir. Bu adımdan sonra protokol duraklatılabilir.
   4. Yüksek tuz tampon stokuna 0,5 μL/mL 1 M DTT ve 0,1 g/mL sikloheximid'in 1 μL/mL'si ekleyerek yüksek tuz tamponu hazırlayın.
      NOT: Her numune için 5 mL yüksek tuz tamponu gereklidir.
2. RNA yalıtımı
   1. Kabarcıklar tanıtmadan en az 5 kez nazik pipetleme ardından her tüp için taze yüksek tuz tampon 1 mL ekleyin.
      NOT: Kabarcıklar giriş RNA bozulmasını hızlandırabilir ise yetersiz yıkama bağlanmamış transkript arka planlar tanıtmak olabilir.
   2. >1 dk için manyetik bir stand üzerinde boncuk toplamak ve supernatant kaldırın. Yıkama adımlarını yüksek tuz tamponu yla 4 kez daha (toplam 5 kez) tekrarlayın.
   3. Kalan yüksek tuz tamponu çıkarın ve ısınmak için 5 dakika boyunca manyetik stand ve RT yer mikrosantrifüj tüpleri çıkarın.
   4. Β-mercaptoetanol ile 100 μL likis tampon (RNA izolasyon kitinde sağlanan) boncukları yeniden askıya alın.
      NOT: Denaturant guanidin tiyosiyanat içeren herhangi bir RNA izolasyon ve arıtma kiti yakınlık matris bağlı RNA serbest bırakmak için bir lysis tampon olarak kullanılabilir. Guanidin tiyosiyanat düşük sıcaklıklarda kristalize olduğundan RNA ekstraksiyonu RT'de işlenmelidir.
   5. En yüksek hızda en az 5 s için boncuk ve tampon Girdap, hızlı bir şekilde mikrocentrifuge tüp tarafında tampon toplamak için aşağı spin ve lysis tampon içine boncuk bağlı RNA serbest bırakmak için 10 dakika BOYUNCA RT tampon ile boncuk inkübün.
   6. >1 dk için manyetik bir stand üzerinde boncuk toplamak ve kiti(Tablo Malzemeler)belirtildiği gibi RNA arıtma protokolüne göre hemen RNA temizleme devam etmek için supernatant toplamak.
      NOT: Lysis tamponunda eluted RNA içeren supernatant da erime üzerine RT ısınma tarafından temizlenmeden önce 1 ay kadar -80 °C'de saklanabilir.
   7. İzole RNA maksimum kalite elde etmek için, DNase sindirim ve tüm RNA elüsasyon adımları dahil olmak üzere tüm isteğe bağlı adımları gerçekleştirin. Maksimum RNA geri kazanımı için RNA izolasyon kiti veya RNase içermeyen su tarafından sağlanan elüsasyon tamponu 60 °C'ye ısıtın.
      NOT: İzole RNA -20 °C'de 1 ay veya -80 °C'ye kadar birkaç yıl saklanabilir. Bu adımdan sonra protokol duraklatılabilir.

7. İsteğe Bağlı RNA Kalite Analizi (Önerilen)

1. Yeterli ve yüksek kaliteli RNA elde etmek için immünopredipredasyon prosesinin tekrarlanıp gerekmediğini belirlemek için bir biyoanalizör¹¹ ve spektrofotometre¹² ile miktar kullanarak RNA kalitesini değerlendirin.
   NOT: Yüksek iş elde e-iş leme için en uygun RNA kalitesi, kütüphane hazırlama kitleri ve sıralama platformları tarafından belirlenen protokolleri izlemelidir.

8. Downstream Uygulamaları

NOT: TRAP protokolü tarafından izole edilen toplam RNA, RNA-seq (TRAP-seq) dahil olmak üzere bir dizi standart akış uygulamasında kullanılabilir. Trap'den sonra standart ters transkripsiyon ve nicel PCR protokolleri de kullanılabilir.

1. TRAP-seq için RNA-seq kitaplık hazırlamayı standart yöntemlere göre gerçekleştirin¹³.
2. RNA-seq için, poliainkarlated poli(A) transkriptlerinin oligo d(T)tabanlı zenginleştirmesiyle ticari RNA-seq kitleri kullanarak cDNA dizilimi kitaplıkları hazırlayın. Alternatif olarak, toplam RNA kalitesi poli(A) zenginleştirme için önerilenden daha düşükse, rRNA tükenme modüllerini kullanın. Ancak, sıralamadan sonra daha fazla rRNA hizalama görmeyi bekleyin.

Fah-/- fare, Gfp:Rpl10a füzyonu ve Fah transgenlerin yeniden doldurulmasında gen ekspresyonunu profillemek için transposon içeren plazmid8 (TRAP vektörü) içinde karaciğerlere hidrodinamik enjeksiyon (Şekil 1A). Nitisinone kaldırılması hepatositler için bir seçim basıncı oluşturur toksik bir karaciğer hasarı neden stably yaralı parankim 9 yeniden doldurmak için FAH ifade. İmmünofloresan boyama, karaciğer repopülasyonunun iki hafta sonra hepatositlerin yeniden doldurulmasında FAH ve GFP:RPL10A füzyon proteininin ortak ekspresyonunu doğrular (Şekil 1B).

Aşağıdaki temsili deneyde TRAP-seq quiescent ve repopulating fare hepatositleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir. İlk olarak, quiescent hepatositlerden GFP etiketli ribozomlar elde etmek için, transgenik RosaLSL-GFP-L10A farelere aav8-TBG-Cre enjekte edildi 7 gün önce tüm hepatositlerde GFP:RPL10A ekspresyonu indüklemek için14. Ayrıca, mRNA çevirisinin izolasyonunun spesifik olmasını sağlamak için yabani tip bir fareden toplanan karaciğer örneğini negatif kontrol olarak işledik, bu da RNA'nın yalnızca GFP:RPL10A'yı ifade eden farelerden çıkarılabileceği anlamına gelir. İzole RNA konsantrasyonu füzyon proteinini ifade eden hücre sayısı ile ilişkilidir, quiescent numunesi tüm hepatositlerin GFP:RPL10A'dan sonra AAV8-TBG-Cre enjeksiyonundan sonra en yüksek verimi üreten quiescent numunesi ile ilişkilidir (Şekil 2A). Tersine, ancak herhangi bir RNA GFP:RPL10A transgene yoktu vahşi tip kontrollerde tespit edildi, TRAP prosedürü son derece spesifik olduğunu gösteren ve düşük bir arka plan var. GFP:RPL10A transdükslü hepatosit ile repopülasyon geçiren karaciğer dokusunda TRAP kullanıldığında bol, yüksek kaliteli RNA elde edilmiştir (Şekil 2B). Buna karşılık, negatif kontrol numunesi için biyoanalizör aracılığıyla RNA izi saptanmadı.

Downstream gen ekspresyonu analizi trap-izole RNA üzerinde ters transkripsiyon ve kantitatif PCR veya RNA-seq ile yapılabilir. Gsta1 glutatyon s-transferaz kodlar glutatyon metabolizması için önemli bir rol oynar, oksidatif stres hasarına karşı karaciğeri korumak için ana detoksifiye peptid15. Gsta1 ekspresyonu, heratositlerin yeniden doldurulmasında 10 kat ın üzerinde olarak indüklenirken, giriş RNA eksikliği nedeniyle yabani fareden TRAP-izole RNA değeri saptanmadı (Şekil 3 A). RNA kalitesinin gen ekspresyonu analizini büyük ölçüde etkileebileceğini unutmayın. RNA-seq deneyleri söz konusu olduğunda, RNA kalitesinin değerlendirilmesi kütüphane hazırlama kiti ve sıralama platformunun önerilerine göre yapılmalıdır (Şekil 3B). Bir biyoanalizör genellikle RNA bütünlük numarasını (RIN) belirlemek için kullanılır, genoma mRNA hizalama oranı daha yüksek bir ile ilişkili yüksek RIN ile(Şekil 3B, sol), ribozomal okuma daha yüksek bir oranda giden daha düşük bir RIN ise, gösteren mRNA bozulması (Şekil 3B, sağ). Şekil 3 C,D TRAP-seq quiescent ve hepatosit repopulating diferansiyel gen ekspresyonunu tanımlayabileceğini göstermektedir. Örneğin, Alb ekspresyonu inhibe edilir ve Afp ekspresyonu karaciğer repopülasyonu sırasında düzenlenir, bu da çoğalan hepatositlerin karaciğer metabolik fonksiyonlarını inhibe etmek için daha az farklı bir durum olduğunu yeniden popülasyon9,16.

Şekil 1: Trap'nin Fahile uygulanması-/- profil gen ekspresyonu değişimi olan hepatositlerin yeniden doldurulması. (A) Uyuyan Güzel transposon sisteminde FAH ile GFP:RPL10A füzyon proteinini ifade etme şeması ve ardından Fah-/- fareye enjeksiyon. Yeşil altıgenler, hepatositlerin FAH ve GFP:RPL10A'nın kararlı bir ifadesi ile yeniden doldurulmasını gösterirken, siyah altıgenler yaralı, ölmekte olan hepatositleri temsil eder. (B) Temsili immünofloresan boyama, yeniden popülasyonlanan hepatositlerde GFP etiketli ribozomal protein L10A (yeşil) ve FAH (kırmızı) ortak ekspresyonunu gösterir. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: TRAP yüksek kaliteli RNA hücre tipine özgü izolasyon sağlar. (A) RNA verimi gfp:RPL10A ifade hepatosit sayısı ile olumlu ilişkilidir. Vahşi bir fareden RNA'nın düşük verimi, GFP:RPL10A ifadesi olmadan TRAP'nin kaynaklardan özgüllüğünü gösterir. (B) GFP:RPL10A'yı ifade eden repopülasyonlu karaciğerlerden ve yabani tip karaciğerlerden izole edilen total RNA biyoanalizör izleri TRAP'nin özgüllüğünü gösterir. GFP:RPL10A transgeninden yoksun yabani tip karaciğer dokusundan izole edilen total RNA, minimal RNA toplandığını gösterirken, transgen ekspresdoku yeterli yüksek kaliteli RNA sağlar. Başarılı TRAP10'dansonra ribozomal RNA zirvelerinin mevcut olduğunu unutmayın. FU, floresan ünitesi. RIN, RNA bütünlük numarası. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: TRAP-izole RNA downstream gen ekspresyonu analizi için kullanılabilir. (A) Gsta1'in ters transkripsiyon ve nicel PCR sonuçları quiescent ve repopulating hepatosit. Yabani hayvanlardan izole edilmiş RNA ile Ct değeri saptanmadı. (B) İzole RNA'nın yüksek iş elde li dizileme sonrası hizalama analizi, izolasyon dan sonra RNA bütünlüğünün belirlenmesinin önemini gösterir. Yüksek kaliteli RNA, mRNA okumalarının daha yüksek bir yüzdesi (yeşil), düşük kaliteli RNA ise ribozom okumalarının (kırmızı) çok daha yüksek bir yüzdesine yol açar, çünkü çoğu mRNA bozulur. RIN, RNA bütünlük numarası. (C,D) Entegre Genomik Görüntüleyici (IGV) RNA-seq parça mRNA afinite-quiescent safve(C) Alb ve (D) Afp loci de hepatositler repopulating okur. 3' okuma önyargısının bir poli(A) seçim ardışık hattının tipik bir nedeni olduğunu unutmayın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.