Tatlı Su Midyelerinin Üreme Durumunu ve Larval Gelişimini Karakterize Etmek Için Ölümcül Olmayan Bir Yöntemin Standartlaştırılması (Bivalvia: Unionida)

Summary

Tatlı su midyesinin korunması türlerin üreme kalıplarının ve süreçlerinin izlenmesine bağlıdır. Bu çalışma, solungaç içeriğini örneklemek, larva gelişimini karakterize etmek ve toplanan veriler için dijital bir depo sağlamak için öldürücü olmayan bir protokolü standartlaştırır. Bu protokol-veritabanı paketi, tehlike altındaki türlerin kurtarılmasında midye araştırmacıları için önemli bir araç olacaktır.

Abstract

Nesli tükenmekte olan türlerin zamanlaması, gelişimi ve üreme kalıplarının etkin bir şekilde izlenmesi, popülasyonun geri kazanımı için yönetirken çok önemlidir. Tatlı su midyeleri dünyanın en tehlike altındaki organizmaları arasındadır, ancak erken larva (gloşial) gelişimi ve kuluçka dönemleri hakkında bilgi hala birçok tür için eksiktir. Önceki çalışmalar, dişi midyelerin ev sahibi balıkları parazitleştirmeye hazır olduğu karmaşık yaşam öyküsü aşamasına odaklanmıştır, ancak çok az çalışma larva gelişiminin kuluçka dönemi ve zamanlaması üzerine odaklanmıştır. Burada açıklanan protokol, araştırmacıların kadın midyelerin ciddiyetinin durumunu öldürücü olmayan bir şekilde değerlendirmelerine olanak sağlıyor. Bu çalışmanın sonuçları, bu yöntemin bir kadın midyenin örnekleme yapıldıktan sonra tekrar gravid kalma veya gravid olma yeteneğini etkilemediğini göstermektedir. Bu yöntemin avantajı federal tehdit veya nesli tükenmekte olan türler veya yüksek koruma endişe diğer popülasyonlar üzerinde kullanılmasına izin verebilir. Bu protokol hem korunmuş hem de canlı bireylerde kullanılmak üzere uyarlanabilir ve çeşitli midye türleri üzerinde test edilmiştir. Sağlanan veritabanı üreme alışkanlıklarının zamanlaması hakkında bilgi genişliği için bir depo ve gelecekteki tatlı su midye araştırma, koruma ve kurtarma çabalarını kolaylaştıracaktır.

Introduction

Tatlı su sistemlerinde nüfusun kalıcılığı üreme ve işe alım başarısına bağlıdır. Parazitorganizmalar için, yaşam döngüsünün inceliklerini belirlemek (örneğin, larva gelişim aşamaları ve ev sahibi çekim stratejileri) bir organizmanın üreme alışkanlıkları ve işe alımları etkileyen kritik süreçler hakkında fikir verebilir. Bu tür bilgiler, türler tehlike altında yken ve geri kalan popülasyonları sürdürmek için başarılı bir işe alıma ihtiyaç duyulduğunda veya iyileşme nin, açığa çıkarılan popülasyonların yeniden oluşturulması için esir yayılımı kullanımını gerektirmesi halinde önemlidir.

Tatlı su midye (Bivalvia: Unionida) dünya çapında organizmaların en tehlike altındaki gruplarından biri olarak kabul edilir ve türlere özgü üreme alışkanlıkları nın bir derleme araştırma çabalarına yardımcı olabilir^{1,2,3 ,4,5}. Dünya çapında dağıtılan 800'den fazla tanınan türler ile, tatlı su midye Kuzey ve Güney Amerika'da çeşitlilik hotspots var ve güneydoğu Asya ama temel yaşam öyküsü bilgileri birçok tür için bilinmemektedir^{2, 5,6,7}. Bu sırada aileler bir ev sahibi⁷eki sırasında serbest yaşayan gençler içine metamorfoz tam parazitik larva aşamaları sahip karakterizedir 7^,8. Bu eşsiz yaşam öyküsü aşaması, şu anda kriz^9'daolan tatlı su sistemlerindeki biyolojik çeşitliliğe katkıda bulunmaktadır. Imperilment yüksek düzeyde su yollarının kirliliği de dahil olmak üzere birçok antropojenik tehditlere atfedilebilir, habitat değişikliği ve imha, ev sahibi balıkların bolluğu ve çeşitliliğinde azalma, ve istilacı türlerin giriş^{1, 10.} Bentik filtre besleyiciler olarak, midye substrat içine yuva ve havza içine drenaj kirleticiler ve kirleticiler^{duyarlıdır 11}. Onlar karbon tutma, bir besin kaynağı ve filtre besleme¹¹tarafından su arıtma dahil olmak üzere ekosistem hizmetleri, geniş bir yelpazede sağlamak gibi midye türlerinin kurtarma ile ilgilidir. Buna ek olarak, midye ekosistem sağlığını göstermek için bulunmuştur, biyolojik çeşitliliği teşvik, ve sırayla, bir ekosistemin esnekliğini artırmak¹².

Birçok tatlı su midyesi çalışmaları daha iyi tür durum değerlendirmeleri ve yönetim stratejileri bilgilendirmek için erken yaşam geçmişi gereksinimlerini araştırmaya odaklanmıştır. Tatlı su midye aileleri bu çalışma ile ilgili (örneğin, Hyriidae, Margaritiferidae, Unionidae) benzersiz bir yaşam öyküsü stratejisi var nerede kadın kuluçka larvaları (glochidia) kendi keseli solungaç8. Çeşitli stratejiler sayesinde, kadın midye glochidia ile bir omurgalı konak parazitize keseli solungaçlardan olgun glochidia sınırdışı¹³. Solungaçlar içinde gloşial gelişim üzerine araştırma canlı midye gonadal sıvı örnek ve gamet üretimini değerlendirmek için hipodermik şırınga kullanan bir teknik değiştirildi^14,15,16. Araştırmacılar gonad örnekleme için bu öldürücü olmayan metodoloji doğruladı gibi, kuluçka gelişimi 15 ,¹⁶değerlendirmek için keseli solungaç örnekleme için uyarlanmıştır. Bazı midye türleri glochidia'yı sadece dış iki solungaçta (ektobranchus), sadece iç iki solungaçta (endobranchus) veya dört solungaçta (tetrabranchus) kuluçkaya yatarak çözebildiği için, broogenetik ilişkileri çözmek için kullanılabilir, ancak bu özellik her tür için bilinen¹⁷. Kuluçka desenleri daha önce ister kadın midye brood glochidia kış (bradytictic) veya yaz (taşitik)¹⁸kısa bir süre için olup olmadığını midye türlerini sınıflandırmak için kullanılmıştır . Midye kuluçka üzerinde kışlama Anodonta üreme döngüsü¹⁹çalışıldığında desteklendi. Ancak, temel üreme biyolojisi yıllar içinde daha ayrıntılı olarak çalışıldı ve bu ikilem brüt bir genelleme ve bazı türlerin kuluçka dönemleri başlangıçta 20 ,²¹tahmin çok daha karmaşık olduğunu bulundu . Örneğin, Hyridella (Hyriidae familyası), Glebula ve Eliptik (Unionidae familyasından) türleri üreme mevsimi^{22,23, 24. yıl.} Türlere özgü karmaşıklığı, ve hatta bazen nüfusa özgü²⁰, üreme alışkanlıkları zamanlaması ve kuluçka süresi hakkında bilgi bir boşluk yol açmıştır, ve bir dişi midye üretebilir kuluçka sayısı.

Hipodermik şırıngalar solungaç içeriğini ayıklamak için kullanılmış olsa da, tüm çalışmalarda karşılaştırılabilir sonuçlar sağlamak için standardizasyon eksikliği nedeniyle sonuçları raporlama karmaşıktır. Daha önce, glochidia dört gelişimsel aşamaları (yani, yumurta, embriyo, olgunlaşmamış, tam gelişmiş) Unionidae tespit edilmiştir ama standart prosedür^16,25,26kabul edilmemiştir . Margaritiferidae üyelerini gözlemleyerek diğer çalışmalar 'gelişmekte olan glochidia' ile 'olgunlaşmamış glochidia' sınıflandırılması yerine var, potansiyel karışıklığa yol açan^27,28. Farklı larva gelişim aşamalarını karakterize etmede tutarlılık eksikliği, kuluçkaya yakan dişileri genel olarak larva gelişiminin inceliklerini kapsamayan 'gravid' olarak tanımlamak için birçok araştırmacıyı bırakmıştır. Ev sahibi-balık denemeleri yürüten yaşam öyküsü çalışmaları tam gelişmiş glochidia ile gravid kadın için ihtiyaç öncelik var, ama bu bilgiler yayınlanmış ve yayınlanmamış literatür²⁹,³⁰boyunca dağınık . Şu anda, veriler yumurta arasındaki geçiş zamanlaması da dahil olmak üzere birçok midye türlerinin üreme alışkanlıkları hakkında eksik, olgunlaşmamış glochidia, ve tam gelişmiş glochidia ev sahiplerine bağlanmaya hazır. Çoğu tür için dişilerin glochidia'yı ne kadar süre kuluçkaya yaradığı ve döllenmiş yumurtaların ne kadar çabuk geliştiği belirsizdir. Bilgi boşlukları genellikle koruma endişe türleri için daha geniştir, hangi öldürücü olmayan etkileri için test edilmiştir ve ek olarak bilimsel topluma teşvik edilebilir solungaç içeriğini ayıklama standart bir yöntem için ihtiyaç sunar korunan popülasyonlar için bir tehdit oluşturmadan genel veri toplama metodolojileri^24,31,32.

Bu çalışmanın üç amacı vardı: 1) bir solungaç örnekleme tekniğini resmileştirmek ve kadın midyeler üzerinde öldürücü ve öldürücü olmayan etkiler için test etmek, 2) gloşial gelişimin farklı aşamalarını karakterize etmek ve standartlaştırılmış bir tanımlama yöntemitanımlamak ve tanımlamak çeşitli larva aşamaları raporlama ve 3) toplanan veriler için bir kamu deposu oluşturmak. Saha etütleri, uzun vadeli izleme projeleri ve müze koleksiyonları, burada açıklanan protokolün uygulanması ve daha geniş bir ilgi alanı için ek verilerin toplanması için fırsatları temsil etmektedir. Formalize protokol larva gelişiminin her aşamasında farklılaşmak için görseller ve karakter açıklamaları içerir. Kategoriler standartlaştırılarak, toplanan sonuçlar tüm oluşumlar ve türler arasında karşılaştırılabilir. Veriler toplandıktan sonra, tüm tatlı su Midyesi Gravidity Almanac (FMGA), bu protokol kullanılarak toplanan gravidity bilgi için bir veritabanı gönderilebilir. Toplanan tüm yerçekimi bilgilerini depolamak ve derlemek için nihai bir ürün gelecekteki araştırma, koruma ve kurtarma çabalarını kolaylaştırmak için bir araştırma aracı sağlayacaktır. Bu metodolojinin çeşitli midye projelerine dahil edilmesi ve verilerin FMGA'ya sunulması yıl boyunca midye türlerinin ağırlık durumu ile ilgili bilgi nin genişliği ne kadar genişolacaktır. Son derece tehlike altındaki bir organizma grubu olarak, tatlı su midyelerinin üreme alışkanlıkları na ilişkin bu protokol ve ortaya çıkan veri tabanı, popülasyon dinamiklerini anlamak ve bu türlerin korunmasını kolaylaştırmak için gereklidir.

Protocol

1. Gravid kadın koleksiyonu

NOT: Balık ve Yaban Hayatı Servisi'nin Tatlı su midyesi Anket Protokolü^33'e, tehdit altındaki veya nesli tükenmekte olan türler için bir örnekleme alanının nasıl yeterince inceleneceklerine ilişkin rehberlik için başvurun. Korunan türlerin alan koleksiyonundan önce uygun federal izinler alınmalıdır ve mevcut tüm türler için devlet izinleri.

1. Dokunsal-görsel yöntemler (adım 1.2) kullanarak sahadan canlı midye toplamak veya bir müzeden korunmuş örnekleri kullanmak (adım 1.3).
   NOT: Kurutmayı önlemek ve stresi azaltmak için canlı midyeleri toplama dan sonra serin ve ıslak tutmak önemlidir ve gravid midyelerin minimum kullanımı, kadınların solungaç içeriğini erken bırakmalarını önlemek için önemlidir³⁴.
2. Kadın ciddiyetini, toplama sırasında görsel denetim (örn. manto lure, conglutinates, vb.) veya toplama sonrası görsel muayene ile (örn. içeri ye bakacak kadar açık vanaları hafifçe gözetleyerek ve solungaçların şişirilmiş olup olmadığını görmek, Şekil 1).
   NOT: Türler bazen sadece iki dış solungaç (ektobranchus), sadece iki iç solungaçları (endobranchus) veya dört solungaçlar (tetrajen) keseli¹⁷olarak keseli solungaçlar içinde kuluçka nasıl glochidia değişir . Protokol burada duraklatılabilir ve gravid dişiler solungaç örneklemesi için laboratuvara geri taşınabilirler.

Şekil 1: Yavaşça meraklı bireyler açık. Canlı bir midyenin çekim gücüolup olduğunu kontrol etmek için, başparmakları(A)ile vanaları yavaşça açın veya vanaları açmak için bir spekulum veya ters pliers kullanın(B). Bu yöntemle ilişkili uyarılar için protokoldeki adım 2.3'ün gözden geçirin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

3. Vanaları açarak ve bireyin gravid dişi olup olmadığını belirlemek için solungaçları inceleyerek korunmuş numuneler üzerinde görsel bir inceleme yapın(Şekil 2).

Şekil 2: Gravid dişi nasıl tanımlanır. Dişi midye keseli solungaçlar dişi gravid ve kuluçka olduğunda şişirilmiş görünür. Fotoğraflar A ve C yanal bir perspektiften solungaçları gösterirken, B ve D fotoğrafları solungaçların ventral görünümünü sağlar. Kırmızı kutular solungaçları bir gravid (A / B) ve gravid (C / D) kadın Lampsilis straminea midye arasındaki farkları vurgulamak için anahat. Bireylerin toplam uzunlukları 79 mm (A/B) ve 88 mm (C/D) 'dir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

2. Solungaç içeriği örneklemesi

NOT: Bu protokol, numune almanın tarla ve laboratuvardaki canlı midyelerde mi yoksa korunmuş numunelerde mi gerçekleştiğine uyarlanabilir.

1. Solungaç içeriği³⁵ veya etanol (EtOH) 24 saat içinde değerlendirilecekse veya 24 saat içinde numune değerlendirmesi yapılmıyorsa veya solungaç varsa, steril su yaklaşık 1 mL'lik 1,5 mL plastik mikrosantrifüj toplama tüpü hazırlayın içeriği EtOH'ta muhafaza edilen bir müze numunesinden dir. Glochidia tarama elektron mikroskobu (SEM) görüntüleme için tasarlanmıştır, kullanmak 70% EtOH, ve glochidia genetik test için kullanılacaksa, non-denatüre% 95 EtOH³⁶kullanın.
2. 10 mL şırınga üzerinde bir steril 20 G yontucu ucu iğne için kağıt ambalaj çıkarın. İğneyi ortaya çıkarmak için kapağı sökün ve solungaç içeriği nin toplanması için 1,5 mL plastik bir tüp hazırlayın. Siyah stoper 0 mL/cc çizgisinde olacak şekilde şırınganın sapını aşağı doğru itin.
   NOT: Solungaç içeriği her örnekleninher bir zaman steril bir şırınga kullanılmalıdır. Kullanılmış bir şırınga, ucunu çamaşır suyu çözeltisine batırarak, daha sonra 1 mL steril su ile doldurarak ve pistonu 0 mL/cc'ye kadar bastırarak ve son olarak şırıngatemiz bir bezle kurutularak sahada sterilize edilebilir.
3. Gravid dişi almak ve yavaşça başparmak ipuçlarını kullanarak iki vanaları açın.
   DİkKAT: Hayvana zarar vermemeye dikkat edin. Vanaların çok geniş veya çok hızlı açılması addüktör kasları aşırı genişletebilir ve mortaliteye neden olabilir. İnce kabuklu numuneler (örneğin, Anodontatürleri, Leptodea, Utterbackia,vb.) ve genç bireyler bu adımda özellikle savunmasızdır. Kırılgan kabuklu türleri zorla işlemek kabukları kırabilir ve ölüme neden olabilir. Bazı durumlarda, ön ve arka kabuk kenarlarından ince kabuklu hayvanların sıkılması, ventral yüzeye bakarken, kabuğun hafifçe esnemesine ve boşluk almasına neden olur, böylece bir tanesisolungaçları gözlemlemek veya kabukları gözetlemek ve kırılgan lara zarar vermekten kaçınır. kabuk marjı.
   NOT: Araçlar bu adıma yardımcı olmak için kullanılabilir, ancak dikkatli kullanılmadığı takdirde mortaliteye de neden olabilir ve mümkün olduğunca kaçınılmalıdır. Örneğin, bir spekulum veya değiştirilmiş ters parke seti, tek tek açık gözetlemeye yardımcı olmak için kullanılabilir ve vanaların açılmasına yardımcı olmak için bir kama kullanılabilir. Başka bir kişi yardımcı olmak için kullanılabilir ise bu aletler gerekli olmayabilir (yani, bir kişi hayvan açık tutar ken başka bir çıkarma için şırınga manevralar). Manto dokusunun periostracumdan zarar görmesi veya ayrılması büyüme deformitelerine ve mortaliteye neden olabilir^37; bu nedenle, manto dokusu ve kabuğun dış marjı arasındaki bağlantıyı kesmeyi önlemek için önemlidir.
4. Şırınganın iğne ucunu kullanarak şişirilmiş keseli solungaçtaki tek bir su tüpünü nazikçe delin. Daha sonra, yavaşça iğne eğimli ucu kullanarak solungaç içeriğini dışarı kepçe.
   NOT: Solungaç içeriği genellikle iğnenin yontma ucunda görülebilmesi gereken sütbesi-beyaz bir kıvama sahiptir.
   1. Bir mikroskop hazır ise şırınga içeriğini doğrudan bir Petri kabına yatırın. Aksi takdirde, içeriği daha sonra değerlendirme için belirlenmiş sıvı (bkz. adım 2.1) ile 1,5 mL plastik mikrosantrifüj tüp içinde saklayın.
      NOT: Hasar ve azaltılmış canlılık önlemek için taşıma sırasında glochidia örneklerinin rahatsızlık ve işleme en aza indirmek^32,35.
5. Cins-türlerin tanımlanması, ağırlık durumu, dişi nin uzunluğu (mm), kollektör ve iletişim bilgileri, eyalet, ilçe, drenaj, belirli toplamayeri, enlem ve boylam, solungaç için benzersiz bir tanımlayıcı hakkında kayıt bilgileri örnek, anket sitesi için benzersiz bir tanımlayıcı ve solungaç içeriği ayıklanırsa toplama tarihi(Şekil 3). Taşıma sırasında doğru veri kayıtlarını sağlamak için her toplama gemisine benzersiz bir tanımlayıcı kaydedin.
   1. Kimlik doğrulama için midyenin dış sağ valfini fotoğraflayın ve resimde okunaklı benzersiz tanımlayıcı ile etiketlenmiş tüpü ekleyin. İsteğe bağlı olarak, midyenin bulunduğu çevre ve topluluk hakkındaki bilgileri tamamlamak için diğer abiyotik ve biyotik parametreleri toplayın (öneriler için Şekil 3'e bakın).

Şekil 3: Alan gravidity veri sayfası örneği. Güvenilir bilgi üretmek için solungaç örneği alınırsa doğru veri raporlaması gereklidir. Bu, her solungaç örneğiyle birlikte toplanacak minimum alanları ve ekstra abiyotik parametreleri içeren bir alan veri sayfası örneğidir. Daha kapsamlı bilgi için protokoldeki adım 4.1'e bakın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

3. Solungaç içeriğinin laboratuvar dadeğerlendirilmesi

1. Solungaç içeriği 1,5 mL'lik bir tüpteyse, bunları petri kabına aktarın ve kabın altını suyla doldurun. Petri kabını, numunenin daha konsantre bir görünümü için kabın ortasındaki içeriği toplamak için dairesel bir hareketle yavaşça döndürün.
   NOT: 1,5 mL'lik tüpün, solungaç içeriği tüp duvarlara yapışıyorsa, fışkırtma şişesi veya su dolu transfer pipet kullanılarak dışarı atılması gerekebilir.
2. Petri kabını, numuneyi değerlendirmek için bir kesme mikroskobunun altına yerleştirin. Mümkünse, solungaç örneğinin bir fotoğrafını mikroskop altında alın ve bu örnek için benzersiz tanımlayıcıyla etiketlayın.
   1. Her solungaç örneğinde hangi gelişim evrelerinin mevcut olduğunu kaydedin. Her gelişim evresini karakterize etmek için Şekil 4'i bir kılavuz olarak kullanın. Bazı durumlarda, dişiler birden fazla gelişimsel aşamada larvakuluçka olabilir; bu nedenle, belirli bir örnekte gözlenen her gelişim evresinde (örneğin, 'EGG/DG/IMG/FDG') rapor edin. Korunmuş glochidia değerlendirildikten sonra bölüm 4'e geçin. Tam olarak geliştirilmiş glochidia tespit edilirse ve EtOH korunmak için kullanılmamışsa, adım 3.3'e geçin.
      NOT: YUMURTA, yumurta kütleleri; DG, glochidia gelişmekte olan; IMG, olgunlaşmamış glochidia; FDG, tamamen gelişmiş glochidia.

Şekil 4: Keseli solungaçlarda gloşidia gelişiminin çeşitli aşamaları için temsiller. (A) Yumurta kütleleri (YUMURTA) yumurtaları bir araya getiren bir zara sahiptir. Her yumurta zarının içinde farklılaşma hücrelerinin opak küresel kütlesi vardır. Opak küresel kütle erken hücre bölünmesi sırasında birden fazla küresel kütleye bölünebilir, ancak farklı bir bivalve şekli gözlemlenene kadar yumurta olarak kaydedilmelidir. (B) Olgunlaşmamış gloşidia (IMG) yumurta zarı içinde bulunan farklı bir bivalör şeklinde kütleye sahiptir. (C) Gelişen gloşidia (DG) farklı bir bivalve şekli var, hiçbir yumurta zarı, ve düzensiz doku içinde, genellikle görünümü bulanık. Gelişen gloşidia (DG) NaCl maruz kaldığında reaktif değildir ve veriler kaydedildiğinde 'DG(T)' olarak sınıflandırılır. (D) Tam gelişmiş glochidia (FDG) glochidia kapatmak için izin belirgin bivalve şekli ve belirgin adductor kas dokusu var. Tam gelişmiş glochidia (FDG) genellikle koruma dan sonra iki açık vana olarak gözlenir. İki açık valf genellikle nacl maruz kaldığında kapalı snap snap, ya da snap open ve kapalı, NaCl maruz ve 'FDG(T)' olarak sınıflandırılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

3. Solungaç numunesinin bir alt kümesi damlacığına NaCl kristali ekleyerek tam olarak geliştirilmiş glochidianın canlılığını daha fazla değerlendirmek için sodyum klorür (NaCl) testi yapın³⁵. Canlı glochidia açık bir konumdan vanaları kapatarak NaCl yanıt verecektir. Veriler kaydedildiğinde, atamanın sonunda tuz testiyapılan glochidia'yı '(T)' ile bildirin.
   NOT: Tam gelişmiş glochidia da aktif olarak Açık ve NaCl maruz kalmadan kapalı yapışma görülebilir.

4. Veritabanına rapor

1. Çevrimiçi yazılım programları kullanılarak geliştirilen FMGA web (http://arcg.is/089uee),^38,39,40erişin. FMGA sayfası, masaüstü veri giriş formuna ve mobil cihazlar için uygulama indirmeye bir bağlantı sağlar. Mobil uygulama alanında veri girişi ve otomatik georeferencing⁴¹sağlar.
   NOT: Tatlı su midyesi türleri yaşam öyküsü olayları ile ilgili gravidity takvim ve diğer grafikler de FMGA Pano bulunabilir.
   1. Açılan menüler ve metin giriş alanları kullanarak veri giriş formundaki sonuçları kaydetmek için mobil uygulamayı veya masaüstü sitesini kullanın. Büyük, önceden varolan veri kümeleri için şablon elektronik tablosu için yazarlara başvurun. Elektronik tablodaki her kaydın veya satırın bir gravid bireyden gelen solungaç örneğinin gözlemlerini temsil ettiğini göz önünde bulundurarak, kayıtlı verileri uygun sütun başlıklarının altına girin.
   2. Sonuçları gönderin ve daha fazla ayrıntı veya fotoğraf istemek için toplayıcıile iletişime geçebilecek bir yönetici tarafından doğrulandıktan sonra FMGA veritabanına eklenir.
      NOT: Veriler FMGA veritabanında doğrulanıp derlendikten sonra, FMGA panosunda görüntülenen tüm gravidity takvimleri ve diğer etkileşimli grafikler güncellenir.

Results

Bu protokol, Ocak 2015 ile Aralık 2015 tarihleri arasında Bruce Creek'in (Walton County, Florida) 750 m^2'lik bölümünde tatlı su midyesi topluluğunu izleyen bir yakalama işareti yakalama çalışması sırasında uygulanmıştır. Alan örneklemesi her dört haftada bir gerçekleşecekşekilde planlandı; ancak, yüksek akışlı olaylar nedeniyle örnekleme 2015'in Nisan veya Eylül aylarında gerçekleştirilmemektedir. ABD Jeolojik Araştırma, ABD Balık ve Yaban Hayatı Servisi ve Florida Balık ve Yaban Hayatı Koruma Komisyonu da dahil olmak üzere devlet ve federal kurumlar saha araştırmaları ve solungaç örnekleme yardımcı oldu. Anket sırasında karşılaşılan her gravid dişi, yukarıda açıklanan protokol kullanılarak alan içi solungaç içeriği örneklemesine tabi tutulmuş, etiketlenmiş (Bkz. Malzemeler Tablosu)

Discussion

Önemi

Tehlike altındaki türlerin korunması, günümüze kadar ukala popülasyonlarda başarılı bir şekilde işe alınmasına bağlıdır. Bazı durumlarda, yapay yayılma bu risk altındaki popülasyonların işe artırmak için gerekli olabilir. Bu, araştırmacıların her tür için aktif üreme nin zamanlaması hakkında bilgilendirilmeleri ve işe alımüzerindeki etkiyi azaltmak için farklı metodolojiler veya yönetim uygulamaları uygulamalarını gerektirir. İmkansız bir organizma grubu olarak, üreme alışkanlıklarını incelemek için standart ve öldürücü olmayan bir yaklaşım oluşturmak ve bilimsel topluluğu en güncel şekilde bilgilendirmek için verileri derleyip görselleştirecek bir platform oluşturmak çok önemlidir. bilgiler mevcuttur. Bu çalışma, önlemlerin alınmasını sağlamak için adım adım protokol sağlar ve solungaç içeriği dişi midyelerden yeterince örneklenebilir ve değerlendirilebilir. Bu protokol, araştırmacıların ve yöneticilerin bu metodolojiyi sorumlu bir şekilde uygulamasına olanak tanıyan ölümcül ve öldürücü olmayan etkiler için test edilmiştir. Ayrıca, kamuya açık, kullanıcı dostu bir panoda yer çekimi bilgilerinin derlenmesini kolaylaştırmak için bir veritabanı yönetim araçları ve uygulamaları paketi geliştirdik. Epidemiyoloji, gloşidia morfolojisi, yaşam öyküsü, filogenetik, yayılma ve translokasyonlar üzerine yapılan çalışmalar, tüm tatlı su midye türleri için zamansal gravidity bilgi deposundan yararlanabilir ve kullanabilir.

Bu çalışma tek başına bazı türlerin üreme alışkanlıkları önceki çalışmaların bulgularını destekledi ama aynı zamanda diğerleri hakkında yeni bilgiler ortaya koydu. V. vibex V. lienosadaha az sayıda toplanmış olmasına rağmen, benzerlikler ağırlık verileri dayalı ikisi arasında bulunabilir. Villosa her iki tür yılın büyük bir bölümünde tam olarak gelişmiş glochidia kuluçka gibi görünüyor, hangi bir overwintering kuluçka olarak karakterize. Bu diğer Villosa türleri üzerinde önceki çalışmalar ile tutarlı^{dır 43,44,45}. Bu çalışmanın sonuçları H. australis Ekim ve Haziran içine overwintering gravid bulunabilir öneririz, Aralık ayında gravid hiçbir yakalama lar bulunamadı dışında. Daha önce yayınlanmış bir çalışmada dört aylık bir gravidity dönemi ile congener H. altilis tespit, Mart ile Haziran^46,47. Bu bulgu, daha önce düşünülenden daha uzun bir gravidity dönemini göstermektedir ve genellikle h. australis'i kışı süren bir kuluçka olarak gruplandırmaktır. Federal olarak korunan türler olarak, H. altilis ve H. australis için değişen kuluçka dönemleri, üreme açısından aktif zamanlarda popülasyonları daha iyi korumak için yönetim kararlarını etkileyebilir. Eliptik pullata sadece Çok kısa bir kuluçka dönemi^24,48,49ile taşitik bir tür olarak karakterizasyonu karşılık gelir Mayıs ve Haziran aylarında YUMURTA ile gravid bulundu^{, 50.} Bu protokol kullanılarak Eliptik türleri hakkında veriler derlendiğinden, gloşidia yılın sadece birkaç ayı bulunduğundan, belirli gloşidiyal gelişim aşamaları hedeflendiğinde ayrıntılı bilgiler saha çabalarını daha verimli hale getirebilir. Daha düşük örneklem boyutlarına sahip diğer türlerden çıkarım sınırlıdır ancak veriler veritabanında derlendikçe, daha yüksek örneklem boyutları ek midye türlerinin üreme alışkanlıkları hakkında bilgi verecektir.

Usul yorumları

Tatlı su midye ve glochidia antropojenik stres duyarlı olduğu bilinmektedir^10,35. Gravidity muayene sırasında, midye vanaları açmak kolay olmayabilir, ve dikkatsizce vanaları açık zorlamak kasıtsız zarar alabilirsiniz ve stres veya mortalite neden olabilir. Bazı kırılgan kabuklu türler (örneğin, Anodontatürleri , Leptodea, Utterbackia,vb) ve küçük boyutlu bireyler kolayca kırılabilir ve gözyaşı çok kırılgan kabukları ve zayıf addüktör kasları olabilir. Solungaç örneklemesi, elleçleme sorumlu ve dikkatli bir şekilde yapılmazsa bir stres kaynağı olarak kabul edilebilir. Bir önceki çalışmada, üreme aktif zamanlarda midye işleme ve havadan maruz kalma solungaç içeriğinin erken salınımı da dahil olmak üzere çeşitli fizyolojik strese neden olabilir bulundu³⁴. Ancak, burada açıklandığı gibi benzer bir metodoloji kullanan bir çalışmada, solungaç örnekleme sırasında gravid kadın midye işleme mevcut kuluçka kesmedi bulundu ya da hem kısa hem de uzun vadeli kuluçka türleri erken salınıma neden¹⁶. Ayrıca, bu protokol sırasında birden fazla kişinin solungaçlarını delerken istenmeyen bir enfeksiyonu veya çapraz kontaminasyonu önlemek için steril bir şırınga kullanılmalıdır. Ayrıca, glochidia kırılgan ve kuluçka olgunlaşmış ve stresli ama sınırdışı değil olabilir. Kötü sağlık olgun glochidia daha az kişi tuz testleri tepki neden olabilir³⁵. DG(T) ve FDG(T) ayrımı yaparken, büyük bir örneklem büyüklüğü ile tuz testi yapmak, bu çalışmada sağlanan açıklamaları kullanarak DG ve FDG glochidia arasındaki ayrımları dikkatlice belirlemek için gözlemler üzerine notlar almak önemlidir. Uygun bakım alındığında, bu prosedür tarafından indüklenen minimal stres kadın midye doğal olarak glochidia kuluçka devam etmek ve nüfus işe üzerindeki etkilerini azaltmak için izin verebilir.

Ek veriler veritabanını tamamlamak ve tatlı su midyeüreme alışkanlıkları için geniş bir bağlam sağlamak için kaydedilebilir. Bazı türler (örneğin, Fusconaiatürleri ), glochidia⁵¹geliştirme aşamasına göre farklı renklerde solungaçları olduğu gözlenmiştir. Dişinin ilk gravidity kontrolü sırasında, gelecekteki araştırma için izin vermek için bildirilen verilere solungaç renginin bir açıklaması dahil edilebilir. Ayrıca, protokolün bu noktada, araştırmacılar kuluçka kadın iki dış solungaçları (ektobranchus), iki iç solungaçları (endobranchus) veya dört solungaçları (tetragenous)¹⁷kuluçka glochidia bulundu olup olmadığını fark edebilirsiniz. Bu bilgiler FMGA'ya eklenebilir ve araştırılan her tür için kuluçka ya da veri boşluklarının doldurulmasına yardımcı olur. Çevre koşulları, özellikle su sıcaklığı, çeşitli enlem aralıklarında türlerin ağırlık durumu ve zamanlaması daha kapsamlı bir gözlem için toplanabilir ve alanında kaydedilebilir. Araştırmalar, sıcaklık, fotoperiod, akış hızı ve gıda durumu gibi çevresel parametrelerin tatlı su midyelerinde üreme olaylarına neden olabileceğini göstermektedir^{52,53,54,55 ,56}. Ağırlık ları etkileyen abiyotik faktörler üzerinde gelecekteki araştırmaları desteklemek üzere gönderildiğinde veritabanına ek alanlar eklenebilir. Çalışmamızdan sonra modellenen bir yakalama-işaretleme-yeniden yakalama modifikasyonu da bu protokole eklenebilir, bu da araştırmacıların belirli bir midyenin üreme alışkanlıklarını izlemelerine ve yılda birden fazla kuluçka hakkında bilgi ortaya çıkarmasını sağlar.

FMGA'daki bilgilerin doğruluğu kaynağa bağlıdır. Örneğin, tatlı su midyelerinin yanlış tanımlanması, benzer dış özelliklere sahip birçok türün^57. Yanlış tanımlanmış bir kişiden alınan solungaç örneği, bir türün kuluçka dönemi için kafa karışıklığı ve yanlış bilgi oluşturabilir. Solungaç örneği alınırsa, her iki vananın içinde (birey hayatta değilse), sağ vananın dışında ve umbo (iki vananın bağlandığı menteşe) fotoğraf çekilmeli ve masaüstü sitesi veya mobil uygulama üzerinden ağırlık verileri ile gönderilmelidir. Biz de solungaç içeriğinin fotoğrafları edilir. Gönderim formlarında, toplayıcının türlerin tanımlanmasına ilişkin güven düzeylerini belirtmesini sağlayan bir açılır menü bulunmaktadır. Kayıt onaylanmadan önce, bu bilgiler makul dağılıma karşı kollektör tanımlaması kontrol edilirken vb. dikkate alınacaktır. Unionidae türlerinde intraspesifik morfolojik varyasyonun yüksek derecede olması nedeniyle doku örneklerinin sunulması teşvik edilir ve moleküler tanımlamayı kolaylaştırmak için gerekli olabilir.

Gelecekteki etkileri

Öldürücü olmayan bir yöntem olarak, bu protokol hem yaygın hem de tehlike altındaki türlere uygulanabilir. Tehlike altındaki türler için yer çekimi takvimleri, türlerin üreme açısından aktif olduğu dönemler hakkında bilgi vererek, nesli tükenmekte olan türler mevzuatı ve kurtarma planlaması ile ilgili koruma yöneticilerine yardımcı olabilir. Risk altındaki türleri yöneten eyalet ve federal kurumlar, türlerin savunmasız olmadığı ve üremedığı zamanlar için izin tahsisini daha iyi tavsiye edebilir ve hatta midyelerin tam olarak gelişmiş glochidia'yı kuluçkaya yaradığı zamanlarda ev sahibi balıkların hasatını sınırlandırabilirler. Ayrıca, saha araştırmaları işe alım süreçlerine etkisini en aza indirmek için üreme dışı dönemlerde türleri hedefleyebilir. Kamuya açık veritabanı, FMGA, araştırmacılar ve yöneticiler için herhangi bir hedef tatlı su midye türleri hakkında önemli üreme bilgileri elde etmek için bir araç sağlar. Veritabanı ayrıca veri boşluklarını vurgulayarak türe özgü kuluçka kalıpları üzerinde daha fazla araştırma yapılmasını teşvik edecektir. Bir tür üreme deseni anlamak yeterli yönetim kararlarının uygulanmasını sağladığından, protokolümüzün ve veritabanımızın gelecekteki tatlı su midyesi araştırma, koruma ve kurtarmayı kolaylaştırmasını umuyoruz.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,5 mL geçmeli kapaklı santrifüj tüpleri	USA Scientific	1615-5510	Çıtçıtlı kapaklı tüpler sahada önemlidir, bu nedenle gevşek vidalı kapak kaybolmaz.
10 mL tek kullanımlık şırınga üzerinde 20 G iğne	Exelint International	26255	iğneli steril 10 mL tek kullanımlık şırınga Model: 10ml Luer Kilit Ucu W/20G X 1 1/2"
Diseksiyon Mikroskobu	herhangi bir
İşaretleme Kalemi	Fisher Scientific	13-379-4	Kullandığımız şey buydu, ancak küçük plastik tüplere yazabilen herhangi bir işaretleyici işe yarayacaktır. Bu oldukça etanol ve su geçirmezdir.
Moleküler dereceli etanol	herhangi	bir	Solungaç içeriğini koruyorsa gereklidir. Denatüre olmayan% 95'i genetik çalışma için,% 70'i SEM görüntüleme çalışması için gereklidir.
Toplanan numuneler hakkında bilgi kaydetmek için gerekli	olan herhangi bir	kağıda
Kalem / kurşun kalem	herhangi bir		alandaysa, su geçirmez kağıda kurşun kalemle yazmak daha iyidir, böylece bulaşmaz. Müzede/laboratuvarda ise, herhangi bir yazı aleti yeterlidir.
Petri kabı	DWK Yaşam Bilimleri (Kimble)	23000-9050	Biz bunu kullandık, ancak mevcut herhangi bir petri kabı iyi. Çok fazla su kullanılması durumunda daha uzun duvarlara sahip olmak daha güzeldir.
Sodyum Klorür	gerekli olan herhangi bir		şeydir. Korunmuş numunelerin buna ihtiyacı yoktur.
Spekulum	herhangi bir	Sadece	canlı bir midyenin valflerini açmak için yardım istiyorsanız gereklidir.
Steril su		toplandıktan sonraki 24 saat içinde reaktivite açısından değerlendirilmek üzere solungaç örneklerine eklenir.
Süper yapıştırıcı	Gorilla Gorilla	süper yapıştırıcı jel	Etiketleri uygulamak için kullanılır ve yalnızca bir yakalama-işaretleme-yeniden yakalama çalışması yürütülüyorsa gereklidir.
Etiketler	: Salon baskısı	FPN 8x4	Yalnızca bir yakalama-işaretleme-yeniden yakalama çalışması yürütülüyorsa gereklidir.
Transfer Pipeti	Thermo Scientific Samco	225	Kullandığımız şey budur, ancak herhangi bir transfer pipeti veya fışkırtma şişesi uygulanabilir.
Cımbız	herhangi	bir	tuz testi için NaCl kristallerini hareket ettirmek için gereklidir. Korunmuş numunelerin buna ihtiyacı yoktur.
Su geçirmez kağıt	RainWriter	herhangi bir	Sadece sahada çalışma yapıyorsanız gereklidir. Bu, çıkarılan her bir solungaç içeriği hakkında bilgi kaydetmenizi sağlar.
Ahşap kazma	herhangi	bir Sadece	canlı bir midyenin vanalarını açmak için yardım istiyorsanız gereklidir.