$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Bir proteinin biyotinylation onun yakınlık izolasyon ve algılama için güçlü bir etiket oluşturur. Enzimatik protein biyotinylasyonu, biyotin-protein ligasesleri ile katalize edilen çok spesifik bir post-translational modifikasyondur. E. coli biotin-protein ligaz BirA son derece spesifik ve kovalent biyotinylates belirli lizin artıkları sadece sınırlı sayıda doğal olarak oluşan proteinler1. BirA katalize biyotinylasyon avantajları şu anda küçük bir sentetik 15-amino-asit biyotin kabul peptid (AP) ile hedef protein eritilmesi ile harnessedolan etkili biyotinylated 2 ve son derece spesifik ve sağlar bir a3,4,5ile birlikte ekspresyonu veya ilavesi ile in vitro biyotinylasyon verimli. In vivo ve in vitro BirA katalize biotin-protein ligasyonu cazip bir etiketleme stratejisi olmasına rağmen, uygulama AP-erimiş proteinler içeren örnekler ile sınırlıdır. Bu yöntemin amacı, yerli modifiye edilmemiş proteinleri seçici olarak biyotinylate ve böylece enzimatik biyotinylation stratejisinin kullanılabildiği uygulamaların sayısını artıran yeni biyotin-protein ligazlarının geliştirilmesidir.
Protein fonksiyonu gen mutasyonunun yinelemeli turları ile evrilebilir, gen varyantlarının istenilen fonksiyonla seçilmesi ve amplifikasyonu. Güçlü ve verimli bir seçim stratejisi yönlendirilmiş evrim için çok önemlidir ve biotin-protein ligaz aktivitesi biotin ve streptavidin ve homologlar arasındaki güçlü bağlanma nedeniyle kolayca seçilir6. Faj görüntüleme teknolojileri biyotinylated peptidler görüntülemek fajların seçimi için izin7,8. İzole fajların amplifikasyonu bakteriyel konak enfeksiyonu gerektirdiğinden, ancak streptavidin ile faj seçimi, biotinin streptavidin için yüksek afinite bağlama non-denaturing altında hemen hemen geri dönüşümsüz olduğu bir darboğaz oluşturur Koşul -ları. Biyotinylated fajlar geri dönüşümlü bağlanmasını sağlamak için, düşük afinite ile monomerik avidinler mütevazı ~ 10 kat zenginleştirme7sonuçlandı kullanılmıştır. Yakın zamanda yakınlık matrise olan elüsasyon ihtiyacını ortadan kaldıran ve önceki BirA seçim sistemlerinden bir darboğaz çıkaran yeni BirA varyantlarının izolasyonu için bakteriyel bir görüntüleme yöntemi geliştirdik9. Gerçekten de, bizim bakteriyel ekran sistemi tek bir seçim adım9aktif klonların bir >1.000.000 kat zenginleştirme sağlar , böylece roman BirA varyantları yönlendirilen evrim için etkili bir seçim sistemi sağlayan.
Bakteriyel titreşme sistemimiz, C-terminal 6xHis etiketine sahip BirA ve hedef peptidin yüzeyde görüntülenmesini sağlayan bir iskele proteini olmak üzere iki bileşenden oluşur. Biz iskelet proteini kullanılan dairesel permuted dış membran protein X (eCPX) peptidlerin etkili ekran hem De görülebilir beri- ve C-termini10,11. Hedef peptid dizisinin eCPX'in C-terminusuna füzyonu aktif BirA varyantlarını ifade eden bakterilerin biyotinylasyonunu sağlar. Bakteriler biyotinylated peptid şimdi yüzeyde görüntüler gibi etkili streptavidin seçimi için izin(Şekil 1a).
Bu yöntemin amacı, yerli proteinlerde bulunan peptit dizilerini biyotinylates BirA yeni varyantları için seçmektir. Sistem plazmid pBAD-BirA-eCPX-AP mevcut genler tarafından kodlanır, bir arabinose-indüklemez organizatörü BirA kontrol içeren (araBAD), ve bir T7 organizatörü eCPX kontrol9 (Şekil 1b). Bu protokol, hedef proteinden elde edilen bir peptitin eCPX'in C-terminaline dahil edilmesi, 2) hata yatkın PCR ile BirA mutasyonel kütüphanesinin oluşturulması, 3) streptavidin bağlayıcı bakterilerin seçilmesi için ayrıntılı prosedürü açıklar. manyetik aktive hücre tasnifikasyonu (MACS), 4) bakteri zenginleştirme nicelik, ve 5) izole klonların ilk karakterizasyonu.