Yöntem makalesi

Roman Biyotinilasyon Enzimlerinin Seçimi için Bakteriyel Peptit Gösterimi

DOI:

10.3791/60266

⸱

3 Ekim 2019

 ,  , 
1Department of Molecular Medicine, University of Southern Denmark, 2Department of Nephrology, Odense University Hospital

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada e. coli biotin-protein ligase BirA'nın belirli bir hedef peptidbiyominiyapan yeni varyantları için seçme yöntemi salıyoruz. Protokol, hedef peptidin bakteriyel olarak görüntülenmesi için bir plazmid yapımını, BirA kütüphanesinin neslinin, BirA varyantlarının seçilmesi ve karakterizasyonunun yapılmasını açıklar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biotin, proteinlerin izolasyonu ve tespiti için güçlü bir etiket sağlayan, çeviri sonrası çekici bir modifikasyondur. E. coli biotin-protein ligaz BirA tarafından enzimatik biyotinylasyon son derece spesifik tir ve hedef proteinlerin yerli ortamında biyotinylasyon sağlar; ancak, BirA aracılı biyotinylation mevcut kullanımı hedef protein sentetik bir kabul veya peptid (AP) varlığını gerektirir. Bu nedenle, uygulama AP içerecek şekilde tasarlanmış proteinler ile sınırlıdır. Bu protokolün amacı, peptidbiyoni yapan BirA varyantları için seçilen değiştirilmemiş bir hedef proteinden elde edilen bir peptitin bakteriyel ekranını kullanmaktır. Sistem bakteriyel yüzeyde peptit ekran için bir iskele ile birlikte BirA varyantları co-ifade sağlayan tek bir plazmid dayanmaktadır. Protokol, hedef peptidin ekran iskelesine dahil edilmesi, BirA kütüphanesinin oluşturulması, aktif BirA varyantlarının seçilmesi ve izole Edilmiş BirA varyantlarının ilk karakterizasyonu için ayrıntılı bir prosedürü açıklar. Bu yöntem, biyotin-protein ligaseslerinin daha da karmaşık çözeltilerde yerli proteini biyotinyle ile yönlendirilen evrimi için kullanılabilecek yeni BirA varyantlarının izolasyonu için son derece etkili bir seçim sistemi sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir proteinin biyotinylation onun yakınlık izolasyon ve algılama için güçlü bir etiket oluşturur. Enzimatik protein biyotinylasyonu, biyotin-protein ligasesleri ile katalize edilen çok spesifik bir post-translational modifikasyondur. E. coli biotin-protein ligaz BirA son derece spesifik ve kovalent biyotinylates belirli lizin artıkları sadece sınırlı sayıda doğal olarak oluşan proteinler1. BirA katalize biyotinylasyon avantajları şu anda küçük bir sentetik 15-amino-asit biyotin kabul peptid (AP) ile hedef protein eritilmesi ile harnessedolan etkili biyotinylated 2 ve son derece spesifik ve sağlar bir a3

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. PBAD BirA-eCPX-AP'ye Peptit Kodlama Sıralama Sırasının Eklenmesi

NOT: Yerli bir hedef proteini biyotinylate BirA varyantları için seçmek için, proteinlerbirincil dizi en az bir lizin (K) kalıntısı içeren 15-amino asit peptit dizisi belirleyerek başlar.

  1. Sıralı manipülasyon paketi12gidin.
  2. Belirlenen 15 amino asit peptid dizisini FASTA formatında giriş kutusuna yapıştırın ve Göndertuşuna basın.
  3. Peptit dizisinin 45 nükleotit ters çevirisini seçin ve kopyalayın.
  4. http://n2t.net/addgene:121907 pBAD-BirA-eCPX-AP için GenBank Dosyasını indirin.
    5. ....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PBAD-BirA-eCPX-AP ifade bakterilerin Batı leke bir ~ 22 kDa streptavidin-eCPX moleküler ağırlığı ile tutarlı tepki bant üretir(Şekil 2a). BirA-6xHis'in aksine, biyotinylated eCPX-AP hem indüklenmemiş hem de indüklenen kültürlerde(Şekil 2a)t7 promotör aktivitesi nin küçük bir derecesi nedeniyle bile uninduced kültürlerde ve endojen BirA tarafından AP sonraki biyotinylation mevcuttu. Kültürleri ifade eden BirA-eCPX-AP(K10A) hiçbir.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm seçim yöntemlerine gelince, yıkama adımlarının sıkılığı son derece önemlidir. Bakterilerin seçilen klonların amplifikasyonönce boncuklardan eluted gerek olmadığından, biotin ve streptavidin arasındaki yüksek yakınlık bağlayıcı yerine daha düşük afinite avidinler kullanarak kullanılabilir, daha önce faj görüntüleme sistemi ile yapılan, için BirA varyantları seçimi7,8. Bu, nadir klonların seçilmesini ve biyotinylated olmayan bakterilerin atılmasını sağlar. Bakt.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar uzman teknisyen yardım için Mohamed Abdullahi Ahmed teşekkür ederim. Bu çalışma Lundbeck Vakfı, Novo Nordisk Vakfı, Danimarka Böbrek Derneği, Aase og Ejnar Danielsen Vakfı, A.P. Møller Tıp Biliminin İlerlemesi Vakfı ve Knud ve Edith Eriksen'in bağışları ile desteklendi. Anıt Vakfı.

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
% 10 prekast poliakrilamid jelBio-Rad4561033
AmpicilinSigma-AldrichA1593
ArabinoseSigma-AldrichA3256
BiotinSigma-AldrichB4501'den
indirilen birplazmid düzenleyici v2.0NA
DMSOSigma-AldrichD2650
DPBS (10x), kalsiyum yok, magnezyum yokThermoFischer Scientific14200083
DpnI kısıtlamaenzimi New England BioLabsR0176
Dynabeads MyOne Streptavidin C1ThermoFischer Scientific65001
GenElute Plazmid Miniprep KitiSigma-AldrichPLN350
GeneMorph II EZClone Domain Mutagensis kitiAgilent Technologies200552
GlikozSigma-AldrichG8270
GliserolSigma-AldrichG5516
Immobilon-P PVDF MembranMilliporeIPVH15150
IPTGSigma-AldrichI6758
LS SütunlarıMiltenyi Biotec130-042-401
NaClSigma-AldrichS7653
NEB 5-alfa Yetkin E. coliNew England BioLabsC2987
NuPAGE LDS Numune Tamponu (4x)ThermoFischer ScientificNP0007
NuPAGE Numune Azaltıcı Ajan (10x)ThermoFischer ScientificNP0009
pBAD-BirA-eCPX-APAddgene121907Bir şablon ve pozitif kontrol kullanıldı
pBAD-BirA-eCPX-AP (K10A)Addgene121908negatif kontrol
Q5 Yüksek Sadakatli DNA PolimerazNew England BioLabsM0491pBAD-BirA-eCPX-AP'ye peptit dizisinin eklenmesi için, herhangi bir yüksek kaliteli polimeraz
QuadroMACS AyırıcıMiltenyi Biotec130-090-976
Yağsız Süt TozSigma-Aldrich70166
Streptavidin-HRPAgilent TeknolojileriP0397
T7 Ekspres lysY/Iq Yetkili E. coliNew England BioLabsC3013
TriptonMilliporeT9410
Ara-20Sigma-AldrichP9416
Batı Yıldırım Plus-ECLPerkinElmerNEL103001EA
Maya özüSigma-AldrichY1625
ApE - http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/ NA

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Polyak, S. W., Abell, A. D., Wilce, M. C. J., Zhang, L., Booker, G. W. Structure, function and selective inhibition of bacterial acetyl-CoA carboxylase. Applied Microbiology and Biotechnology. 93 (3), 983-992 (2011).
  2. Schatz, P. J.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

BirA VaryantlarBiyotinilasyon Se ilimiStreptavidin Se ilimiPlazmit K t phanesiPCR AmplifikasyonuWestern Blot AnaliziStreptavidin Manyetik BoncuklarKoloni Say mDondurucu Stoklar

İlgili makaleler