Roman Biyotinilasyon Enzimlerinin Seçimi için Bakteriyel Peptit Gösterimi

Özet

Burada e. coli biotin-protein ligase BirA'nın belirli bir hedef peptidbiyominiyapan yeni varyantları için seçme yöntemi salıyoruz. Protokol, hedef peptidin bakteriyel olarak görüntülenmesi için bir plazmid yapımını, BirA kütüphanesinin neslinin, BirA varyantlarının seçilmesi ve karakterizasyonunun yapılmasını açıklar.

Özet

Biotin, proteinlerin izolasyonu ve tespiti için güçlü bir etiket sağlayan, çeviri sonrası çekici bir modifikasyondur. E. coli biotin-protein ligaz BirA tarafından enzimatik biyotinylasyon son derece spesifik tir ve hedef proteinlerin yerli ortamında biyotinylasyon sağlar; ancak, BirA aracılı biyotinylation mevcut kullanımı hedef protein sentetik bir kabul veya peptid (AP) varlığını gerektirir. Bu nedenle, uygulama AP içerecek şekilde tasarlanmış proteinler ile sınırlıdır. Bu protokolün amacı, peptidbiyoni yapan BirA varyantları için seçilen değiştirilmemiş bir hedef proteinden elde edilen bir peptitin bakteriyel ekranını kullanmaktır. Sistem bakteriyel yüzeyde peptit ekran için bir iskele ile birlikte BirA varyantları co-ifade sağlayan tek bir plazmid dayanmaktadır. Protokol, hedef peptidin ekran iskelesine dahil edilmesi, BirA kütüphanesinin oluşturulması, aktif BirA varyantlarının seçilmesi ve izole Edilmiş BirA varyantlarının ilk karakterizasyonu için ayrıntılı bir prosedürü açıklar. Bu yöntem, biyotin-protein ligaseslerinin daha da karmaşık çözeltilerde yerli proteini biyotinyle ile yönlendirilen evrimi için kullanılabilecek yeni BirA varyantlarının izolasyonu için son derece etkili bir seçim sistemi sağlar.

Giriş

Bir proteinin biyotinylation onun yakınlık izolasyon ve algılama için güçlü bir etiket oluşturur. Enzimatik protein biyotinylasyonu, biyotin-protein ligasesleri ile katalize edilen çok spesifik bir post-translational modifikasyondur. E. coli biotin-protein ligaz BirA son derece spesifik ve kovalent biyotinylates belirli lizin artıkları sadece sınırlı sayıda doğal olarak oluşan proteinler¹. BirA katalize biyotinylasyon avantajları şu anda küçük bir sentetik 15-amino-asit biyotin kabul peptid (AP) ile hedef protein eritilmesi ile harnessed^{olan etkili} biyotinylated 2 ve son derece spesifik ve sağlar bir a3^,4,⁵ile birlikte ekspresyonu veya ilavesi ile in vitro biyotinylasyon verimli. In vivo ve in vitro BirA katalize biotin-protein ligasyonu cazip bir etiketleme stratejisi olmasına rağmen, uygulama AP-erimiş proteinler içeren örnekler ile sınırlıdır. Bu yöntemin amacı, yerli modifiye edilmemiş proteinleri seçici olarak biyotinylate ve böylece enzimatik biyotinylation stratejisinin kullanılabildiği uygulamaların sayısını artıran yeni biyotin-protein ligazlarının geliştirilmesidir.

Protein fonksiyonu gen mutasyonunun yinelemeli turları ile evrilebilir, gen varyantlarının istenilen fonksiyonla seçilmesi ve amplifikasyonu. Güçlü ve verimli bir seçim stratejisi yönlendirilmiş evrim için çok önemlidir ve biotin-protein ligaz aktivitesi biotin ve streptavidin ve homologlar arasındaki güçlü bağlanma nedeniyle kolayca seçilir⁶. Faj görüntüleme teknolojileri biyotinylated peptidler görüntülemek fajların seçimi için izin^7,8. İzole fajların amplifikasyonu bakteriyel konak enfeksiyonu gerektirdiğinden, ancak streptavidin ile faj seçimi, biotinin streptavidin için yüksek afinite bağlama non-denaturing altında hemen hemen geri dönüşümsüz olduğu bir darboğaz oluşturur Koşul -ları. Biyotinylated fajlar geri dönüşümlü bağlanmasını sağlamak için, düşük afinite ile monomerik avidinler mütevazı ~ 10 kat zenginleştirme⁷sonuçlandı kullanılmıştır. Yakın zamanda yakınlık matrise olan elüsasyon ihtiyacını ortadan kaldıran ve önceki BirA seçim sistemlerinden bir darboğaz çıkaran yeni BirA varyantlarının izolasyonu için bakteriyel bir görüntüleme yöntemi geliştirdik⁹. Gerçekten de, bizim bakteriyel ekran sistemi tek bir seçim adım⁹aktif klonların bir >1.000.000 kat zenginleştirme sağlar , böylece roman BirA varyantları yönlendirilen evrim için etkili bir seçim sistemi sağlayan.

Bakteriyel titreşme sistemimiz, C-terminal 6xHis etiketine sahip BirA ve hedef peptidin yüzeyde görüntülenmesini sağlayan bir iskele proteini olmak üzere iki bileşenden oluşur. Biz iskelet proteini kullanılan dairesel permuted dış membran protein X (eCPX) peptidlerin etkili ekran hem De görülebilir beri- ve C-termini^10,11. Hedef peptid dizisinin eCPX'in C-terminusuna füzyonu aktif BirA varyantlarını ifade eden bakterilerin biyotinylasyonunu sağlar. Bakteriler biyotinylated peptid şimdi yüzeyde görüntüler gibi etkili streptavidin seçimi için izin(Şekil 1a).

Bu yöntemin amacı, yerli proteinlerde bulunan peptit dizilerini biyotinylates BirA yeni varyantları için seçmektir. Sistem plazmid pBAD-BirA-eCPX-AP mevcut genler tarafından kodlanır, bir arabinose-indüklemez organizatörü BirA kontrol içeren (araBAD), ve bir T7 organizatörü eCPX kontrol⁹ (Şekil 1b). Bu protokol, hedef proteinden elde edilen bir peptitin eCPX'in C-terminaline dahil edilmesi, 2) hata yatkın PCR ile BirA mutasyonel kütüphanesinin oluşturulması, 3) streptavidin bağlayıcı bakterilerin seçilmesi için ayrıntılı prosedürü açıklar. manyetik aktive hücre tasnifikasyonu (MACS), 4) bakteri zenginleştirme nicelik, ve 5) izole klonların ilk karakterizasyonu.

Protokol

1. PBAD BirA-eCPX-AP'ye Peptit Kodlama Sıralama Sırasının Eklenmesi

NOT: Yerli bir hedef proteini biyotinylate BirA varyantları için seçmek için, proteinlerbirincil dizi en az bir lizin (K) kalıntısı içeren 15-amino asit peptit dizisi belirleyerek başlar.

1. Sıralı manipülasyon paketi¹²gidin.
2. Belirlenen 15 amino asit peptid dizisini FASTA formatında giriş kutusuna yapıştırın ve Göndertuşuna basın.
3. Peptit dizisinin 45 nükleotit ters çevirisini seçin ve kopyalayın.
4. http://n2t.net/addgene:121907 pBAD-BirA-eCPX-AP için GenBank Dosyasını indirin.
5. Dosyayı bir plazmid düzenleyiciye yükleyin (örn. ApE) ve özellik penceresinde "AviTag(TM)" olarak belirlenen AP sırasını seçin.
6. DNA sıralı penceresinde vurgulanan AP sırasını sağ tıklatın ve bağlamsal menüde Paste Rev-Com'u seçin.
   NOT: eCPX'in kodlama sırası ters yöndedir ve peptit kodlama dizisi ters kompleman olarak yapıştırılmalıdır.
7. Vurgulanan sırayı sağ tıklatın ve Yeni Özellik'iseçin.
8. Eklenen sıranın açıklayıcı adını ekleyin ve Tamamtuşuna basın.
9. Değiştirilen dosyayı kaydetmek için Dosya menüsünde Farklı Kaydet'i seçin.
10. İleri astarı, peptit kodlama dizisinin ters komplemanının son 30 nükleotitini içerecek şekilde tasarlayın ve 5' ucuna plazmid bağlayıcı nükleotit dizisini (3'-GCGGCCGCCTGC-5') ekleyin.
11. Ters astarı, peptit kodlama dizisinin ters komplemanının ilk 30 nükleotitini içerecek şekilde tasarlayın ve 5' ucuna plazmid bağlayıcı nükleotit dizisini (3'- CTTAAGTAATGTTTAAACGAATTCGAG-5') ekleyin.
12. Tablo 1'de listelenen reaktifleri ekleyerek ince duvarlı bir PCR tüpünde 20 μL PCR reaksiyonu ayarlayın.
13. Tüpü bir termal döngüce aktarın ve 30 s için 98 °C'de başlangıç denaturingi olan bir program kullanarak PCR gerçekleştirin, 30 s 'de [15 s, 60 °C'de 15 s ve 72 °C'de 3 dk], 72 °C'de 2 dk ve 4 °C'de tutun.
14. ~6 kb PCR ürünün amplifikasyonuna onay vermek için %1 agarose jel üzerinde 5 μL PCR reaksiyonu çalıştırın.
    NOT: PCR ürünü gözlenmezse, PCR durumunu üreticinin talimatlarına göre optimize edin. Protokol burada duraklatılmış olabilir.
15. PCR reaksiyonuna 1 μL DpnI ekleyin ve 37 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın
16. Lisojenik broth (LB)/Amp plakaları üzerinde DpnI sindirilmiş PCR reaksiyonu ve plaka 2 μL ile yetkin E. coli dönüştürün. Bir gecede 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
17. Tek bir koloni ile 100 μg/mL ampisilin içeren 5 mL LB inoculate. Gece boyunca 37 °C'de 200 rpm'de sallayarak kuluçkaya yatırın.
    NOT: En az 6 koloninin test etmesi tavsiye edilir.
18. Kültüre %15'lik son konsantrasyona gliserol ekleyerek her bir gecede kültürün 850 μL'lik donma stokları yapın. -80 °C'de saklayın.
19. Plazmid DNA'sını mini hazırlık DNA çıkarma kiti ile kalan 4 mL kültürden ayıklayın.
20. T7 Terminal astarı (GCTAGTTATTGCTCAGCGG) kullanarak DNA dizilimi ile peptit kodlama dizisinin doğru eklemesini onaylayın.

2. BirA KütüphanesiNin Üretimi

NOT: İlk BirA mutasyonel kitaplığı(Şekil 1c, adım 1) hataya yatkın PCR tarafından oluşturulur. BirA mutasyonel kitaplığı oluşturmak için diğer yöntemler de çalışması muhtemeldir.

1. BirA-6xHis ileri (ATGAAGGATAACACCGTGCC) ve ters (TCAATGATATGATGATGATGATGTTT) astarlar ile bir şablon ve 35 PCR döngüleri olarak hedef peptid dizisi (hazırlanan ve adım 1.20 olarak onaylanan) pBAD-BirA-eCPX 1 ng kullanarak mutant megaprimers sentez üreticinin talimatına göre 60 °C'lik bir sıcaklıkta.
2. 984 bp PCR ürünün amplifikasyonuna doğru vermek için %1'lik agarose jelüzerinde amplifikasyon reaksiyonunun 5 0L'sini çalıştırın.
3. PCR ürününü, ticari bir PCR arıtma kiti kullanarak amplifikasyon reaksiyonunun kalan 45 μL'sinden arındırın ve DNA verimini quantitate etmek için bir spektrofotometre kullanın.
   NOT: Tek bir 45 μL amplifikasyon reaksiyonundan arınma genellikle yeterli verim (>250 ng) üretir.
4. Tablo 2'delistelenen reaktifleri ekleyerek ince duvarlı bir PCR tüpünde numune reaksiyonu hazırlayın.
5. Reaksiyon karışımını bir termal döngücatöre aktarın ve aşağıdaki parametreleri kullanarak adım 2.3'te hazırlanan mutant megaprimerlerle PCR'yi çalıştırın: 95 °C'de 1 dk ve 95 °C'de 50 s, 60 °C'de 50 s ve 68 °C'de 12 dk. Reaksiyonu 4 °C'de saklayın.
6. Amplifikasyon reaksiyonuna doğrudan 1 μL DpnI restriksiyon enzimi ekleyin ve hafifçe karıştırın.
7. Reaksiyon karışımını aşağı doğru döndürün ve 37 °C'de 2 saat kuluçkaya yatırın.
8. T7 Express lysY/Iq yetkili E. coli hücrelerini DpnI reaksiyonunun 2 μL'si ile dönüştürün.
9. Dönüştürülmüş hücrelerle 100 μg/mL ampisilin içeren 100 mL LB aşılayın ve gece boyunca 37 °C'de 200 rpm'de sallayarak kuluçkaya yatırın.
10. LB'de gecelik kültürün 10 mL'lik ve %15'i gliserol ile dondurucu stokları yapın ve -80 °C'de saklayın.

3. Biyotinylated Peptid İfade Bakterilerin Seçimi

NOT: Protokolün bu bölümü Şekil 1 c'nin2-5. Seçim yaklaşımının pozitif ve negatif kontroller olarak pBAD-BirA-eCPX-AP ve pBAD-BirA-eCPX-AP(K10A) kullanılarak kurulum olması önerilir.

1. %1 glikoz ve 1 00 μg/mL ampisilin içeren 100 mL'lik 100 mL'lik bir süre boyunca 1 mL BirA kütüphanesi ve 200 rpm'de sallayarak bir gecede 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
2. %1 glikoz ve 100 μg/mL ampisilin içeren 5 mL LB'yi gece kültüründen 100 μL ile inoküle edin.
3. Kültür yaklaşık 0,5 Bir OD₆₀₀ ulaşana kadar 2 saat ve 30 dk için kuluçka.
4. ECPX ve BirA ekspresyonunu %0,2 w/v L-arabinose, 100 μM İzopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) ve 100 μM biotin ile ikna edin ve 37 °C'de 1 saat boyunca 200 rpm'de kültürü salla.
5. 5.000 x g 10 dakika için kültür santrifüj ve supernatant kaldırın.
6. 5 dakika boyunca 5.000 x g buz gibi PBS ve santrifüj 1 mL hücreleri resuspend.
7. Supernatant atın ve buz gibi pbs 400 μL hücreleri yeniden askıya ve buz üzerinde hücreleri depolamak.
8. 10 μL'lik yeniden askıda hücreleri çıkarın ve "Giriş" etiketli 1,5 mL'lik bir tüpte buzun üzerinde saklayın.
9. 20 μL streptavidin manyetik boncukları 1 mL buz gibi PBS'de yıkayın ve tüpü supernatant'ı dikkatlice çıkarmadan önce bir tezgah üstü manyetik partikül ayırıcısına yerleştirin.
10. Streptavidin manyetik boncuklarını 20 μL buz gibi PBS'de yeniden askıya alın ve 3.8 adımdan itibaren 390 μL'lik yeniden askıya alınmış hücrelere aktarın.
11. Yavaşça pipetleme ve daha sonra 4 ° C'de 30 dakika kuluçka ile karıştırın.
    NOT: Bu hücreleri lyse olabilir gibi girdap etmeyin. Boncuk ların toplanması genellikle biyotinylated peptid gösteren bakterilerin yüksek bolluk ile gözlenir.
12. Ferromanyetik küreli bir kolonu manyetik parçacık ayırıcıya yerleştirin ve 5 mL buz gibi PBS ile yıkayın.
13. Hücreleri ve streptavidin manyetik boncukları ayırıcıya bağlı kolona aktarın.
14. Sütun haznesi boşaldıktan sonra, 500 μL buz gibi PBS ekleyin ve kolon toplam 5 mL buz gibi PBS hacmi yle yıkanana kadar tekrarlayın.
15. Kolonu ayırıcıdan çıkarın ve 1,5 mL'lik bir tüpe yerleştirin.
16. Pipet 1 mL buz gibi PBS sütun üzerine ve sütun ile birlikte piston uygulayarak manyetik etiketli hücreleri elite.
17. 1,5 mL'lik tüpü bir tezgah üstü ayırıcıya aktarın ve manyetik etiketli hücreyi 1 mL buz gibi PBS ile yıkayın.
18. "Çıkış" etiketli 1,5 mL'lik bir tüpte 10 μL'lik resuspension'ı çıkarmadan ve depolamadan önce, buz gibi PBS'nin 1 mL'inde manyetik olarak etiketlenmiş hücreleri yavaşça yeniden askıya alın.
19. %1 glikoz ve 100 μg/mL ampisilin içeren 100 mL'lik LB'yi manyetik olarak etiketlenmiş hücrelerle aşıla ve gece boyunca 37 °C'de 200 rpm'de sallayarak kuluçkaya yatırın.
20. Ertesi gün, lb hücreleri ile dondurucu stokları yapmak için 10 mL kullanın 15% gliserol ve depolamak -80 °C ve 1 mL bir sonraki seçim turu için, yani, adım 3.2.
    NOT: Genel olarak, streptavidin bağlayıcı bakterilerin zenginleşmesi için 3-5 tur seçim önerilir.

4. Zenginleştirmenin Nicelikselleştirilmesi

NOT: "Girdi" ve "çıktı" örneklerindeki canlı bakterilerin sayısallaştırılması, her seçim turundan sonra numunelerin seri seyreltmelerinin kaplaması ve koloni oluşturan birimlerin (CPU) sonraki sayımı ile gerçekleştirilir.

1. Girişe (adım 3.8'den) ve çıktıya (3.18'den) 990 μL buz gibi PBS ekleyin ve tüpleri sırasıyla "Giriş 10^-2" ve "Çıkış 10^-2" etiketleyin.
2. "Giriş 10^-2" ve "Output 10^-2" numunelerinin 10 kat seri seyreltmelerini buz gibi PBS'de girdi numunesinde 10^-10 ve çıktı numunesinde 10^-4'lük son seyreltme ulaşınana kadar yapın.
3. "Giriş 10^-6", "Giriş 10^-8", "Giriş 10^-10", "Çıkış 10^-2", "Çıkış 10^-3" ve "Çıkış 10^-4" dan örneklerin plaka 100 μL LB / Amp plakalar üzerinde ve tüp lüttür 37 °C gecede.
4. Plakalar üzerinde açıkça ayrılmış koloniler ile kolonilerin sayısını saymak. Bakteri konsantrasyonu sayısı/100 μL elde etmek için koloni sayısını seyreltme faktörüyle çarpın.
5. Hücre konsantrasyonu ile giriş (400 μL) ve çıkış hacmini (1 mL) çarparak giriş ve çıkış örneklerindeki toplam bakteri sayısını hesaplayın ve çıktıyı giriş hücre sayısıyla bölerek zenginleştirmeyi tahmin edin.
   NOT: 3-5 seçim turundan sonra önemli bir zenginleştirme görülmelidir

5. Seçilen BirA Varyantının Karakterizasyonu

NOT: Karakterizasyon, ilk BirA kitaplığından BirA türevleri seçtikten sonra gerçekleştirilebilir; ancak, BirA varyantları genellikle peptid doğru düşük aktiviteye sahip. Bu nedenle, karakterizasyondan önce ek bir mutasyon ve seçim turu da yapılabilir. Genellikle, son seçim turundan 10 klon daha fazla karakterizasyon için izole edilir.

1. Son seçim turundan seçilen klonlarla 100 μg/mL ampisilin içeren 5 mL LB inoküle. Buna ek olarak, aşağıda açıklanan batı lekeiçin pozitif kontrol olarak kullanılacak olan pBAD-BirA-eCPX-AP ile dönüştürülmüş T7 Express lysY/Iq E. coli ile 100 μg/mL ampisilin içeren 5 mL LB inokül.
2. Gece boyunca 37 °C'de 200 rpm'de sallayarak kuluçkaya yatırın.
3. Kültüre %15'lik son konsantrasyona gliserol ekleyerek her bir gecede kültürün 850 μL'lik donma stokları yapın. -80 °C'de saklayın.
4. 100 μg/mL ampisilin içeren 5 mL LB'yi 100 μL gece kültürü yle aşıla ve 37 °C'de 200 rpm'de 2 saat boyunca titreyerek kuluçkaya yatırın.
5. Plazmid DNA'sını kalan 4 mL kültüründen ticari olarak mini hazırlık DNA çıkarma kiti ile ayıklayın. DNA dizisini bira varyantlarının ileri ve ters yönde pBAD (ATGCCATAGCATTTTATCC) ve pTrcHis rev (CTTCTGCGTTCTGATTTAATCTG) astarları ile gerçekleştirin.
6. Adım 5.4'ten itibaren kültürlere %0.2 w/v L-arabinose ve 100 μM IPTG ve 100 μM biotin ekleyin ve eCPX ve BirA varyantlarının ifadesini sağlamak için kültürü 37 °C'de 1 saat boyunca 200 rpm'de salla.
7. Kültürün 65 μL'sini numune yükleme tamponunun 25 μL'si ve 10 μL'lik azaltma maddesini içeren 1,5 mL'lik tüplere aktarın.
8. 95 °C'de 5 dk kuluçkaya yatırın.
9. Numuneyi (pozitif kontrol dahil) bir boyut belirteci ile birlikte %12'lik SDS-poliakrilamid jelüzerine yükleyin ve 20, 25 ve 37 kDa standart bantlar net bir şekilde ayrılana kadar yaklaşık 45 dakika boyunca 200 V'de jel elektroforezi yapın.
10. Kasetten jel bırakın ve bir PVDF membran üzerine jel blotting için sandviç monte.
11. 35 V'de buz üzerinde 2 saat için elektroblot.
12. PVDF membranını çıkarın ve tamponu bloke ederek inkübül [PBS, %0.05 Ara-20, %3 Yağsız Süt Tozu] oda sıcaklığında sallayarak 1 saat boyunca.
13. PBST'de streptavidin-HRP 1:1.000'i seyrelterek biotin algılama çözeltisini hazırlayın.
    NOT: Engelleme tamponu biotin içerir ve bu nedenle streptavidin-HRP için seyreltme tamponolarak kullanılmamalıdır.
14. Engelleme tamponu atın, membranı PBST'de hızlı bir şekilde yıkayın [PBS, %0.05 Ara-20] ve biotin algılama solüsyonu ekleyin. Sallayarak oda sıcaklığında 1 saat kuluçka.
15. Biotin algılama çözeltisini atın ve membranı pbst'ta iki kez 5 dakika ve oda sıcaklığında hafifçe sallayarak bir kez 10 dk boyunca iyice yıkayın.
16. PBST atın, 2 mL ECL karışımı ekleyin ve sallayarak 1 dakika kuluçka.
17. Membranı bir kağıt üzerinde hızla kurutun ve görüntüyü x-ray filminde veya dijital jel görüntüleme sisteminde geliştirin.
    NOT: Pozitif kontrol yüklü şeritte, iki farklı streptavidin reaksiyon bantları açıkça görülebilir olmalıdır: bir 30 kDa biyotinylated endojen protein ve ~ 22 kDa eCXP-AP bant ifade. Seçilen 10 koloni görüntülenen peptidi biyotinylate eğer ~ 22 kDa bir bant görünür olmalıdır. Bu bantların yoğunluğu genellikle pozitif kontrolden daha düşüktür ve bu nedenle daha uzun pozlama süreleri gerektirebilir.

Sonuçlar

PBAD-BirA-eCPX-AP ifade bakterilerin Batı leke bir ~ 22 kDa streptavidin-eCPX moleküler ağırlığı ile tutarlı tepki bant üretir(Şekil 2a). BirA-6xHis'in aksine, biyotinylated eCPX-AP hem indüklenmemiş hem de indüklenen kültürlerde(Şekil 2a)t7 promotör aktivitesi nin küçük bir derecesi nedeniyle bile uninduced kültürlerde ve endojen BirA tarafından AP sonraki biyotinylation mevcuttu. Kültürleri ifade eden BirA-eCPX-AP(K10A) hiçbir...

Tartışma

Tüm seçim yöntemlerine gelince, yıkama adımlarının sıkılığı son derece önemlidir. Bakterilerin seçilen klonların amplifikasyonönce boncuklardan eluted gerek olmadığından, biotin ve streptavidin arasındaki yüksek yakınlık bağlayıcı yerine daha düşük afinite avidinler kullanarak kullanılabilir, daha önce faj görüntüleme sistemi ile yapılan, için BirA varyantları seçimi^7,8. Bu, nadir klonların seçilmesini ve biyotinylated olmayan bakterilerin atılmasını sağlar. Bakt...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
% 10 prekast poliakrilamid jel	Bio-Rad	4561033
Ampicilin	Sigma-Aldrich	A1593
Arabinose	Sigma-Aldrich	A3256
Biotin	Sigma-Aldrich	B4501'den
	indirilen bir	plazmid düzenleyici v2.0	NA
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
DPBS (10x), kalsiyum yok, magnezyum yok	ThermoFischer Scientific	14200083
DpnI kısıtlama	enzimi New England BioLabs	R0176
Dynabeads MyOne Streptavidin C1	ThermoFischer Scientific	65001
GenElute Plazmid Miniprep Kiti	Sigma-Aldrich	PLN350
GeneMorph II EZClone Domain Mutagensis kiti	Agilent Technologies	200552
Glikoz	Sigma-Aldrich	G8270
Gliserol	Sigma-Aldrich	G5516
Immobilon-P PVDF Membran	Millipore	IPVH15150
IPTG	Sigma-Aldrich	I6758
LS Sütunları	Miltenyi Biotec	130-042-401
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
NEB 5-alfa Yetkin E. coli	New England BioLabs	C2987
NuPAGE LDS Numune Tamponu (4x)	ThermoFischer Scientific	NP0007
NuPAGE Numune Azaltıcı Ajan (10x)	ThermoFischer Scientific	NP0009
pBAD-BirA-eCPX-AP	Addgene	121907	Bir şablon ve pozitif kontrol kullanıldı
pBAD-BirA-eCPX-AP (K10A)	Addgene	121908	negatif kontrol
Q5 Yüksek Sadakatli DNA Polimeraz	New England BioLabs	M0491	pBAD-BirA-eCPX-AP'ye peptit dizisinin eklenmesi için, herhangi bir yüksek kaliteli polimeraz
QuadroMACS Ayırıcı	Miltenyi Biotec	130-090-976
Yağsız Süt Toz	Sigma-Aldrich	70166
Streptavidin-HRP	Agilent Teknolojileri	P0397
T7 Ekspres lysY/Iq Yetkili E. coli	New England BioLabs	C3013
Tripton	Millipore	T9410
Ara-20	Sigma-Aldrich	P9416
Batı Yıldırım Plus-ECL	PerkinElmer	NEL103001EA
Maya özü	Sigma-Aldrich	Y1625