Yöntem makalesi

Konfokal Mikroskopi Ile Krallık Lararası Biyofilmlerde Hücre Dışı pH'ın izlenmesi

DOI:

10.3791/60270

⸱

30 Ocak 2020

 , 
1Department of Dentistry and Oral Health, Aarhus University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokol, Candida albicans ve Streptococcus mutans'tan oluşan krallıklar arası biyofilmlerin ekimini açıklar ve bu biyofilmlerin içinde hücre dışı pH'ın izlenmesi için konfokal mikroskopi tabanlı bir yöntem sunar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hem mantar hem de bakteri hücrelerinden oluşan krallıklar arası biyofilmler, endodontik enfeksiyonlar, periodontit, mukozal enfeksiyonlar ve en önemlisi erken çocukluk çürükleri gibi çeşitli ağız hastalıklarında rol oynarlar. Tüm bu koşullarda, biyofilm matrisindeki pH mikrop-konak etkileşimlerini ve dolayısıyla hastalığın ilerlemesini etkiler. Bu protokol, Candida albicans ve Streptococcus mutans'tan oluşan krallıklar arası biyofilmlerdeki pH dinamiklerini izlemek için konfokal mikroskopi tabanlı bir yöntemi tanımlamaktadır. Biyofilmlerin hücre dışı bölgelerindeki pH düşüşlerini belirlemek için pH bağımlı çift emisyon spektrumu ve oranmetrik probu C-SNARF-4'ün boyama özellikleri nden yararlanılır. Prob ile pH oranlı metritrinin kullanımı, görüntüleme parametrelerinin titiz bir şekilde seçilmesi, boyanın ayrıntılı bir kalibrasyonu ve görüntü verilerinin dikkatli, eşik tabanlı post-processing'i gerektirir. Doğru kullanıldığında, teknik bir biyofilmin farklı alanlarında hücre dışı pH'ın hızlı bir şekilde değerlendirilmesini ve böylece zaman içinde hem yatay hem de dikey pH degradelerinin izlenmesini sağlar. Konfokal mikroskopi nin kullanımı Z-profillemi 75 μm veya daha az ince biyofilmlerle sınırlarken, pH ratiometrisi kullanımı krallıklar arası biyofilmlerde önemli bir virülans faktörünün noninvaziv çalışması için idealdir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hem mantar hem de bakteri türlerini içeren krallıklar arası biyofilmler oral kavitede çeşitli patolojik koşullarda yer almaktadır. Candida spp. sıklıkla endodontikenfeksiyonlardan izole edilmiş 1 ve periodontal lezyonlardan2,3. Mukozal enfeksiyonlarda, mitis grubundan streptokok türleri mantar biyofilm oluşumunu geliştirmek için gösterilmiştir, doku invazyonu, ve hem in vitro hem de murine modelleri yayma4,5,6,7. En ilginci, Candida spp oral taşıma. çocuklarda çürük yaygınlığı ile ilişkili olduğu kanıtlanmıştır8. Kemirgen modellerinde gösterildiği gibi, Streptococcus mutans ve Candidas albicans arasında simbiyotik bir ilişki hücre dışı polisakkaritüretimini artırır ve kalın ve daha karojenik biyofilm oluşumuna yol açar9,10.

Yukarıda bahsedilen tüm koşullarda, özellikle erken çocukluk çürükleri, biyofilm pH hastalığın ilerlemesi için önemlidir, ve asitojenik mikroortamların geliştirilmesi için biyofilm matris in güzide rolü11 devletler çapraz krallık biyofilm içinde pH değişiklikleri incelenmesine olanak sağlayan metodolojiler için çağırır. Bakteriyel12 ve mantar13 biyofilm içinde pH izlemek için basit ve doğru konfokal mikroskopi tabanlı yaklaşımlar geliştirilmiştir. Oranmetrik boya C-SNARF-4 ve eşik tabanlı görüntü işleme sonrası, hücre dışı pH bir biyofilm14her üç boyutta gerçek zamanlı olarak belirlenebilir. Biyofilmlerde mikroskopise dayalı pH izleme için yayınlanan diğer tekniklerle karşılaştırıldığında, C-SNARF-4 ile pH oranlı metrisi basit ve ucuzdur, çünkü referans boya15 veya iki foton uyarma16içeren parçacık veya bileşiklerin sentezini gerektirmez. Sadece bir boya kullanımı prob bölümleme ile sorunları önler, floresan kanama-through, ve seçici ağartma16,17,18 hala hücre içi ve hücre dışı pH arasında güvenilir bir farklılaşma için izin verirken. Son olarak, boya ile kuluçka biyofilm büyüme sonra yapılır, hangi laboratuvar ve yerinde yetiştirilen biyofilmler hem de incelenmesine olanak sağlar.

Bu çalışmanın amacı, pH orantisi kullanımını genişletmek ve krallıklar arası biyofilmlerdeki pH değişikliklerini incelemek için bir yöntem sunmaktır. Kavram kanıtı olarak, yöntem glukoza maruz kalan S. mutanlar ve C. albicanlardan oluşan çift tür biyofilmlerinde pH'ı izlemek için kullanılır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tükürük toplama protokolü Aarhus İlçesi Etik Komitesi (M-20100032) tarafından gözden geçirildi ve onaylandı.

1. Krallıklar Arası Biyofilmlerin Yetiştirilmesi

  1. Aerobik koşullarda 37 °C'de kan agar plakaları üzerinde S. mutans DSM 20523 ve C. albicans NCPF 3179 yetiştirin.
  2. Her organizmanın tek kolonilerini 5 mL beyin kalp infüzyonu (BHI) ile dolu test tüplerine aktarın. 37 °C'de aerobik koşullarda 18 saat büyüyün.
  3. 5 dk. 1.200 x g. Bir gecede kültürleri santrifüj, fizyolojik salin hücreleri resuspend ve C. albicans (~ 107 hücreleri / mL) ve S. mutans (~ 108 hücre / mL) için 0,5 OD550 nm ayarlayın. S. mutans süspansiyon seyreltmek 1:10 steril fizyolojik salin ile (~ 107 hücreleri / mL).
  4. Pipet 50 μL steril tükürük çözeltisi, de Jong ve ark.19yöntemine göre hazırlanan, mikroskopi için optik bir alt 96-iyi plaka kuyuları içine. 37 °C'de 30 dk kuluçka. Kuyuları 100 μL steril fizyolojik salin ile 3x yıkayın. Kuyuları boşaltın.
  5. Her kuyuya 100 μL C. albicans süspansiyon ekleyin. 90 dk. 3x steril fizyolojik salin ile 3x yıkayın 37 °C'de kuluçka.
    NOT: Yıkama sırasında kuyuları tamamen boşaltmayın. Aşırı kesme kuvvetini önlemek için 20°L'lik bir rezervuar bırakın.
  6. Her kuyuya 100 μL ısı yalıtımlı fetal sığır serumu (56 °C'de 30 dakika için inaktive) ekleyin. 37 °C'de 2 saat boyunca inkübed. Steril fizyolojik salin ile 3x yıkayın. 20 μL'lik bir rezervuar bırakarak kuyuları boşaltın.
  7. Her kuyuya 100 μL S. mutans süspansiyon (adım 1.3'te hazırlanmış) ekleyin. % 5 sakaroz içeren BHI 150 μL ekleyin. 37 °C'de 24 saat veya daha uzun süre kuluçkaya yatırın. Eski biyofilmleri yetiştirirken, orta günlük taze BHI değiştirin. Krallıklar arası biyofilm büyüme aşamasının sonunda steril fizyolojik salinle 5kat yıkayın.

2. Oranmetrik pH Görüntüleme

NOT:Biyofilm büyümesi tamamlandıktan hemen sonra oranmetrik pH görüntülemenin yapılması gerekmektedir.

  1. Oranmetrik pH görüntüleme için, 63x yağ veya su daldırma lensi, 543 nm lazer hattı ve spektral görüntüleme sistemi (yani META dedektörü) ile ters konfokal lazer tarama mikroskobu kullanın. Mikroskop aşamasını 35 °C'ye ısıtmak için bir kuluçka makinesi kullanın.
  2. 576−608 nm'den yeşil floresan tespiti ve 629−661 nm'den kırmızı floresan'ın eş zamanlı olarak algılanmasını sağlamak için dedektörü ayarlayın. Uygun bir lazer gücü seçin ve aşırı ve az pozlama önlemek için kazanç.
    NOT: Görüntülerin pozlanması en iyi palet görüntülerinde yanlış boyama ile görülür.
  3. İğne deliği boyutunu 1 Havadar Ünite veya ~0,8 m'lik optik dilimolarak ayarlayın. Ortalama seçeneği kullanarak 2 satır ortalaması seçin.
    NOT: Bir dizi denemenin başında, seçilen mikroskop ayarlarının bakteri hücreleri, mantar hücre duvarları, biyofilm matrisi ve mantar sitoplazması arasında net bir kontrast sağlayıp sağlamadığını kontrol edin.
  4. 100 μL steril fizyolojik salin içeren hazırlayın 0.4% (w / v) glikoz, pH 7 titrated. C-SNARF-4 (dimetil sülfoksit 1 mM) bir stok çözeltisi hazırlayın. Boyayı 30 μM'lik son konsantrasyona ekleyin.
    DİkKAT: Oranmetrik boyayı kullanırken nitril eldiven takın.
  5. 20 μL'lik bir rezervuar bırakarak, bir çapraz krallık biyofilm ile kuyulardan birini boşaltın. 96 kuyulu plakayı mikroskop aşamasına yerleştirin ve biyofilmi görüntülemeye başlayın.
  6. Biyofilmin farklı yerlerinde tek görüntü veya Z-yığınları edinin. Zaman içinde belirli görüş alanlarındaki pH değişikliklerini izlemek için mikroskop yazılımındaki X-Y konumunu işaretleyin. Düzenli aralıklarla, dedektör ofset düzeltmek için lazer kapalı görüntüleri almak.
  7. Farklı bir kuyuda yetiştirilen her biyofilmin analizi için 2.4-2.6 adımlarını tekrarlayın.

3. Oranmetrik Boyanın Kalibrasyonu

NOT: Boyanın kalibrasyonu ve kalibrasyon eğrisinin montajı oranmetrik pH görüntülemeden farklı bir günde yapılabilir.

  1. 35 °C'de 0,2 pH birim adımlarla pH 4.0−7.8'e ayarlanmış 50 mM 2-morolinoetanesülfonik asit (MES) tamponu hazırlayın. Pipet 150 μL her tampon çözeltisi bir optik alt 96-iyi plaka kuyuları içine mikroskopi için.
  2. Boyayı 96 kuyulu plakanın tampon dolu kuyularına 30 μM'lik son konsantrasyona ekleyin. 5 dakika boyunca dengeleyelim.
  3. Mikroskop aşamasını 35 °C'ye ısıtın. Oranmetrik pH görüntüleme ile aynı mikroskop ayarlarını seçin. 96 kuyulu plakayı mikroskop aşamasına yerleştirin. Kuyuların dibine odaklan. Tüm tampon çözümleri için kuyunun alt kısmından 5 μm yukarıda iki görüntü (yeşil ve kırmızı kanal) edinin. Düzenli aralıklarla, dedektör ofset düzeltmek için lazer kapalı görüntüleri almak.
  4. Kalibrasyon deneyini triplicate olarak gerçekleştirin.
  5. Tüm görüntüleri TIF dosyaları olarak dışa aktarın. Bunları özel görüntü analizi yazılımına (yani ImageJ20'ye)aktarın. Lazerle çekilen görüntüleri, arabellek çözümlerinin ilgili görüntülerinden kapatarak İşleme' yi tıklatarak çıkarın | Görüntü Hesaplama | Çıkar ).
    NOT: Gerekirse, Resim | Kırpma.
  6. Yeşil kanal görüntülerini kırmızı kanal görüntüleri ne kadar bölve analiz et ' i tıklatarak ortaya çıkan görüntülerdeki ortalama floresan yoğunluklarını hesaplayın | Histogram.
  7. Üç aylık deneylerden, ortalama yeşil/kırmızı oranları pH'a göre çizin. Bir işlevi kalibrasyon verilerine (örneğin, MyCurveFit) sığdırmak için özel yazılım kullanın.

4. Dijital Görüntü Analizi

NOT:Dijital görüntü analizi boya ve oranmetrik pH görüntülemenin kalibrasyonundan sonra herhangi bir zamanda yapılabilir.

  1. Yeşil ve kırmızı kanallı biyofilm görüntülerini ayrı klasörlerde saklayın ve her iki dosya serisini sıralı sayılarla yeniden adlandırın (örneğin, GREEN_0001). Görüntüleri özel görüntü analizi yazılımına (örneğin, ImageJ) aktarın. Analiz Et ' i tıklatın | Histogram lazer kapalı çekilen görüntülerde ortalama floresan yoğunluğunu belirlemek ve Süreç tıklayarak biyofilm görüntüleri değerini çıkarmak için | Matematik | Çıkar.
  2. 2 resim serisini özel görüntü analizi yazılımına (yani daime21)aktarın. Kırmızı kanal görüntülerinin eşiğe dayalı bölümlemesini gerçekleştirin (Segment | Otomatik segmentasyon | Özel eşik). Mantar sitoplazmasının floresan yoğunluğunun üzerindeki 'düşük' eşiği ve mantar hücre duvarlarının ve bakterilerin yoğunluğunun altındaki 'yüksek' eşiği ayarlayın.
    NOT: Uygun eşikler seçildiğinde, yalnızca hücre dışı alanlar nesne olarak kabul edilir.
  3. Parçalı görüntü serisinin nesne katmanını yeşil kanal görüntü serisine aktarın. Bunu yapmak için Segment | Nesne katmanını aktarın.
    NOT: Hücre dışı alanlar ile mantar sitoplazması arasındaki kontrast tek tek renk kanallarında çok zayıfsa, Düzenleme 'yi tıklatarak segmentasyondan önce yeşil kanal görüntü serisini kırmızı kanal serisine ekleyin | Görüntü hesap makinesi | Ek olarak. 4.2 altında açıklandığı şekilde segmentasyon gerçekleştirin ve parçalı görüntü serisinin nesne katmanını hem yeşil hem de kırmızı kanallı görüntü serisine aktarın.
  4. Kırmızı ve yeşil kanal görüntü serisindeki nesne olmayan pikselleri silmek için nesne düzenleyicisini çalıştırın (Visualizer | Nesne editörü | Tüm görüntülerde | Nesne olmayan pikselleri silin). Şimdi biyofilm görüntüleri hem bakteriyel hem de mantar hücrelerinden temizlenir. İşlenen görüntü serisini TIF dosyaları olarak dışa aktarın.
  5. Her iki resim serisini de ImageJ'e aktarın. ImageJ, nesne olmayan tüm piksellere 0 yoğunluğu atar. Kırmızı görüntü serisini (R1) kendi başına bölerek bu pikselleri kaldırın (İşlem | Görüntü hesap makinesi | Resim 1: R1; İşlem: Böl; Resim 2: R1) ve ortaya çıkan görüntü serisini (R2) orijinal kırmızı görüntü serisiile çarpma (İşlem | Görüntü hesap makinesi | Resim 1: R1; İşlem: Çarpma; Resim 2: R2). NaN'ın R1'de 0 şiddetinde tüm piksellere atanması dışında, R1 ile aynı olan üçüncü bir görüntü serisi (R3) oluşturulur. Yeşil görüntü serisi ile aynı şekilde devam edin.
  6. 'Ortalama' filtresini kullanın (İşlem | Filtreler | Ortalama | Yarıçap | 1 piksel) kırmızı ve yeşil kanal görüntü serisi dedektör gürültü telafi etmek için. Yeşil kanal görüntü serisini kırmızı kanal görüntü serisine böl (İşlem | Görüntü hesap makinesi | Resim 1: G3; İşlem: Böl; Resim 2: R3). Ortaya çıkan görüntü serisi (G3/R3), tüm nesne pikselleri için yeşil/kırmızı oranını gösterir.
  7. Her görüntü için ortalama oranı hesaplamak (Analiz | Histogram). Görüntülerdeki oranların daha iyi görsel gösterimi için yanlış boyama uygulayın (Resim | Arama Tabloları). Yeşil/kırmızı oranları 3,6'nın altına takılan işlevi kullanan pH değerlerine dönüştürün.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

24 saat ve 48 saat sonra, sağlam çapraz krallık biyofilmler kuyu plakaları geliştirdi. C. albicans ipliksi büyüme değişen derecelerde gösterdi ve S. mutans yüksekliği 35 μm kadar yoğun kümeler oluşturdu. Mantar hyphae etrafında gruplanmış Tek hücre ve S. mutan zincirleri ve büyük hücreler arası boşluklar hacimli bir matrisin varlığını göstermiştir(Şekil S1).

Oranmetrik boyanın kalibrasyonu asimetrik sigmoidal eğri13,

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C. albicans ve Streptococcus spp içeren çapraz krallık biyofilmlerin ekimi için farklı protokoller. daha önce9,22,23,24,25açıklanmıştır . Ancak, mevcut kurulum basit büyüme koşulları, düzenli çalışma günleri ile uyumlu bir zaman çizelgesi, dengeli bir tür bileşimi ve hacimli biyofilm matris gelişimi üzerinde duruluyor. Ayrıca, 96-iyi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Anette Aakjær Thomsen ve Javier E. Garcia mükemmel teknik destek için kabul edilmektedir. Yazarlar görüntü analizi üzerinde verimli tartışmalar için Rubens Spin-Neto teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Kan agar plakalarıStatens Serum Institut677
Beyin kalp infüzyonuOxoidCM1135
Beyin kalp infüzyonu +% 5 sükrozBDH laboratuvar malzemeleri10274
Candida albicansUlusal Patojenik Mantar KoleksiyonuNCPF 3179
D- (+) - GlikozSigma-AldrichG8270
daime: mikrobiyal ekolojide dijital görüntü analiziUniversitä t WienN/AFreeware; Sürüm 2.1; https://dome.csb.univie.ac.at/daime
Dimetil sülfoksitYaşam TeknolojileriD12345
Fetal sığır serumuGibco Life teknolojileri10270
GS-6R soğutmalı santrifüjBeckmanN/A
ImageJUlusal Sağlık EnstitüleriN / AÜcretsiz Yazılım; V1.46r; https://imagej.nih.gov/ij
>JavaOracleN/AImageJ'yi çalıştırmak için ücretsiz yazılım gereklidir; Sürüm 8.0; https://java.com/en/download
µ-Plate 96 Kuyu SiyahIbidi89626
MyCurveFitMyAssays Ltd.Yok
2- (N-Morfolino) etansülfonik asit (MES) tamponuBioworld700728
PHM210 pH-metreRadyometre Analitik Plan-Apochromat
63x yağa daldırma objektifiZeissN/ANA=1.4
SNARF®-4F 5- (ve-6) -Karboksilik AsitYaşam TeknolojileriS23920
Steril fizyolojik tuzlu suVWR6404
Streptococcus mutansDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenDSM 20523
Vis-spektrofotometre V-3000PCVWRN/A
XL kuluçka makinesiPeCONN/A
Zeiss LSM 510 METAZeissN/A

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Siqueira, J. F., Sen, B. H. Fungi in endodontic infections. Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and Endodontics. 97 (5), 632-641 (2004).
  2. Matic Petrovic, S., et al. Subgingival areas as potential reservoirs of different Candida spp in type 2 diabetes patients and healthy subjects. PloS One. 14 (1), 0210527(2019).
  3. De-La-Torre, J., et al. Oral Candida colonization in patients with chronic periodontitis. Is there any relationship. Revista Iberoamericana De Micologia. 35 (3), 134-139 (2018).
  4. Xu, H., et al. Streptococcal co-infection augments Candida pathogenicity by amplifying the mucosal inflammatory response. Cellular Microbiology. 16 (2), 214-231 (2014).
  5. Xu, H., Sobue, T., Bertolini, M., Thompson, A., Dongari-Bagtzoglou, A. Streptococcus oralis and Candida albicans Synergistically Activate μ-Calpain to Degrade E-cadherin From Oral Epithelial Junctions. The Journal of Infectious Diseases. 214 (6), 925-934 (2016).
  6. Dongari-Bagtzoglou, A., Kashleva, H., Dwivedi, P., Diaz, P., Vasilakos, J. Characterization of mucosal Candida albicans biofilms. PloS One. 4 (11), 7967(2009).
  7. Diaz, P. I., et al. Synergistic interaction between Candida albicans and commensal oral streptococci in a novel in vitro mucosal model. Infection and Immunity. 80 (2), 620-632 (2012).
  8. Xiao, J., et al. Candida albicans and Early Childhood Caries: A Systematic Review and Meta-Analysis. Caries Research. 52 (1-2), 102-112 (2018).
  9. Falsetta, M. L., et al. Symbiotic relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans synergizes virulence of plaque biofilms in vivo. Infection and Immunity. 82 (5), 1968-1981 (2014).
  10. Hwang, G., et al. Candida albicans mannans mediate Streptococcus mutans exoenzyme GtfB binding to modulate cross-kingdom biofilm development in vivo. PLoS Pathogens. 13 (6), 1006407(2017).
  11. Koo, H., Falsetta, M. L., Klein, M. I. The exopolysaccharide matrix: a virulence determinant of cariogenic biofilm. Journal of Dental Research. 92 (12), 1065-1073 (2013).
  12. Schlafer, S., Dige, I. Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms. Journal of Visualized Experiments. (109), 53622(2016).
  13. Schlafer, S., Kamp, A., Garcia, J. E. A confocal microscopy-based method to monitor extracellular pH in fungal biofilms. FEMS Yeast Research. 18 (5), (2018).
  14. Schlafer, S., Bælum, V., Dige, I. Improved pH-ratiometry for the three-dimensional mapping of pH microenvironments in biofilms under flow conditions. Journal of Microbiological Methods. 152, 194-200 (2018).
  15. Hidalgo, G., et al. Functional tomographic fluorescence imaging of pH microenvironments in microbial biofilms by use of silica nanoparticle sensors. Applied and Environmental Microbiology. 75 (23), 7426-7435 (2009).
  16. Vroom, J. M., et al. Depth Penetration and Detection of pH Gradients in Biofilms by Two-Photon Excitation Microscopy. Applied and Environmental Microbiology. 65, 3502-3511 (1999).
  17. Lawrence, J. R., Swerhone, G. D. W., Kuhlicke, U., Neu, T. R. In situ evidence for metabolic and chemical microdomains in the structured polymer matrix of bacterial microcolonies. FEMS Microbiology Ecology. 92 (11), (2016).
  18. Franks, A. E., et al. Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm. Energy Environmental Science. 2 (1), 113-119 (2009).
  19. de Jong, M. H., van der Hoeven, J. S., van OS, J. H., Olijve, J. H. Growth of oral Streptococcus species and Actinomyces viscosus in human saliva. Applied and Environmental Microbiology. 47 (5), 901-904 (1984).
  20. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  21. Daims, H., Lücker, S., Wagner, M. Daime, a novel image analysis program for microbial ecology and biofilm research. Environmental Microbiology. 8 (2), 200-213 (2006).
  22. Barbosa, J. O., et al. Streptococcus mutans Can Modulate Biofilm Formation and Attenuate the Virulence of Candida albicans. PloS One. 11 (3), 0150457(2016).
  23. Thein, Z. M., Samaranayake, Y. H., Samaranayake, L. P. Effect of oral bacteria on growth and survival of Candida albicans biofilms. Archives of Oral Biology. 51 (8), 672-680 (2006).
  24. Krzyściak, W., et al. Effect of a Lactobacillus Salivarius Probiotic on a Double-Species Streptococcus Mutans and Candida Albicans Caries Biofilm. Nutrients. 9 (11), 1242(2017).
  25. Liu, S., et al. Nicotine Enhances Interspecies Relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans. BioMed Research International. 2017, 7953920(2017).
  26. Schlafer, S., Meyer, R. L. Confocal microscopy imaging of the biofilm matrix. Journal of Microbiological Methods. 138, 50-59 (2017).
  27. Schlafer, S., et al. Ratiometric imaging of extracellular pH in bacterial biofilms with C-SNARF-4. Applied and Environmental Microbiology. 81 (4), 1267-1273 (2015).
  28. Ohle, C., et al. Real-time microsensor measurement of local metabolic activities in ex vivo dental biofilms exposed to sucrose and treated with chlorhexidine. Applied and Environmental Microbiology. 76 (7), 2326-2334 (2010).
  29. Schlafer, S., et al. pH landscapes in a novel five-species model of early dental biofilm. PloS One. 6 (9), 25299(2011).
  30. Divaris, K., et al. The Supragingival Biofilm in Early Childhood Caries: Clinical and Laboratory Protocols and Bioinformatics Pipelines Supporting Metagenomics, Metatranscriptomics, and Metabolomics Studies of the Oral Microbiome. Methods in Molecular Biology. 1922, Clifton, N.J. 525-548 (2019).
  31. Stewart, P. S. Mini review: convection around biofilms. Biofouling. 28 (2), 187-198 (2012).
  32. Stoodley, P. Biofilms: Flow disrupts communication. Nature Microbiology. 1, 15012(2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

H cre D pH zlemepH RasyometrisiC SNARF 4 ProbuCandida albicansStreptococcus mutansBiyofilm B y mesiG r nt SegmentasyonuFloresan G r nt leme

İlgili makaleler