Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Fotoakustik Akış Sitometri kullanarak Yumurtalık Kanseri Algılama

5.6K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/60279

⸱

17 Ocak 2020

 ,  , 
1School of Biological and Health Systems Engineering, Arizona State University

Bu makalede

Özet

Özel yapım fotoakustik akış sistemi ve hedeflenen folik asit kaplı bakır sülfür nano tanecikleri kullanarak dolaşan yumurtalık tümör hücrelerini tespit etmek için bir protokol sunulmaktadır.

Özet

Birçok çalışma, dolaşımdaki tümör hücrelerinin numaralandırma öneririz (CtCs) yumurtalık kanseri için prognostik bir araç olarak umut gösterebilir. CtCs tespiti için mevcut stratejiler akış sitometrisi, mikroakışkan cihazlar ve gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) içerir. Son gelişmelere rağmen, erken yumurtalık kanseri metastazı tespiti için yöntemler hala klinik çeviri için gerekli duyarlılık ve özgüllük eksikliği. Burada, bir akış odası ve şırınga pompası da dahil olmak üzere özel bir üç boyutlu (3D) baskılı sistem kullanarak fotoakustik akış sitometri (PAFC) ile yumurtalık dolaşan tümör hücrelerinin tespiti için yeni bir yöntem sunulmaktadır. Bu yöntem PAFC tarafından SKOV-3 yumurtalık kanseri hücrelerini hedeflemek için folik asit kaplı bakır sülfür nano tanecikleri (FA-CuS NPs) kullanır. Bu çalışma yumurtalık kanseri hücreleri için bu kontrast ajanların yakınlık göstermektedir. Sonuçlar, floresan mikroskobu ile NP karakterizasyonu, PAFC saptama ve NP alımını göstererek, bu yeni sistemin yumurtalık CtC'lerini fizyolojik olarak ilgili konsantrasyonlarda tespit etme potansiyelini göstermektedir.

Giriş

Yumurtalık kanseri en ölümcül jinekolojik malignitelerden biridir ve 2018 yılında dünya çapında tahmini 184.800 ölümle sonuçlanmıştır1. Birden fazla çalışma yumurtalık kanseri ilerlemesi arasındaki korelasyon göstermiştir (yani, metastaz) ve CTCs varlığı2,3,4. CtCs algılama ve izolasyon için en yaygın yöntem EpCam reseptörüreseptör 5hedefleyen Cellsearch sistemi kullanır. EpCam ekspresyonu, ancak, mezenkimal geçiş epitelyal indirgenmiş, hangi kanser metastazı karıştığı olmuştur6. Gelişmelere rağmen, mevcut klinik teknolojiler hala düşük doğruluk, yüksek maliyet ve karmaşıklık muzdarip. Bu sakıncalar nedeniyle, yumurtalık CtCs keşfi ve numaralandırma için yeni teknolojiler araştırma için önemli bir alan haline gelmiştir.

Son zamanlarda, PAFC kanser hücrelerinin noninvaziv tespiti için etkili bir yöntem olarak ortaya çıktı, nanomalzemelerin analizi, ve bakterilerin belirlenmesi7,8,9. PAFC fotoakustik kullanarak akış analitleri algılayarak geleneksel floresan akış sitometrisinden farklıdır. Fotoakustik etki lazer ışığı termoelastik genişlemeye neden olan bir malzeme tarafından emildiğinde oluşturulur, bir ultrason transdüser tarafından tespit edilebilir bir akustik dalga üreten10,11. PAFC'nin geleneksel akış sitometri yöntemlerine göre avantajları arasında basitlik, klinik ayarlara çeviri kolaylığı ve hasta örneklerinde daha önce görülmemiş derinliklerde CTC'lerin saptanması12,13. Son çalışmalar da endojen ve eksojen kontrast14,15kullanarak hücrelerin tespiti için PAFC sistemleri kullanılmıştır. Yakın kızılötesi (NIR) indocyanine yeşil boya gibi ışık emici kontrast ajanlar, ve metal NPs (örneğin, altın ve CuS) fotoakustik görüntüleme ile birlikte hücre ve dokuların seçici etiketleme için kullanılmıştır16,17,18. Biyolojik dokularda NIR ışığının penetrasyon derinliğinin artması sayesinde, emicilerin fotoakustik tespiti klinik uygulamalar için daha büyük derinliklerde yapılabilir. Klinikte kullanım için büyük potansiyeli nedeniyle, PAFC ile hedeflenen NIR kontrast ajanların kombinasyonu CTCs tespiti için önemli bir ilgi yarattı.

PAFC, hedeflenen kontrast ajanlarla birlikte hasta numunelerinin yüksek iş lenme analizi için geliştirilmiş bir yaklaşım sağlar ve CTC'lerin hedefli tespiti ile hasta numunelerinin hedefli saptanması sağlar. CtC'ler için temel algılama stratejilerinden biri, ilgi hücresinde bulunan membran proteinlerinin özel hedeflemesidir. Yumurtalık CtCs bir önemli özelliği kendi dış membran üzerinde bulunan folat reseptörlerinin aşırı ekspresyonu19. Fotrik reseptör hedefleme kanda yumurtalık CtCs belirlenmesi için ideal bir stratejidir çünkü endojen hücreler, folik asit reseptörlerinin yüksek ekspresyonu var, genellikle luminal ve kan dolaşımına sınırlı maruz kalma var20. Bakır sülfür NPs (CuS NPs) son zamanlarda kanserli hücreler üzerinde ifade folat reseptörleri hedef yetenekleri için kabul edilmiştir21. Biyouyumluluk, sentez kolaylığı ve NIR'nin derinliklerinde ki emilimi ile birlikte, bu NP kontrast maddeler PAFC kullanan yumurtalık CTC'lerinin tespiti için ideal bir hedefleme stratejisi dir.

Bu çalışma, FA-CuS NPs hazırlanması ve bir fotoakustik akış sisteminde yumurtalık kanseri hücrelerinin tespiti için bunların kullanımı açıklar. CuS NPs özellikle yumurtalık CTCs hedef ve 1.053 nm lazer ile uyarıldığında bir fotoakustik sinyal yontmak folik asit ile modifiye edilir. Sonuçlar, PAFC sistemi içinde bu fotoakustik kontrast ajanlar ile kuluçkaya yatan yumurtalık kanseri hücrelerinin başarılı bir şekilde saptandığını göstermektedir. Bu sonuçlar yumurtalık kanseri hücrelerinin 1 hücre/μL konsantrasyonlarına kadar saptanmasını göstermektedir ve floresan mikroskopi bu parçacıkların SKOV-3 yumurtalık kanseri hücreleri tarafından başarılı alımını doğrular22. Bu çalışma, FA-CuS NPs sentezinin ayrıntılı bir açıklamasını, floresan mikroskopisi için numunelerin hazırlanmasını, fotoakustik akış sisteminin yapımını ve yumurtalık kanseri hücrelerinin fotoakustik saptanmasını sağlar. Sunulan yöntem FA-CuS NPs kullanarak akış yumurtalık CTCs başarılı bir şekilde belirlenmesi gösterir. Gelecek çalışma yumurtalık kanseri metastazı erken teşhisi doğru bu teknolojinin klinik uygulama üzerinde durulacak.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Nanopartikül Sentezi ve İşlevselleştirme

NOT: FA-CuS NPs sentezi daha önce yayınlanmış bir protokol21uyarlanmış bir pot sentez yöntemi kullanılarak elde edilir.
DİkKAT: Tüm sentezler havalandırılan kimyasal duman kaputunda yapılmalıdır.

  1. Sentezden önce, yaklaşık 300 mL deiyonize (DI) su filtreleme, 0,2 μm steril filtre olsa.
  2. 250 mL cam yuvarlak alt şişeyi deterjan çözeltisi ile temizleyin ve DI suyla durulayın. 1 mM çözelti oluşturmak için 100 mL DI suya 0,0134 g CuCl2 ekleyin.
  3. CuCl2 çözeltisine 0,015 g folik asit (FA) ekleyin ve manyetik bir karıştırma çubuğu kullanarak ~5 dk karıştırın.
  4. 200 μL l l'lik bir pipet kullanarak reaksiyon karışımına yaklaşık 10 s'den fazla Na2S·9H2O (100°L DI suda 0,024 g) ekleyin.
    NOT: Na2S·9H2O eklendikten sonra, çözelti açık sarıdan koyu kahverengiye renk değiştirir.
  5. 90 °C'ye ayarlanmış bir yağ banyosunda reaksiyon uyguluyor ve manyetik bir karıştırma çubuğuyla karıştırmaya devam edin. Yaklaşık 15 dakika sonra veya yağ banyosu 85−90 °C'ye ulaştığında reaksiyonun bir saat daha devam etmesini bekleyin. Karışımınız yavaş yavaş koyu yeşil bir renge dönüşmelidir.
    NOT: Basınç birikmesini önlemek için reaksiyon karışımını ısıtırken sistemi boşalttığından emin olun.
  6. Reaksiyon kabını yağ banyosundan çıkarın ve buz banyosuna geçmeden önce yaklaşık 10 ila 15 dakika oda sıcaklığında kısa bir süre soğutun.
  7. Reaksiyon karışımı 20 °C'nin altına soğuduktan sonra, kalan folik asidi çözeltiye dönüştürmek için pH'ı 1M NaOH kullanarak 10'a ayarlayın.
  8. 30 kDa santrifüj sütunu kullanarak FA-CuS reaksiyon karışımını arındırın. 15 dk için 3.082 x g'de kolona 15 mL toplu olarak çözelti ekleyin.
  9. Reaksiyon karışımının tamamı yoğunlaştıktan sonra konsantre kesirleri yeniden birleştirin ve 30 kDa santrifüj sütununda 15 mL pH 10 NaOH ile 4x yıkayın.
  10. Kütle ölçümleri için çözeltinin 1/3'ünü (~66 μL) alın ve üç cam şişeye bölün. ~ 27 mmHg bir vakum altında 40 °C'de bir vakum fırında bir gecede kuru.
  11. Konsantre çözeltinin diğer 2/3'ü 250 μL PBS'ye eritin ve daha fazla kullanıma kadar 4 °C'de saklayın.
  12. ÖNCE FA-CuS NPs kullanarak, yüksek bir ortamda bir banyo sonicator 30 dakika boyunca sonicate.

2. NP Karakterizasyonu

  1. Dinamik ışık saçılımı (DLS) 1.1.14 ile 2 mL DI su adımından PBS çözeltisine 10 μL konsantre FA-CuS NPS ekleyin. DLS ile karakterizasyonu önce, yüksek bir ayarda bir banyo sonicator 30 dakika için parçacıkları sonicate ve kalan toz kaldırmak için 0,2 μm steril filtre ile filtre.
  2. İletim elektron mikroskobu (TEM) gerçekleştirin : Bir balmumu kağıt parçasına PBS çözeltisine 10 μL konsantre FA-CuS NPS ekleyin. Damlacık üstüne bir formvar kaplı bakır ızgara ters ve 2 dakika boyunca oturup izin verin. Fazla sıvı kaldırmak için filtre kağıdı bir parça formvar kaplı ızgara kenarına dokunun. Havanın kurumasına izin verin. 80 kV'luk hızlanan voltajda elektron mikroskobu kullanan bakır ızgarayı görüntüleyin.
    NOT: FA-CuS NPS karakterizasyonundan tipik sonuçlar Şekil 1'desunulmuştur.

3. Hücre Kültürü

  1. Bu protokolde SKOV-3 hücreleri kullanılmaktadır. Aksi belirtilmedikçe, McCoy'un 5A orta bölgesinde FBS, 100 U/mL penisilin ve 100 μg/mL streptomisin ile desteklenen kültür SKOV-3 hücreleri ve nemlendirilmiş %5 CO2 kuluçka makinesinde 37 °C'de kalır.

4. Fa-Cus NPS'nin Mikroskopi için Floresan Etiketlemesi

  1. Texas-Red-X succinimidyl ester (0.2 mg DMSO içinde 10 mg /mL konsantrasyonda çözünmüş) 0.1 M NaHCO3 (pH ~ 9) tampon 1 mL FA-CuS NPs 2 mg içeren bir çözelti ekleyin.
  2. Oda sıcaklığında ışıktan uzakta, 1 saat boyunca manyetik bir karıştırma çubuğu kullanarak reaksiyon karışımını karıştırın.
  3. Reaksiyon karışımını 4 mL 30 kDa MWCO santrifüj sütununa 10 dk boyunca 4.000 x g'da dönerek yoğunlaştırın.
  4. Konsantre çözeltiyi 3x 4 mL 0,1 M NaHCO3 tampon (pH ~9) ile bir santrifüj sütununda yıkayın. Daha sonra, konsantre çözeltiyi 4 mL DI su 3x ile yıkayın veya UV-VIS ile akışta sadece bir miktar floresan görülene kadar.

5. Fa-CuS NPS Uptake Yumurtalık Kanseri Hücreleri tarafından

  1. FA-CuS NPs ile kuluçkadan önce, SKOV-3 hücrelerini T75 şişesinde 8−15 mL folik-asitiçermeyen RPMI-1640 ortama % 10 FBS ve %1 penisilin/streptomisin ile en az 24 saat kuluçkaya yatırın.
  2. 0,5 mL folik-asitsiz RPMI-1640 tam büyüme ortamındaki tohum hücreleri 0,1 x 106 hücre/mL'lik bir yoğunlukta 24 kuyu plakasına dönüşür.
  3. Ertesi gün, 400 μg/mL FA-CuS NPS'li hücreler 0,5 mL folik-asitsiz RPMI-1640 tam büyüme ortamı ile 2 saat boyunca inküler.
  4. Bu inkübasyonu takiben hücreleri 0.5 mL ve EDTA ile %0.25 tripsin ile deneyin. Tripsini nötralize etmek için en az 1 mL folik asitsiz RPMI-1640 tam büyüme ortamı ekleyin ve 6 dk için 123 x g'de hücreleri santrifüj edin.
  5. Supernatant çıkarın, PBS 2 mL hücreleri yeniden askıya ve 6 dakika için 123 x g santrifüj. Herhangi bir bağlı NPs kaldırmak için bu yıkama adımı 2x gerçekleştirin.
  6. PBS'nin 1−2 mL'indeki hücreleri %2 Ara çözeltisi ile yeniden askıya alın.
  7. Hücreleri hemositometre ve trippan mavisi kullanarak sayın. Hücre sayısı çok yüksekse hücreleri daha da seyreltin. PBS'deki hücreleri %2 Ile seyreltin ve algılama için seçilen konsantrasyona ulaştırın.
  8. Hücreler artık PAFC sistemi tarafından analiz edilmeye hazır.

6. FA-CuS NPS Alımıfloresan Mikroskobu

  1. Adım 5.1'de listelenen adımları tekrarlayın ve mikroskopi için aşağıdaki protokole devam edin.
  2. 0,5 mL folik-asitiçermeyen RPMI-1640 tam büyüme ortamı 24 kuyu plakalı cam kapaklar üzerinde 0.1 x 106 hücre/mL yoğunlukta tohum hücreleri.
  3. Ertesi gün, 100 μg/mL, 200 μg/mL, 300 μg/mL ve 0,5 mL folik-asitsiz RPMI-1640 tam büyüme mediasında 400 μg/mL konsantrasyonlarda floresan etiketli FA-CuS NPs'leri triplicate olarak kuluçkaya yatırın.
  4. Hücreleri 37 °C inkübatörde 2 saat nps ile kuluçkaya yatırın
  5. Bu kuluçka dönemini takiben hücreleri 3x PBS ile yıkayın.
    NOT: Tüm yıkama adımları için, hücreleri rahatsız etmemek için kuyu plakasının yan tarafına çözeltiyi dikkatlice ekleyin. İlaveden sonra, plakayı dikkatlice yatırın ve çözeltiyi kuyunun kenarından çekin.
  6. PBS'de 0,5 mL 3,7(% 3,7 paraformaldehit (PFA) ile hücreleri 15 dakika kuluçkaya yatırın ve cam kapakları yeni bir 24 kuyu plakasına aktarın.
    DİkKAT: PFA bilinen bir karsinojendir. Havalandırılan kimyasal duman kaputunda tüm fiksasyon yapın ve uygun kişisel koruyucu ekipman giymek.
  7. Hücreleri %3.7'lik bir çözeltide, PBS'de %0.1 Triton-X ile 5 dakika kuluçkaya yatırın.
  8. Hücreleri 0,5 mL PBS 3x ile 5 dakika boyunca yıkayın ve kapakları yeni bir tabağa aktarın.
  9. 5 dakika boyunca, ışıktan uzakta, DAPI içeren bir PBS çözeltisinin 0,5 mL'lik (boyama için 0,5 mg/mL stok çözeltisinin 20 μL/mL'si kullanılır) hücreleri kuluçkaya yatırın.
  10. Hücreleri PBS 3x ile yıkayın.
  11. Son PBS yıkamadan sonra, kapakları montaj ortamına sahip slaytlara monte edin.
  12. Hücreler floresan mikroskobu ile görüntülenmeye hazır. Şekil 2 floresan mikroskopi ile tipik hücre karakterizasyonu bir örnek gösterir.

7. Akış Sistemi Mimarisi

  1. Akış odası inşaatı
    NOT: 3D baskılı akış tankısolidworks dosyası Ek Malzemelerbulunabilir.
    1. Sağlanan SolidWorks dosyasını kullanarak, 3D akış tankını ABS termoplastik veya PLA plastik kullanarak yazdırın. SolidWorks kullanılamıyorsa boyutlar aşağıda verilmiştir. Şekil 3A bu modelin bir temsilini gösterir. Akış tankının gövdesi 2,5 cm x 1,5 cm x 7,5 cm'dir. Akış tankının uzak uçları, kılcal tüpü içeren tüpün girişine izin vermek için yaklaşık 5 mm çapında delikler içerir.
      NOT: Akış tankı, ultrason transdüserinin yerleştirilmesi için kapiller tüpün yönünü dik olarak 1 cm'lik bir deliğe sahiptir. Delik le aynı iç çapa sahip silindirik bir ekstrüzyon tanka 6 mm kadar uzanır. Gerçek zamanlı görüntüleme için akış tankı, kılcal tüpün hemen altında 1 mm x 3 mm'lik bir yuvaya sahiptir.
    2. 3B akış tankı yazdırıldıktan sonra, sistemi temizleyin ve kullanmak üzere monte edin.
    3. Cam kapakları 1 mm x 3 mm'lik yuvaya ve akış sistemine 1 cm delik yerleştirin.
    4. Sızıntıyı önlemek için silikon ile dikkatlice kapatın.
    5. Kılcal tüpü silikon kürlenmiş tüplere yerleştirin. Akış tankının yan tarafı cam kılcal borunun 3 mm'lik yuvanın ve 1 cm'lik deliğin hemen üstünde ve önünde olmasına rağmen tüpleri akış odasına takın.
    6. Sızıntıyı önlemek için boruyu silikon kullanarak kapatın.
  2. Fotoakustik akış sistemi kurulumu
    NOT: Şekil 3B ve Şekil 3C akış sistemi mimarisinin bir örneğini göstermektedir.
    1. Transdüseri ultrason darbecisine/alıcıya bağlayın. 59 dB kazanç ile sinyali yükseltin.
    2. Filtrenin çıktısını, dahili alan programlanabilir geçit dizisiyle donatılmış çok amaçlı yeniden yapılandırılabilir bir osiloskopa bağlayın.
    3. Akış odasından gelen tüplerden birini, her daldaki iki şırınga pompasına bağlı bir T kavşağına bağlayın.
    4. Şırınga pompalarından birini havayla, diğer pompayı da analiz edilecek numuneyle doldurun. Hava içeren pompayı 40 μL/dk akış hızına, numuneyi içeren pompayı ise 20 μL/dk akış hızına ayarlayın. Elde edilen iki fazlı akış 1 μL numune hacimleri üretecektir. Bu akış hızında, sistem dakikada yaklaşık 6,4 örnek test edecektir.
      NOT: Hücrelerin tutarlı bir dağılımını korumak için, test edilmeden hemen önce her numuneyi hafifçe girdaplayın. Buna ek olarak, hücrelerin çözeltiye yerleşmesini önlemek için şırıngayı birkaç dakikada bir döndürün.
    5. Akış sisteminden çıkan kalan tüpü çamaşır suyu ile bir kap kabına bağlayın ve akış sisteminden çıktıktan sonra hücreleri atın.
      NOT: Akış sistemini kullanmadan önce sızıntıları kontrol edin, çünkü bunlar akışı etkileyebilir. İşlem sırasında biyolojik güvenliği sağlamak için hücreler kapalı bir sistem içinde tutulmalıdır.
    6. 3D baskılı tankın tasarımı, transdüser ve lazer ışığı arasında en az kalibrasyonla tutarlı ve tekrarlanabilir hizalama sağlar. Kuvars kılcal tüp, özel tankın içine doğru yerleştirildiğinde transdüser ve lazerin doğrudan hizalanmış olmasını sağlar.
    7. Kuvars kılcal borunun bölümünü transdüserle doğrudan hizaya yerleştirin, mikroskopun görüş alanına, böylece optik fiberin tüpün tüm genişliğini aydınlatır gibi numunenin üzerine dikkatli bir şekilde yerleştirilmesine olanak tanıyın.
    8. 1.053 nm dalga boyunda çalışan diyot pompalı katı hal lazer kanalize bir optik fiber kullanarak örnek ışınlamak. Numunedeki lazer ışığı olayı ve fotoakustik etkiyi ölçmek için kullanılan dönüştürücü nün her ikisi de odaklanmamış durumda.
    9. Numuneüzerindeki lazer olayının enerjisi yaklaşık 8 mJ'dir ve 10 Hz lazer hızı, sistemden geçerken her numuneyi birden fazla kez aydınlatmak için yeterlidir.
    10. Akış sistemini ters bir mikroskobun üzerine yerleştirin ve hem lazer darbesinin hem de numunenin yolunun akış sistemi geçerken görünür olmasını sağlayın. Mikroskopa monte edilmiş bir kamera kullanarak kayıt akışı.
    11. Veri toplama yazılımını kullanarak ultrason satın almalarını kaydedin (bkz. Malzeme Tablosu). Tetik ultrason ve FPGA kullanarak darbeli lazer. PBS'yi %2'lik Tween ile ve FA-CuS NPs'i PBS%2'lik tween'de 100 μg/mL konsantrasyonda negatif ve pozitif kontroller olarak kullanır.
    12. Mikroskopla monte edilmiş bir kamera kullanarak, hem lazerin ateşini hem de akış sistemi olmasına rağmen örneklerin geçişini kaydedin. Bu kayıtlar, transdüser tarafından kaydedilen akustik sinyali lazerin ateşlemesiyle ilişkilendirmek için kullanılacaktır. Örnekler lazerin ateşinin önünden geçerken, sinyal analiz için ortaya çıkan fotoakustik sinyalle ilişkilendirilebilir. 10 Hz örnekleme hızında, lazer her fişi birkaç kez aydınlatır.

8. Post İşleme

  1. Her sinyal edinimi için, s(t), analitik bir sinyal oluşturmak için Hilbert dönüşümü, H[s(t)]' yi hesaplayın.
  2. Analitik sinyalin büyüklüğünü hesaplayarak karmaşık bir zarf, se(t) oluşturun figure-protocol-1 ve her satın almadan kaynaklanan toplam sinyali ölçmek için zarfı entegre edin. R istatistik yazılımında t-testi kullanan her test grubundan (yani PBS, etiketli hücreler, FA-CuS NPs, tek başına hücreler) gelen sinyalleri karşılaştırın. Ham fotoakustik sinyaller ve Hilbert dönüşümleri Şekil 4'tesunulmuştur.
  3. Görüntü yeniden yapılandırmaiçin, karmaşık zarfı tüm çalıştırma boyunca maksimum tepeye göre normalleştirin. Bir dizi çalıştırmayı karşılaştırıyorsanız, tüm serideki maksimum tepe yi kullanarak karmaşık zarfı normalleştirin. Normalleştirmeden sonra, her ediyi bir dizi piksel değerine dönüştürün. Görüntü yapılandırmasında ki her piksel değerleri serisini bir sütun olarak temsil edin. PBS ve FA-CuS NPs sinyallerinin temsili yeniden yapılandırılması Şekil 5'tegösterilmiştir ve her iki görüntü de her iki çalıştırmada da maksimum tepe noktası kullanılarak normalleştirilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Şekil 1A sentezlenen nano taneciklerin tipik bir TEM görüntüsünü gösterir. Tipik nanopartikülün ortalama boyutu yaklaşık 8,6 nm ± 2,5 nm'dir. Nanopartikül ölçümü ImageJ'de gerçekleştirildi. Parçacıkların ölçülmesi için ayrı ayrımak için eşik ve havza fonksiyonları uygulandı. Her parçacığın yatay ve dikey çapları birbirine dik olarak ölçüldü ve daha da ortalamaya ulaştı. DLS için şekil 1B'detemsil...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu protokol, PAFC ve hedeflenen CuS kontrast maddesi kullanan yumurtalık CTC'lerinin tespiti için basit bir yöntemdir. Birçok yöntem yumurtalık CTCs tespiti için araştırılmıştır, mikroakışkan cihazlar da dahil olmak üzere, RT-PCR, ve floresan akış sitometri23,24,25. Bu karmaşıklık, maliyet ve doğruluk aralığı, klinik ortamlarda etkinliğini sınırlayan. PAFC, hasta örneklerindeki CTC'leri algılama yeteneği ve in vivo uygulamaların...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Yazarlar madeleine Howell sentezi ile yardım için kabul etmek istiyorum, Matthew Chest onun yardım akış sistemi tasarımı için, ve Ethan Marschall SolidWorks ile yardım için.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Corning25-053-Clile% 0.025 tripsin
; m 1.000 mL Vakumlu Filtrasyon ÜnitesiVWR10040-440Daha büyük hacimlerde DI suyunu filtrelemek için.
0.2 ve mikro; m steril şırınga filtresiVWR28145-477
3D Baskılı TankIsmarlama
Edinme KartıUlusal AletlerPXIe-5170R250 MS/s, 8 Kanallı, 14 bit
AlconoxSigma-Aldrich242985-1.8KGCam eşyaların temizliğinde kullanılan deterjan.
Amicon Ultra-15 Santrifüj FiltrelerMilliporeUFC903024
Amicon Ultra-4 Santrifüj FiltrelerMilliporeUFC803024
Parlak Çizgili HematositometreHausser Scientific1492
Bakır(II) KlorürACROS ORGANICS206532500
Kaplin HedefiThorlabsLMH-10x-532Çift için optik fibere darbeli ışık.
Kaplin AşamasıNewportF-91-C1-TSage, darbeli ışığı objektife bağlamak için. FP-1A ve LMH-10x-532
CPX Serisi Dijital Ultrasonik Temizleme BanyosuFisherbrandModel CPX3800
Veri Toplama yazılımınıNational InstrumentsNI LabVIEW 2017 (32 bit)LabVIEW, lazer darbelerini veri toplama ile senkronize etmek için kullanılır.
Veri İşleme YazılımıMathworksMatlab R2016aMatlab yazılımı kullanılarak üretilen rekonstrüksiyonlar ve grafikler.
FBSSigma-AldrichF2442-500ML
Fiber AynaNewportFPH-DJÇıplak elyafı tutmak için kullanılır.
Fiber BağlayıcıNewportFP-1AFiber aynayı ve optik fiberi objektifin odağına konumlandırmak için 3 Eksenli aşama.
Folik AsitSigma-AldrichF7876-10G
Formvar Kaplı TEM Izgaraları ElektronMikroskobu BilimleriFCF300-CU-SB
Masterflex BoruCole ParmerEW-96420-14
McCoy's 5A OrtaATCC30-2007
Norm-Ject 10 mL ŞırıngalarHENKE SASS WOLF4100-X00V0
Fiber OptikThorlabsFG550LECNumuneyi darbeli ışığa maruz bırakmak için kullanılır.
PBSAlfa AesarJ62036
Penisilin StreptomisinGIBCO15140-122
Darbeli LazerRPMC Lazerler IncQuantus-Q1D-10531053 nm, 8 ns darbe, maksimum 10 Hz özelliklerine sahip darbeli lazer kaynağı.
Pulser/AlıcıOlympus5077PRFotoakustik sinyalleri alır, filtreler ve yükseltir. 59 dB Kazanç ile çalışır.
Kuvars Kılcal BoruSutter AletiQF150-75-10
RPMI Midum 1640 (1x) Folik Asit İçermeyenGibco27016-021
SilikonMomentive Performans Malzemeleri, Inc.GE284
SKOV-3 HücreleriATCCHTB-77
Sodyum BikarbonatSigma-AldrichS5761
Sodyum KarbonatSigma-AldrichS7795-500G
Sodyum Hidroksit BoncuklarıBDHBDH9292-500G
Sodyum Sülfür NonahidratSigma-Aldrich431648-50G
Şırınga PompalarıNew Era Pump Systems IncDUAL-1000
Texas Red-X-Succinimydl esterInvitrogen1949071
DönüştürücüOlynmpusV214-BB-RMMerkezi frekansı 50 MHz ve -6 dB fraksiyonel bant genişliğine sahip %82 ultrason dedektörü.
Tripan Mavisi Çözeltisi% 0.4AmrescoK940-100ML
Tween 20Sigma-AldrichP7949-100ML
Ultrason JeliParker Laboratories Inc.Aquasonic 100Dönüştürücü bağlantısı için ultrason jeli
EDTA 0.2 ve mikro içerir

Kaynaklar

  1. Ferlay, J., et al. Estimating the global cancer incidence and mortality in 2018: GLOBOCAN sources and methods. International Journal of Cancer. 144 (8), 1941-1953 (2019).
  2. Zhang, X., et al. Analysis of circulating tumor cells in ovarian cancer and their clinical value as a biomarker. Cellular Physiology and Biochemistry. 48 (5), 1983-1994 (2018).
  3. Zhou, Y., et al. Prognostic value of circulating tumor cells in ovarian cancer: a meta-analysis. PLoS One. 10 (6), e0130873(2015).
  4. Guo, Y. X., et al. Diagnostic value of HE4+ circulating tumor cells in patients with suspicious ovarian cancer. Oncotarget. 9 (7), 7522-7533 (2018).
  5. Lianidou, E., Hoon, D. 9 - Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor DNA. Principles and Applications of Molecular Diagnostics. , 235-281 (2018).
  6. Gorges, T. M., et al. Circulating tumour cells escape from EpCAM-based detection due to epithelial-to-mesenchymal transition. BMC cancer. 12 (1), 178(2012).
  7. Galanzha, E., Zharov, V. Circulating tumor cell detection and capture by photoacoustic flow cytometry in vivo and ex vivo. Cancers. 5 (4), 1691-1738 (2013).
  8. Nedosekin, D. A., et al. In vivo noninvasive analysis of graphene nanomaterial pharmacokinetics using photoacoustic flow cytometry. Journal of Applied Toxicology. 37 (11), 1297-1304 (2017).
  9. Zharov, V. P., Galanzha, E. I., Kim, J., Khlebtsov, N. G., Tuchin, V. V. Photoacoustic flow cytometry: principle and application for real-time detection of circulating single nanoparticles, pathogens, and contrast dyes in vivo. Journal of Biomedical Optic. 12 (5), 1-14 (2007).
  10. Miranda, C., Sampath Kumar, S., Muthuswamy, J., Smith, B. S. Photoacoustic micropipette. Applied Physics Letters. 113 (26), 264103(2018).
  11. Miranda, C., Barkley, J., Smith, B. S. Intrauterine photoacoustic and ultrasound imaging probe. Journal of Biomedical Optics. 23 (4), 1-9 (2018).
  12. Galanzha, E. I., Zharov, V. P. Photoacoustic flow cytometry. Methods. 57 (3), 280-296 (2012).
  13. O'Brien, C. M., et al. Capture of circulating tumor cells using photoacoustic flowmetry and two phase flow. Journal of Biomedical Optics. 17 (6), 061221(2012).
  14. Cai, C., et al. Photoacoustic flow cytometry for single sickle cell detection in vitro and in vivo. Analytical Cellular Pathology. 2016, 11(2016).
  15. Galanzha, E. I., et al. In vivo magnetic enrichment, photoacoustic diagnosis, and photothermal purging of infected blood using multifunctional gold and magnetic nanoparticles. PLoS One. 7 (9), e45557(2012).
  16. Hannah, A., Luke, G., Wilson, K., Homan, K., Emelianov, S. Indocyanine green-loaded photoacoustic nanodroplets: dual contrast nanoconstructs for enhanced photoacoustic and ultrasound imaging. ACS Nano. 8 (1), 250-259 (2013).
  17. Kim, S. E., et al. Near-infrared plasmonic assemblies of gold nanoparticles with multimodal function for targeted cancer theragnosis. Scientific Reports. 7 (1), 17327(2017).
  18. Ku, G., et al. Copper sulfide nanoparticles as a new class of photoacoustic contrast agent for deep tissue imaging at 1064 nm. ACS Nano. 6 (8), 7489-7496 (2012).
  19. Parker, N., et al. Folate receptor expression in carcinomas and normal tissues determined by a quantitative radioligand binding assay. Analytical Biochemistry. 338 (2), 284-293 (2005).
  20. Cheung, A., et al. Targeting folate receptor alpha for cancer treatment. Oncotarget. 7 (32), 52553(2016).
  21. Zhou, M., Song, S., Zhao, J., Tian, M., Li, C. Theranostic CuS nanoparticles targeting folate receptors for PET image-guided photothermal therapy. Journal of Materials Chemistry B. 3 (46), 8939-8948 (2015).
  22. Lusk, J. F., et al. Photoacoustic Flow System for the Detection of Ovarian Circulating Tumor Cells Utilizing Copper Sulfide Nanoparticles. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (3), 1553-1560 (2019).
  23. Lee, M., et al. Predictive value of circulating tumor cells (CTCs) captured by microfluidic device in patients with epithelial ovarian cancer. Gynecologic Oncology. 145 (2), 361-365 (2017).
  24. Blassl, C., et al. Gene expression profiling of single circulating tumor cells in ovarian cancer-Establishment of a multi-marker gene panel. Molecular Oncology. 10 (7), 1030-1042 (2016).
  25. Lu, Y., et al. Isolation and characterization of living circulating tumor cells in patients by immunomagnetic negative enrichment coupled with flow cytometry. Cancer. 121 (17), 3036-3045 (2015).
  26. Bhattacharyya, K., Goldschmidt, B. S., Viator, J. A. Detection and capture of breast cancer cells with photoacoustic flow cytometry. Journal of Biomedical Optics. 21 (8), 087007(2016).
  27. Zharov, V. P., Galanzha, E. I., Shashkov, E. V., Khlebtsov, N. G., Tuchin, V. V. In vivo photoacoustic flow cytometry for monitoring of circulating single cancer cells and contrast agents. Optics Letters. 31 (24), 3623-3625 (2006).
  28. Galanzha, E. I., et al. In vivo liquid biopsy using Cytophone platform for photoacoustic detection of circulating tumor cells in patients with melanoma. Science Translational Medicine. 11 (496), eaat5857(2019).
  29. Cai, C., et al. In vivo photoacoustic flow cytometry for early malaria diagnosis. Cytometry Part A. 89 (6), 531-542 (2016).
  30. Galanzha, E. I., et al. In vivo magnetic enrichment and multiplex photoacoustic detection of circulating tumour cells. Nature Nanotechnology. 4 (12), 855(2009).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Dola an T m r H creleriFolik Asit Bak r S lf r Nanopar ac klarSKOV 3 H creleriNanopar ac k SenteziAk Sitometrisi SistemiOptik HizalamaFloresan MikroskobuLazer Deteksiyonu
Fotoakustik Akış Sitometri kullanarak Yumurtalık Kanseri Algılama
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.