Method Article

Pupal Evrelerinde Gelişen Drosophila Epitelinde Doku Oryantasyonu ve Büyüme Dinamiğinin Görüntülenmesi ve Analizi

DOI:

10.3791/60282

⸱

June 2nd, 2020

 , 
1Instituto de Biología Molecular de Barcelona, Consejo Superior de Investigaciones Científicas, Parc Científic de Barcelona, 2The Francis Crick Institute

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, meyve sineği metamorfoza uğrarken Drosophila abdominal epitelde hücre oryantasyonu ve doku büyüme dinamiklerinin görüntülenmesi ve analizi için tasarlanmıştır. Burada açıklanan metodoloji Drosophila veya diğer model organizmalarda farklı gelişimsel aşamaların, dokuların ve hücre altı yapıların incelenmesine uygulanabilir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çok hücreli organizmalar içinde, olgun doku lar ve organlar kurucu hücrelerinin mekansal düzenlemelerinde yüksek derecede düzen gösterirler. Dikkat çekici bir örnek duyusal epitel tarafından verilir, aynı veya farklı kimlikleri nhücreleri son derece organize düzlemsel desenler gösteren hücre-hücre adezyonu ile bir araya getirilir. Hücreler birbirlerine aynı yönde hizalanır ve büyük mesafelerde eşdeğer polarite görüntüler. Olgun epitelin bu organizasyonu morfogenez boyunca kurulmuştur. Olgun epitelin düzlemsel düzenlemesinin nasıl sağlandığını anlamak için, in vivo gelişimi sırasında hücre oryantasyonve büyüme dinamiklerini yüksek spatiotemporal sadakatle izlemek çok önemlidir. Yerelden küresele geçişleri tanımlamak ve tanımlamak için sağlam analitik araçlar da gereklidir. Drosophila pupa epitel morfogenez altında yatan yönelimli hücre şekli değişiklikleri değerlendirmek için ideal bir sistemdir. Pupal gelişen epitel hareketsiz vücudun dış yüzeyini oluşturur, bozulmamış hayvanların uzun süreli görüntülenmesi sağlar. Burada açıklanan protokol, büyüdükçe pupal abdominal epidermiste hem küresel hem de lokal düzeyde hücre davranışlarını görüntülemek ve analiz etmek için tasarlanmıştır. Açıklanan metodoloji, diğer gelişim evrelerinde, dokularda, hücre altı yapılarda veya model organizmalarda hücre davranışlarının görüntülenmesine kolayca adapte edilebilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rollerini başarmak için, epitel dokular tamamen hücresel bileşenlerinin mekansal organizasyon güveniyor. Epitelin çoğunda hücreler sadece kesin bir parke taşı tabakası oluşturmak için birbirlerine karşı paketlenmezler, aynı zamanda vücut eksenlerine göre kendilerini yönlendirirler.

Omurgalı iç kulak ve retina gibi duyusal epitelde hassas doku organizasyonunun fonksiyonel önemi açıktır. İlk durumda, saç ve destekleyici hücreler ses ve hareket1gibi mekanik girdileri verimli bir şekilde algılamak için belirli bir eksenel yönde hizalamak1 ,2. Benzer şekilde, fotoreseptör hücre mekansal ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Bu protokol beş adıma ayrılır: (1) pupanın evreleme, (2) pupanın görüntüleme için hazırlanması, (3) büyüyen abdominal epitelin canlı görüntülemesi, (4) genetik mozaik lerin üretimi, (5) veri işleme ve analizi (hücre kavşağı anahatlarından hücre oryantasyon dinamiklerinin nasıl analiz edilebildiğini açıklayan bölümler ve hücre klonlarından büyüme dinamikleri dahil).

1. Görüntüleme öncesi Drosophila pupa evreleme

  1. Kültür, 25 °C'de 25 °C'de standart ortamda uygun genotipten 5 gün (±12 saat) sonra yumurta yumurtladıktan (AEL) uçar.
    NOT: Metamorfoz, puparium oluşumundan sonra 0 saate kadar 120 h AEL'de pupal kasaya üçün....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yukarıda açıklanan protokol, Drosophila pupasının uzun süreli canlı görüntüleme için hazırlanmasını ve karın epidermisinin hücre oryantasyon ve büyüme dinamiklerinin analizini kapsamaktadır. Bu metodolojiyi uygulayarak, gelişmekte olan pupanın yüksek çözünürlüklü filmlerini, önemli bir fotobeyazrlama veya fototoksisite olmaksızın 48 saate kadar çıkarmak mümkündür. Karın epidermisini (örneğin histoblastlar ve LED'ler) farklı zaman noktalarında ve farklı açılardan pupa yönelimli pu.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uzun menzilli düzen en fonksiyonel fizyolojik birimlerin temel bir özelliğidir. Morfogenez sırasında, yüksek zamansal ve mekansal hassasiyetle uygulanan karmaşık talimatların entegrasyonu ile düzen elde edilir. Çoklu ve çok düzeyli konsuşlar stereotipli doku düzenlemelerine entegre edilmiştir.

Polarite ve yönlülük gelişim sırasında düzenli mekansal düzenleme için çok önemlidir. Polarite gelişme sırasında simetri kırılması anlamına gelir. Embriyonik anteroposterior (A/P) ve dorsoventral (D/V) e.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların çıkar çatışması yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Martín-Blanco laboratuvarı üyelerine yararlı tartışmalar için teşekkür ederiz. Ayrıca Nic Tapon (Crick Enstitüsü, Londra, İngiltere), Bloomington Stock Center (University of Indiana, ABD) ve FlyBase (Drosophila gen ek gösterimi için) teşekkür ederiz. Federica Mangione JAE-CSIC doktora öncesi bursu ile desteklendi. Martín-Blanco laboratuvarı Programa Estatal de Fomento de la Investigación Científica y Técnica de Excelencia (BFU2014-57019-P ve BFU2017-82876-P) ve Fundación Ramón Areces tarafından finanse edilmiştir.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AnalizYazılımı-ImageJVeri
toplama için kullanılan veri analiziDrosophilaAtpa::GFP-Strains
Drosophilahsflp1.22; FRT40A/FRT40A Ubi.RFP.nls-Veri toplama için kullanılan suşlar
Dumont 5 ForsepsFST11251-20Diseksiyon için 1,5 mm çap
Cam Alt PlakalarMat TekP35G-0.170-14-CVeri toplama için montaj pupaları
Halokarbon Yağı 27Sigma-Aldrich9002-83-9montaj pupası
Ters Konfokal mikroskopZeissLSM700Veri toplama
StereomikroskopLeicaDFC365FXDiseksiyon sırasında pupaların görselleştirilmesi

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gillespie, P. G., Muller, U. Mechanotransduction by hair cells: models, molecules, and mechanisms. Cell. 139, 33-44 (2009).
  2. Deans, M. R. A balance of form and function: planar polarity and development of the vestibular maculae....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Drosophila Pupal EpidermisTissue Orientation AnalysisCell Growth DynamicsConfocal Microscopy ImagingMitotic Recombination TechniqueOrientation J PluginPlanar Polarity AnalysisHistoblast Clone TrackingEpithelial Morphogenesis StudyLive Imaging Protocol

Related Articles