Situ Hibridizasyonfloresan Kullanarak Murine Gastrointestinal Sistemde Candida albicans Görselleştirilmesi

Özet

Bu protokolün amacı Memeli gastrointestinal sistemde Candida albicans hücre şekli ve lokalizasyonu görselleştirmektir.

Özet

Candida albicans insanlarda ve diğer birçok memelilerde bağırsak mikrobiyotasının bir mantar bileşenidir. C. albicans en kolonize konaklarda semptomlara neden olmasa da, kommensal rezervuar bulaşıcı hastalık için bir depo olarak hizmet vermektedir, ve bağırsakta yüksek mantar titreleri varlığı inflamatuar barsak hastalığı ile ilişkilidir. Burada, kararlı gastrointestinal kolonizasyon bir fare modelinde C. albicans hücre morfolojisi ve lokalizasyon görselleştirmek için bir yöntem açıklar. Kolonizasyon oral antibiyotik ile tedavi edilmiş hayvanlarda C. albicans tek bir doz kullanılarak kurulmuştur. Bağırsak dokusu segmentleri luminal içeriği (mikroorganizmalar ve mukus) yanı sıra konak mukoza mimarisini koruyan bir şekilde sabitlenir. Son olarak, situ hibridizasyonfloresan C. albicans ve hyphae için leke mantar rRNA karşı problar kullanılarak yapılır. Bu protokolün önemli bir avantajı, Gastrointestinal kolonizasyon sırasında C. albicans hücre morfolojisi ve konak yapıları ile mekansal ilişki eşzamanlı gözlem sağlar.

Giriş

Candida albicans bir mantar commensal yanı sıra fırsatçı bir insan patojen. Bu maya tanımlanmış bir çevresel niş yoksun ve bunun yerine gastrointestinal içinde yayılır (GI) sistem, cilt, ve insanlar ve diğer memelilerin genitoüriner sistem¹. C. albicans üzerinde erken araştırma öncelikle virülans potansiyeli üzerinde duruldu oysa, birkaç yeni raporlar bağırsak içinde commensally yayılan organizmaların normal sağlık önemli roller oynayabilir düşündürmektedir, bağışıklık gelişimi de dahil olmak üzere ev sahibi^2,3,4. Memeli bağırsağı içinde C. albicans commensalism araştırmalarını kolaylaştırmak için, istikrarlı GI kolonizasyon ve situ hibridizasyon bir floresan bir fare modeli geliştirdi (FISH) mantar maya hücreleri ve hyphae içinde görselleştirmek için tabanlı bir yöntem bağırsak lümeni.

Bazı istisnalar dışında⁵, laboratuvar da yetiştirilen fareler genellikle sindirim sisteminin mantar kolonizasyonuna direnç gösterirler. Kolonizasyon direnci belirli bakteri türleri tarafından aracılık olduğu düşünülmektedir; ancak, bu antibiyotik ile hayvanların tedavisi ile aşılabilir^6,7 veya muhtemelen bakteri türlerinin bileşimi değiştirir kimyasal olarak tanımlanmış bir diyet kullanımı^8,9. Benzer şekilde, insanlarda, geniş spektrumlu antibiyotik kullanımı C. albicans overgrowth ve yayma ile ilişkili olmuştur¹⁰. Bizim murine kolonizasyon modeli c. albicans immünobeceriksiz, geleneksel olarak yetiştirilen farelerin kolonizasyonu kurmak için geniş spektrumlu antibiyotikler kullanır. Penisilin ve streptomisin c. albicans 10⁸ koloni oluşturan birimleri (CPU) ile gavaj önce bir hafta boyunca hayvanların içme suyunda sağlanır. Antibiyotik li su devam ettikçe, C. albicans GI yolu boyunca yayılır ve 10⁶−10⁸ CPU/g dışkı titrelerine ulaşır. Mantar kolonizasyonunun yüksek seviyesine rağmen, hayvanlar sağlıklı kalır ve enfekte olmayan kontroller ile aynı oranda kilo. Bu model için ekran ve birden fazla C. albicans commensalism faktörler¹¹karakterize başarıyla kullanılmıştır^{11 ,12}.

Mantar krallığının diğer üyeleri gibi, C. albicans büyük morfolojik plastisite yeteneğine sahiptir¹³. In vitro koşullar altında, en az altı tek hücreli maya hücre türleri arasında geçiş gösterilmiştir, yanı sıra çok hücreli hyphae ve psödohyphae. Maya-to-hypha geçiş en iyi karakterize virülans özelliklerinden biridir, ve hyphae ve pseudohyphae en memeli hastalık modellerinde baskın, yanı sıra enfekte insan dokularında. Murine sindirim sistemi içinde C. albicans lokalizasyonu ve hücre morfolojisi belirlemek için, sabit histolojik kesitlerde maya ve hyphae boyama için bir FISH tekniği geliştirdi. Problar, mantar sitoplazması boyunca dağıtılan 23S ribozomal RNA (rRNA) ile melezlenen floresan etiketli DNA oligonükleotidlerinden oluşur. Konak dokular, ev sahibi mukoza, sindirim malzemesi, bakteriyel mikrobiyota ve bağırsak lümeni içindeki mukus da dahil olmak üzere bağırsağın üç boyutlu mimarisini koruyacak şekilde sabitolduğundan, bu teknik mantarın lokalizasyonuna izin verir. lekeli zaman bu yerler ile ilgili hücreler. FISH tekniği, Periyodik Asit Schiff (PAS) veya Gomori'nin Metheammine-Silver (GMS) gibi mantarlar için geleneksel histolojik lekeleri ile karşılaştırır, ayrıca ticari olarak mevcut antifungal antikorlar, çünkü bu reaktifler C. albicans. Ayrıca, standart fiksatifler mukus tabakası kaldırmak ve bağırsak lümen diğer içeriğini bozabilir^14,15.

Bu makalede, yüksek dereceli C. albicans kolonize fare GI sistemi kurmak için ayrıntılı talimatlar sağlamak, ötanazi hayvanlardan sindirim sistemi diseksiyon için, luminal koruyan bir şekilde doku fiksasyonu için mimarisi ve FISH kullanarak ev sahibi dokular içinde C. albicans tespiti için. C. albicans yabani türü ve mutant suşları ek olarak, gavaj tekniği diğer mikroorganizmaların teslim etmek için kullanılabilir. Fiksasyon tekniği bağırsak içeriğinin korunması istenen herhangi bir çalışma için yararlı olacaktır. FISH prosedürü bir gün içinde tamamlanabilir ve birden fazla farklı etiketli problar kullanılarak birden fazla mantar türünü yerelleştirmek için kullanılabilir.

Protokol

Aşağıda açıklanan adımlar UCSF Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1. Ağız Gavajı Kullanarak C. albicans ile Farelerin Gastrointestinal Colonization

1. Yerel IACUC tarafından onaylanan 18−21 g erkek veya dişi fareler (8−10 haftalık) için barınak sağlayın. İlk günden itibaren otoklavlı yiyecek ve su kullanın.
   NOT: Sterilize kafesler, yatak takımları, gıda ve su kullanımı potansiyel bağırsak Tan C. albicans yerinden olabilir antibiyotiğe dirençli çevresel bakteriler ile kontaminasyon riskini azaltır. Ayrıca, deneysel soruya bağlı olarak, fareler koprophagic ve bağırsak içeriği kohoused hayvanlar arasında paylaşılacak, çünkü hayvanların bireysel konut düşünülmelidir.
2. Ertesi gün, otoklavlı içme suyunu %5 glikoz, 1.500 U/mL penisilin G ve 2 mg/mL streptomisin içeren otoklavlı su ile değiştirin.
3. Kolaylık sağlamak için, önceden 200x antibiyotik stok çözeltileri(Tablo 1)hazırlayın, sterilize edin ve -20 °C'de donun.
4. Bir hafta boyunca antibiyotik ile hayvanları korumak.
   1. Antibiyotikler başladıktan sonra 3 ve 6 gün, antibiyotik dirençli aerobik bakteriler ile kontaminasyon için her hayvanın dışkı değerlendirmek. Bir eliyle bir hayvan tutarak, anüs yakın bir kapaksız mikrofuge tüp yerleştirin ve en az bir dışkı pelet toplamak.
   2. Steril su 1 mL her dışkı pelet ve plaka 100 μL Luria suyu (LB), maya özü peptone dekstroz (YEPD), veya beyin kalp infüzyonu (BHI) artı kan agar plakaları. Plakaları bir gecede standart bir kuluçka makinesinde (anaerobik değil) 37 °C'de kuluçkaya yatırın ve bakteri üremesini değerlendirin.
      NOT: Plakalar minimal büyüme (0−20 koloniler) sergilemelidir. >Penisilin ve streptomisin ile tedavi edilen hayvanlardan 20 bakteri kolonisi elde edilirse, C. albicans ile üst düzey kolonizasyonun kurulması ve deneyin iptal edilmesi olası değildir.
5. Gavaj'dan üç gün önce, dondurulmuş gliserol stolarından YEPD + %2 agar tabaklarına ve 30 °C'de 2 gün kuluçkaya yatırılabilen C. albicanları.
6. Gavaj'dan bir gün önce, her C. albicans'ın bir kolonisini aşılamak ve 5 mL likit YEPD'ye test edin. Bir gecede 30 °C'de sallayarak kuluçkaya yat.
7. Gavaj sabahı, C. albicans doymuş kültürünü 600 nm (OD₆₀₀₎0,1'de 100 mL YEPD'nin 30 °C'ye önceden ısıtılmış optik yoğunluğuna seyreltin. OD 600 1'e (orta log büyüme) ulaşana kadar 30 °C'de 30 °C'de₂₀₀ rpm'de bir orbital shaker ile çalkalayın.
8. Her 100 mL kültürünü oda sıcaklığında (RT) 5 dakika boyunca 3.000 x g'de iki adet 50 mL konik tüpe ve santrifüje aktarın.
   NOT: C. albicans RT nispeten yavaş yayılır. Eğer bu protokolü başka bir türe uyarlıyorsa, inocula'nın sürekli büyümeyi önlemek için buzda tutulması gerekebilir.
9. Supernatant atın, kültür 50 mL başına steril salin 20 mL peletli hücreleri yeniden askıya ve tek konik tüpler halinde yinelenen resuspended pelet havuz. Santrifüj 3000 x g 5 dk için.
10. Supernatant atın ve steril salin 20 mL resuspend. Girdap kısaca ve OD₆₀₀ ölçümü için 20 μL çıkarın. Steril normal salinde 1:50 seyreltin. Kalan resuspended hücreleri 3000 x g 5 dakika santrifüj.
11. Supernatant atın. 1 x 10⁸ CFU'luk bir inokül boyutu için, OD₆₀₀ ölçümünden belirlenen tahmini konsantrasyona göre peletli hücreleri steril normal salinde yaklaşık 5 x 10⁸ CPU/mL'ye yeniden askıya alın.
    NOT: Tipik olarak, 1'in OD_600'ü ~1 x 10⁷ maya hücresine/mL'ye karşılık gelir. Bu değer spektrofotometreye göre değişebilir ve doğrulanmalıdır. Farklı bir mikroorganizmaya sahip enfeksiyonlariçin konsantrasyonda bir değişiklik isteniyorsa, hayvanın rahatsızlığını en aza indirmek için ≤10 μL/g farenin inokül hacmini planlayın.
12. Hemositometre ile 1:1.000 seyreltme sayarak inokül konsantrasyonu doğrulayın. Hemositometre kullanılarak belirlenen konsantrasyona göre gavaged edilecek hücrelerin hacmini ayarlayın.
13. Bir hayvan besleme iğnesi kullanarak(Şekil 1A), gavage belirli bir inoculum hesaplanan hacmi ile her hayvan. Gavaj prosedürü için 1.13.1−1.13.8 adımlarını görün.
    NOT: Gavaj eğitimi deneyimli bir uygulayıcıdan alınmalı ve işlem önceden yapılmalıdır. Tek bir hayvan için başarılı bir işlem genellikle en fazla 1 dakika sürer.
    1. 1 mL şırıngaya otoklavlı hayvan besleme iğnesi takın ve yanlış bir dozu önlemek için hava kabarcıklarını çıkararak şırıngayı bir gavaj hacmiyle doldurun. Steril bir yüzeye yerleştirin.
    2. Hayvanı gavaj için emniyete alın. Baskın el ile kuyruk tabanında hayvan tutun ve kulakların hemen arkasında gevşek deri için hayvanın sırtına baskın olmayan el slayt.
    3. Baskın olmayan elin işaret parmağını ve baş parmağını kullanarak, gevşek deriyi sıkıca bir araya getirin; Bu "scruff". Hayvanı avucunun içine almak için hayvanı kuyruğun etrafında ki aynı (baskın olmayan) elin pasaklı ve halka küçük parmağıyla alın. Hayvanın başını ve başını (ve dolayısıyla boyun ve yemek borusu) düz bir çizgide olacak şekilde yavaşça uzatın.
       NOT: Hayvanın vücudu bükülmüş veya bükülmüş iken bir gavaj girişimi özofagus perforasyonu ve hayvanın ölümü gibi komplikasyonlara neden olabilir.
    4. Şırıngayı baskın el ile alın ve kavisli iğne aşağı yaslandı (Şekil 1B) hayvana dik tutun. İğne topu kullanarak, yavaşça ağız bir iç köşesinde kanca, yavaşça boğaz arkasına ağız tarafı boyunca iğne ilerlemek ve son olarak merkezine iğne hareket ettirin.
       NOT: İğnenin yanal bir yol boyunca tanıtılması, hayvanın dişlerinden ve dilinden direnç ten kaçınmaya yardımcı olur.
    5. İğne nin topu boğazın arkasına dayadıktan sonra iğneyi hayvanın vücut çizgisiyle paralel olacak şekilde yatırın(Şekil 1C).
       NOT: Bu noktada, hayvan bir öğürme refleksi sergileyecek. Bu iğne doğru konumlandırılmış olduğunu gösterir iyi bir işarettir, ve gagging hareketi yemek borusu aşağı iğne rehberlik yardımcı olur. Öğürme refleksi yoksa, iğne yemek borusu yerine trakeada olabilir. İğneyi yavaşça geri çekin ve 1.13.1 adıma geri ilerleyin.
    6. Sadece birkaç milimetre görünür kalana kadar hayvanın inoculumu yutmasına izin verin(Şekil 1D). İğneyi sorunsuz bir şekilde ilerletin.
       NOT: İğne ilerlemiyorsa, yemek borusuna zarar verebilecek güç kullanmaktan kaçının. Bazen son yarım santimetreyi ilerletmek hayvandan ekstra büyük bir şaka gerektirir. İğne sıkışmış gibi görünüyorsa, yavaş yavaş geri çekin ve adım 1.13.4 tekrar deneyin.
    7. İğne topunun doğru yerde (midede) olduğunu, pistiyi yavaşça ilerleterek test edin. Direnç yoksa, inokülü teslim edin. İnokül uygulandıktan sonra iğneyi yavaşça geri çekin.
    8. Kafesindeki hayvanı değiştirin ve emekverilen nefes alma veya sıkıntı belirtileri için hayvanı 5−10 dakika boyunca izlemeye devam edin. Hayvanın gavajdan kısa bir süre sonra normal aktiviteye devam ettiğini doğrulayın.
    9. Aynı inoculum bir sonraki hayvan ile kullanılacaksa, bir alkol mendil ile iğne temizleyin. Adım 1.13.1'e geri dön. Farklı bir inoculum kullanılacaksa, yeni bir iğne kullanın ve adım 1.13.1 geri devam edin.
       NOT: Gavajdan bir gün sonra hayvanları incelemek önemlidir. Sıkıntı belirtileri gösteren hayvanlar (örneğin, kambur duruş, emekli nefes alma) insanca ötenazi yapılmalıdır, çünkü büyük olasılıkla özofagus rüptürü, akciğerlerde hasar veya iyileşme nin olası olmadığı başka bir iç yaralanma ya da acı çekilmiştir.
14. Hayvanların gavaj sonra, doz doğrulama için inocula plaka seyreltme.
    1. 1:10^5'ekadar 10 kat seri seyreltme hazırlayın. Sabouraud dekstroz agar 100 mm plaka üzerine 1:10⁵ seyreltme Plaka bir gavaj hacmi.
    2. Plakayı 30 °C'de 2 gün kuluçkaya yatırın. Inokül dozuna onay vermek için CFUs'u kont.

2. Gastrointestinal Dokuların Histolojiye Hazırlanması

NOT: Protokolün bu bölümü Johansson ve Hansson¹⁶uyarlanmıştır.

1. Parçalanmış her 2 hayvan için büyük bir vida kapağı plastik kavanozda 500 mL methacarn çözeltisi (%60 metanol, %30 kloroform, %10 buzul asetik asit) hazırlayın.
   DİkKAT: Metanol ve kloroform solunduğunda zararlıdır ve kimyasal bir başlık içinde manipüle edilmelidir. Buzul asetik asit aşındırıcı olabilir ve uygun kişisel koruyucu ekipman ile ele alınmalıdır. Metanol, kloroform ve buzul asetik asit tehlikeli atık olarak atılmalıdır.
2. Deneysel bitiş noktasında, yerel IACUC tarafından onaylanan bir protokole göre insancıl hayvanlar ötenazi.
   NOT: Antibiyotik le tedavi edilen hayvanlarda, C. albicans kolonizasyonu genellikle 5.
3. %10 çamaşır suyu ile diseksiyon araçlarını sterilize edin ve %70 etanol ile durula.
4. Her hayvanı havalandırma tarafı yukarı bakacak şekilde bir diseksiyon yüzeyine sabitle. Ekstremiteleri diseksiyon yüzeyine sabitlemek için 30 G iğne kullanın(Şekil 2A). Kürkü temizlemek ve aletlere yapışmasını en aza indirmek için hayvanı %70 etanolile püskürtün.
5. Künt uçlu forseps kullanarak, baskın olmayan el ile karın derisinin bir bölümünü çimdik. Baskın el ile makas kullanarak, pelvis tabanına yakın deri ve altta yatan fasya eğim. Periton boşluğunun her iki tarafında ve göğüs kafesine kadar u şeklinde kesi uzatın. Deriyi yoldan kaldır.
6. Gi segmentlerinin değerlendirilmesi için bir kalem kullanarak, ön etiket histoloji kasetleri. Örneğin, her hayvan için ayrı kasetleri "mide", "proksimal ince bağırsak", "orta ince bağırsak", "distal ince bağırsak", "çekum" ve "kalın bağırsak" olarak etiketle. Her kasetin altına bir köpük ped yerleştirin(Şekil 2A).
   NOT: Şekil 2B, kasetlere yerleştirilecek önerilen bölümleri özetler.
7. Künt uçlu forceps kullanarak, yavaşça periton boşluğundan çekum ayıklayın. Çekum ve ince ve kalın bağırsak arasındaki bağlantıları kesmek için makas kullanın.
   NOT: Cecal doku çok hassas ve yırtılması kolaydır. Manipüle ederken dikkatli olmak.
8. Tüm çekiyi bir histoloji kasetine yerleştirin, böylece bükülmez ve düz bir şekilde uzanır (Şekil 2C). Üstüne ikinci bir köpük ped yerleştirin ve kaseti kapatın. Kaseti methacarn içeren bir vida kapağı kavanozuna yerleştirin.
9. Kalın bağırsağın 1−2 dışkı peletiçeren ve uzunluğu kasetten daha az olan bir bölümünü çıkarın.
10. Doku kısmını kasete yerleştirin, dokuyu düz ve bükülmemiş olarak takın. İkinci bir köpük ped ile kaplama ve kaset kapatın. Kaseti methacarn'a yerleştirin.
11. İnce bağırsağın her bir bölümünün örneklenebilir olması için, bazı sindirim malzemeleri içeren 1−2 cm'lik bir segment ilerler.
12. Bir histoloji kaset içine segment yerleştirin, doku düz ve bükülmemiş tutmak. İkinci bir köpük ped ile kaplama ve kaset kapatın. Kaseti methacarn'a yerleştirin.
13. Mide için, yemek borusu ve ince bağırsak bağlantıları kes. Bir kaset yerleştirin, doku düz ve bükülmemiş tutmak. İkinci bir köpük ped ile kaplama ve kaset kapatın. Kaseti methacarn'a yerleştirin.
14. Kasetleri EN az 3 saat ve 2 haftadan az bir süre RT'de methacarn çözeltisinde bırakın.
    NOT: Sabit GI segmentlerinin ticari bir histoloji servisine aktarılabildiği birkaç nokta vardır. Bu dokular luminal içeriği kesintiye uğramadan bölüme zor olabilir ve deneyimli bir teknisyen tarafından en iyi sonuçlar elde edilecektir. Ticari hizmet parafin dokuları gömme önce yıkar gerçekleştirmek için istekli ise, kasetler adım 2.16 talimatları ile birlikte bu aşamada gönderilebilir.
15. Önceden ısıtılmış 70 °C hibridizasyon fırınında büyük bir kabın tüm doku kasetlerini kaplayacak kadar parafin balmumu eritmeye başlayın.
16. Fiksasyondan sonra, köpük pedleri çıkarın ve bozulmamış doku bölümünü tekrar kasetine geri getirin. Titreyerek RT'de aşağıdaki çözeltilerle dokuları yıkayın: 35 dk için %100 metanol, %100 etanolde 25 dakika için iki kez, ksilene 20 dk için iki kez.
    DİkKAT: Ksilen yanıcı, toksik, ve solunduğunda hasara neden olabilir. Uygun koruma ile kimyasal bir başlık kullanın. Tehlikeli atık prosedürleri ile ksilenin bertaraf edin.
17. Pat kasetler bir kağıt havlu üzerinde kuru ve önceden eritilmiş parafin balmumu yerleştirin 2 saat için 70 °C bir hibridizasyon fırında. Kasetlerin parafinle dolu olduğundan ve kabarcıkların kalmadığından emin olun.
    NOT: Bu adım balmumu GI segmentine sızmak ve doku ve içeriğini stabilize etmek için izin verir.
18. Balmumu kasetleri çıkarın, aşırı balmumu drenaj izin, ve balmumu blokları gömülü olana kadar RT de saklamak. Tehlikeli atık olarak ksilenler eser miktarda içeren balmumu atın.
    NOT: Noble Lab, dokuların katıştırma ve kesiti için ticari bir histoloji hizmeti kullanır. C. albicans maya ve hyphae standart görselleştirme için, 4 μm kesitler kullanılır. Genellikle birden fazla düzlemde uzanan hiphal segmentlerinin bağlantılarını değerlendirmek için 8 μm'lik kesitler kullanılabilir. FISH problarının numuneye nüfuz etme yeteneğine bağlı olarak daha kalın kesitler kullanmak mümkün olabilir.

3. Yeni Tasarlanmış Probların Doğrulanması

NOT: C. albicans probları doğrulamak için aşağıdaki protokol Swidsinski ve^{ark. 17}uyarlanmıştır.

1. Streak C. albicans SC5314 ve yakından ilişkili karşılaştırıcı türler (örneğin, Candida dubliniensis, Candida tropicalis)YEPD + 2% agar plakaları. 30 °C'de 1−2 gün kuluçkaya yatırın.
2. Tek bir koloni ile sıvı YEPD orta 5 mL aşılamak.
3. Askıda kalan hücrelerin pipet 1 mL'si mikrosantrifüj tüpüne ve santrifüje 3000 x g'de 5 dk. Süpernatant atın.
4. Peleti 100 μL fosfat tamponlu salin (PBS) içinde yeniden askıya alın.
5. Pipet 5−10 μL resuspended hücreleri ve nokta bir cam slayt üzerine. Daha büyük bir daire içine yayılır ve kurumasını bekleyin.
   NOT: Hücreler yapışık değilse, poli-L-lizin kaplı slaytlar kullanın.
6. Hücre noktasını PAP kalemle daire içine alayın ve PBS'de %2,5 paraformaldehit (PFA) 50 μL ile kaplayın. 10 dakika RT'de kuluçka.
   DİkKAT: PfA yanıcıdır ve solunduğunda veya ciltle temas halinde sağlık sorunlarına neden olabilir. PfA ile kontamine olan maddeler tehlikeli atık olarak atılmalıdır.
7. PBS ile 3x yıkayın. Sıvıyı kağıt havluya dokunun ve 100 μL PBS ile kaplayın. İki kez tekrarlayın. Son yıkamayı atın.
8. Çok günlük depolama için slaytlar hazırlayın. FISH'i aynı gün gerçekleştirecekseniz, bu bölümdeki adımlar olmadan 3.9 adımına geçin.
   NOT: Hibritleştirmeyi hemen gerçekleştirmek tercih edilir, ancak kısa ysa depolamadan önce 3.8. Slaytlar 4 °C'de birkaç gün saklanabilir.
   1. % 60 etanol ile spot kapağı. 3 dk. Çözeltiyi atın.
   2. % 80 etanol ile spot kapağı. 3 dk. Çözeltiyi atın.
   3. % 100 etanol ile spot kapağı. 3 dk. Çözeltiyi atın. Adım 3.9'a geçin.
9. Ortaya çıkarılan slaytları 50 °C'de bir melezleme fırınına 1 saat süreyle yerleştirin. 3.8. adım takip edildiyse, slaytları 4 °C'de saklayın. Değilse, hibridizasyon protokolünü gerçekleştirmek için adım 4.2'ye geçin.

4. GİS Yolu Dokularında BALıK Boyama

1. Dewax parafin gömülü histolojik kesitler.
   1. Bir melezleme fırınında, ksilen ile 60 °C arasında doldurulmuş bir Coplin kavanozu önceden ısıtın.
   2. Slaytları ksilen dolu kavanoza yerleştirin. 10 dk. Xylene yıkamayı atın. Kavanozda slaytlar tutun ve bir atık konteyner içine ksilen dökün.
   3. Kavanoza taze RT ksilenin dökün ve 60 °C'de 10 dk. İkinci ksilen yıkamayı atın.
   4. Kavanozu %100 etanol le doldurun ve 5 dk.
   5. 4.2 bölümündeki adımlar için hibridizasyon fırınını 50 °C'ye ayarlayın.
2. Leke C. FISH sondası ile albicans.
   1. 1 mL taze hibridizasyon çözeltisi (20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.9 M NaCl, %0.1 sodyum dodesil sülfat [SDS], %1 formamid rnassız suda) hazırlayın. Örnek hesaplamalar için Tablo 1'e bakın.
   2. 50 μL hibritleştirme çözeltisini 1 μL C. albicans probu (5' Cy3- ACAGCAGAAGCCGTGCC 3'; 50 μg/mL rNase-free suda) ile karıştırın ve slayt başına 0,5 g'lık sonda miktarını eşitleyin.
      NOT: Birçok laboratuvar da yetiştirilen fareler mikrobiyotaları arasında herhangi bir mantar içermez. Bu durumda, bir pan-mantar sondası yerine mümkündür (5' Cy3-CTCTGGCTTCACCCTATTC 3') en mantar türlerinin 23S rRNA tanır, sadece C. albicans. Yazarların deneyimlerine göre, panfungal sonda C. albicans-özelsonda daha parlak boyama verir.
   3. Çözeltiyi ışık ve sıcaktan 50 °C'ye kadar koruyun.
   4. PAP kalemkullanarak, bölüm 4.1 doku bölümü etrafında bir daire çizin.
   5. Pipet 50 μL prob içeren hibridizasyon çözeltisi sabit doku üzerine ve yavaşça bir pipet ucu ile doku bölümüne yayıldı. Kabarcıkları önlemek için emin olmak için bir hibridizasyon coverslip ile sıvı bindirme.
   6. Su geçirmez bir hibridizasyon odasında slaytları kapatın ve bölümleri 50 °C'de karanlıkta 3 saat boyunca bir melezleme fırınında kuluçkaya yatırın.
   7. Bu arada, 50 mL FISH yıkama çözeltisi (20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.9 M NaCl rnase içermeyen suda) hazırlayın. Örnek hesaplamalar için Tablo 1'e bakın.
   8. Yıkama çözeltisini 50 °C'ye taşıyın.
   9. 3 saat sonra, bir Coplin kavanoza yıkama çözeltisi ekleyin. Daha sonra, coverslip'i forsepslerle slayttan dikkatlice çıkarın ve kaydırağı yıkama solüsyonuna yerleştirin.
   10. Kavanozu alüminyum folyo ile kaplayın ve 50 °C'de 20 dk kuluçkaya yatırın.
   11. Bu kuluçka sırasında, müsin-nükleus boyama çözeltisi hazırlamak (20 ng/mL 4′,6-diamidino-2-fenilindole [DAPI], 1.6 μg/mL fluorescein izotiyazid [FITC]-PBS lektin). Örnek hesaplamalar için Tablo 1'e bakın. Mide ve kalın bağırsaklar için FITC-Ulex europaeus agglutinin 1 (UEA-1) kullanın. İnce bağırsaklar ve çekum için FITC-UEA-1 ve FITC-buğday mikrobu agglutinin (WGA) kombinasyonunu kullanın.
       NOT: Farklı türlerden gelen lektinler müsin gibi glikoproteinlerin farklı şeker modifikasyonlarını tanırlar. Burada önerilen lektin kombinasyonları farklı GI bölmelerinde mukus optimal boyama için ampirik olarak belirlendi.
   12. FISH yıkama çözeltisini dökerek ve kavanozu RT PBS ile doldurarak slaytları yıkayın. Hemen PBS dökün ve PBS ile yeniden doldurun. Toplam 2 yıkama için PBS dökün.
   13. Wick uzakta hassas bir görev silecek dokusu ile PBS ve bir PAP kalem ile bağırsak dokusu bölümü daire. Slaytları opak plastik bir kapta yerleştirin ve doku bölümüne 50 μL musin-çekirdek boyama çözeltisi ekleyin. Işıktan korumak için kabı alüminyum folyo ile kaplayın. 4 °C'de 45 dk kuluçkaya yatırın.
   14. Slaytları coplin kavanozuna yerleştirin ve RT'de PBS'de iki kez hızlıca yıkayın.
   15. Bir kağıt havlu üzerinde aşırı PBS uzak dokunun ve sonra bir doku ile PBS son damla ları uzakta wick.
   16. Her bölüme bir damla montaj ortamı yerleştirin ve kabarcıkları önleyerek cam bir kapak lı örtün. Montaj ortamının tüm örtünün altına yayılmasına izin verin. Hemen görüntüleme için, köşelerinde oje ile yerine coverslip çapa. Uzun süreli depolama için, oje ile coverslip etrafında mühür.
   17. Floresan mikroskop kullanarak slaytları görüntüleyin.

Sonuçlar

Verilen talimatlara göre, bu tekniğin sonucu, kesitli GI dokularında konak epitel, mukus ve C. albicans çekirdeklerinin floresan etiketleme olacaktır. Yabani tip Candida albicans hücreleri ya yuvarlak olarak görünmelidir, tek hücreli maya hücreleri ya da son derece uzamış, bazen dallanma, çok hücreli hyphae (hücre-hücre bölünmeleri hyphae belirgin olmayacaktır). C. albicans Mutantlar ayrıca daha küçük olarak görünebilir, biraz uzamış "gri" mayalar veya daha büyük, biraz uzamış "GUT" (gastrointestinal kaynaklı geçiş) veya "opak" mayalar.

Şekil 1, oral gavaj için kullanılan beslenme iğnesinin yanı sıra gavaj işlemi sırasında iğnenin kilit konumlarını da gösteriş ve görüntüle. Şekil 2, organ diseksiyonu ve farenin GI segmentlerinin görünümü için kullanılan tipik bir kurulum sağlar.

Şekil 3, farklı C. albicans hücre tiplerinin fish boyamalarını in vitro ve fare modeli içinde yayılımı takiben gösterir. Şekil 3A, sabit, permeabilize, in vitro-propagated hyphae floresan ve faz görüntülerini gösterir. Hypha oluşumu sıvı Lee'nin orta¹⁸ ile% 2 N-asetilglucosamine, pH 6.8 ile 37 °C indüklendi. Şekil 3B, sabit, permeabilize, in vitro-propagated maya hücrelerinin floresan ve faz görüntülerini gösterir. Şekil 3C,D sırasıyla sabit, permeabilize, in vitro-propagated GUT hücreleri ve opak hücreleri gösterir. GUT ve opak hücre tipleri taramalı elektron mikroskobu ile görüntülendirilmediklerinde morfolojik olarak ayırt edilemezler. İn vitro-propagateed hücrelerin FISH boyama hücreleri iyi permeabilized değilse suboptimal olacağını unutmayın. Zayıf ve diffüz boyama örneği Şekil 3C'degösterilmiştir. En iyi sonuçlar için, her hücre tipi ve türü araştırılacak ampirik olarak hücre fiksasyonu ve permeabilizasyon koşulları belirlenmelidir. Neyse ki, kesitli dokularda C. albicans görselleştirmek için önerilen protokol daha tutarlı permeabilization üretir.

Şekil 3E-G, c. albicans-spesifik probu (Şekil 3E) veya panfungal sonda(Şekil 3F,G)ile boyanmış fare kalın bağırsaklarında C. albicans tasvir. C. albicans bu görüntülerde kırmızı görünür, konak hücre çekirdekleri mavi, ve mukus tabakası yeşil. Hem yuvarlak mayalar hem de yüksek uzamış hyphae (beyaz ok uçları) kalın bağırsaklarda meydana gelir. Panfungal sonda ile boyamanın daha parlak olduğunu lütfen unutmayın. Şekil 3G, panfungal sonda ile boyanmış aynı bölmede bir ume6 mutantı tasvireder. Ume6 in vitro koşullar altında hypha oluşumu için gerekli olan transkripsiyon faktörünü kodlar¹⁹ . İlginçtir, in vitro koşullar altında bu mutant tarafından görüntülenen maya kilitli fenotip bağırsak içinde recapitulated değildir, gereksiz bir faktör konak içinde aktive edilmesi gerektiğini düşündüren¹². Şekil 4, murine GI yolunun farklı bölümlerinde, ev sahibi mukozaya hemen bitişik bölgeler ve bağırsak lümeninin daha merkezi bölgeleri de dahil olmak üzere yabani tip C. albicanların görünümünü betimlemektedir.

Şekil 1: Gavaj sırasında anahtar besleme iğne pozisyonları. (A) Besleme iğnesi. (B) Dilin yan tarafına yerleştirilen iğne topuile besleme. (C) Yemek borusuna yerleştirilme ile dik pozisyonda iğne besleme. (D) Burun üzerinde birkaç milimetre görünür ile mideiçine yerleştirilen besleme iğnesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Örnek diseksiyon düzeni. (A) Diseksiyon pedi ve aletleri. (B) Excised GI yolu. Proksimal (özofagus) distal (anüs) bölümleri: I. Mide. II. Proksimal ince bağırsaklar. III. Medial ince bağırsaklar. IV. Distal ince bağırsaklar. V. Cecum. VI. Kalın bağırsak. Pembe kesikli kenarlık kutuları dokuların düzeltilmesini gösterir. (C) Kasetlere yerleştirilmiş dokular. Roma rakamları b panelindekiyle aynıdır.

Şekil 3: FISH lekeli C. albicanstemsili görüntüler. (A) FISH C. albicans hyphae sıvı Lee'nin medya^18% 2 N-asetilglucosamine, pH 6.8 ile yetiştirilen. (B) C. albicans yuvarlak maya hücreleri YEPD + 2% agar plakaları üzerinde yetiştirilen FISH. (C) BALIK C. albicans GUT hücreleri (ySN1045) YEPD + 2% agar plakaları üzerinde yetiştirilen. (D) C. albicans opak hücrelerin BALIK YEPD + 2% agar plakaları üzerinde yetiştirilen. (E) Kalın bağırsaklarda yabani tip C. albicans (ySN250), C. albicans-spesifikprob ile boyanmış. (F) Kalın bağırsaklarda yabani tip C. albicans, panfungal sonda ile boyanmış. (G) Ume6 mutant (ySN1479) kalın bağırsaklarda, panfungal sonda ile boyanmış: kırmızı C. albicans,mavi ev sahibi epitel çekirdekleri, ve yeşil müsin olduğunu. Ok uçları hyphae'yi gösterir. Oklar mayayı gösterir. Ölçek çubukları = 20 μm. Görüntüler F ve G Witchley ve ark.^12'denuyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: FISH lekeli C. albicanların farklı bağırsak bölmelerinde görünümü. Yabani tip C. albicans fare GI yolu belirtilen segmentlerinde gösterilir. Her bölmede, görüntüler ev sahibi mukozaya bitişik alanı ve bağırsak lümenmerkezi bölge tasvir. Panfungal probu ile boyama yapıldı. Ölçek çubuğu = 20 μm. Görüntüler Witchley ve ark.^12'denuyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Antibiyotik stokları (200x)
Penisilin G	181 mg/mL
Streptomisin	400 mg/μL
Methacarn
Stok	Son konsantrasyon	Birim	Birim
Metan -ol	60%	300	Ml
Kloroform	30%	150	Ml
Buzul asetik asit	10%	50	Ml
Hibridizasyon çözümü
Stok	Son konsantrasyon	Birim	Birim
1 M Tris-HCl, pH 7.4	20 mM	20	μL
5 M Nacl	0,9 M	180	μL
SDS	0.10%	10	μL
0 formamid	1.00%	10	μL (kullanımlar arasında -20 °C'de küçük aliquots olarak tutulur)
RNase içermeyen su		780	μL
FISH yıkama solüsyonu
1 M Tris-HCl, pH 7.4	20 mM	1	Ml
5 M Nacl	0,9 M	9	Ml
RNase içermeyen su		40	Ml
Müsin-çekirdek boyama çözeltisi
DAPI, 10 μg/mL	20 ng/mL	2	μL
lektin, 40 μg/mL	1.6 g/mL	40	μL
PBS, pH 7.4		958	μL

Tablo 1: Bu protokolde kullanılan çözeltilerin tipik hacimleri ve konsantrasyonları.

Tartışma

Burada açıklanan yöntem, herhangi bir cinsiyet veya zorlanma commensally kolonize farelerin GI yollarında C. albicans mayave hyphae görselleştirilmesi için izin verir. FISH sondası, mantar sitoplazması boyunca dağıtılan 23S rRNA ile melezleşir. Yöntemimiz bağırsak bakterileri görselleştirmek için daha önce bildirilen protokolden uyarlanmıştır²⁰. C. albicans ana bilgisayar içinde morfolojisini değiştirdiğinden, yöntem mantar hücre şeklini ve yerelleştirmeyi izlemek için yararlıdır. Örneğin, bu yöntemi mayaların sindirim sistemi boyunca baskın olduğu hipotezini çürütmek ve bazı "filamentasyon-kusurlu" mutantların in vivo ve in vitro fenotipleri arasındaki tutarsızlıkları ortaya çıkarmak için kullandık¹².

C. albicans commensal colonization için çeşitli fare modelleri mevcuttur. Laboratuvar fareleri ve insanların mikrobiyota ayrı ve, farelerde, antibiyotik kullanımı veya özel bir diyet istikrarlı kolonizasyon kurmak için gereklidir. Antibiyotik tedavisi de c. albicans insanların kolonizasyonu artırır ve yaygın hastalık için önemli bir risk faktörüdür¹⁰. Bu çalışmada kullanılan antibiyotikler nispeten ucuz ve bakteriyel mikrobiyota güvenilir düşüşler verim. Antibiyotikler intagonistik bakteri türlerinin yükünü azaltmak için kullanılan, hayvanlardan tüm bakterileri ortadan kaldırmak için değil unutmayın. Araştırmacılar C. albicansçalışma istiyorsanız- bakteri yokluğunda etkileşimleri barındırmak veya antibiyotik veya özel bir diyet kullanımı önlemek için, mikropsuz hayvanlar geleneksel yetiştirilen hayvanlar için ikame edilebilir; ancak, gnotobiyotik fareler bazı immün ve anatomik anormallikler sergilerler ve bu nedenle tüm amaçlar için uygun olmayabilir.

Başarılı FISH boyama için birkaç adım önemlidir: Önerilen fiksasyon yöntemi, özellikle mukus tabakası ve üç boyutlu gibi bağırsak lümeninin kırılgan içeriğini korumak için GI dokularının yapısal bütünlüğünü korumak için önemlidir. mantar ve bakteri organizasyonu¹⁶. Su içeren yaygın olarak kullanılan birçok fiksasyon çözümlerinin parlak mimariye son derece zarar verdiğini lütfen unutmayın. Bu protokolde önerilen fiksasyon sonrası yıkıntılar için fiksatifler ve çözümler su içermez ve su ile kirlenmeyi önlemek önemlidir. Bir diğer kritik adım ise hibridizasyon fırınındaki slaytların kuluçkaya yatışı sırasında hibridizasyon çözeltisinin buharlaşmasını önlemenin önemli olduğu hibridizasyon adımıdır. Bu sorunu önlemek için slaytları su geçirmez bir kapta yerleştirmenizi öneririz. Alternatif olarak, bir başlangıçta mikrodizilerin hibridizasyonu için kullanılan gibi su geçirmez hibridizasyon odaları kullanabilirsiniz.

Bir C. albicans-özelFISH probu bu protokolde açıklanmıştır. Ancak, birçok laboratuvar yetiştirilen fareler c. albicans veya diğer mantarlar kendi doğal bağırsak mikrobiyota bir parçası olarak içermediğinden, bir panfungal prob özellikle deneysel kolonize hayvanlarda C. albicans leke olabilir. Bir panfungal probun yerine üstün hibridizasyon özellikleri ve daha yüksek sinyal-gürültü oranı nedeniyle istenemeyebilir. Panfungal prob C. albicansiçin bir psödospesifik sonda olarak kullanılırsa, bu enfekte olmayan hayvanlarda boyama eksikliği belgelemek için önemlidir (yani, antibiyotik ile tedavi ama C. albicans). Kolonize olmayan bir kontrol hayvanının boyanması, FISH problarının gıda partiküllerine yapışmasından kaynaklanabilecek arka plan boyamalarını değerlendirmek için de yararlıdır. Genel olarak, FISH problarının kullanımı Calcofluor white (hücre tipleri arasında farklılık gösteren bir hücre duvarı bileşeni olan chitin, GMS veya ticari olarak mevcut antifungal antikorlar) gibi diğer boyama mantarları yöntemlerine göre gelişmiş özgüllük sunar. Ayrıca FISH boyama, türe özgü rRNA'lara farklı olarak etiketlenmiş FISH probları kullanarak birden fazla organizmanın costaining sağlar.

Bu tekniğin bir uyarı bazı C. albicans maya hücre tipleri FISH (örneğin, opak ve GUT hücre tipleri) tarafından çok benzer görünür olmasıdır. Bu hücre türleri arasında ayırt etmek için, hücre tipine özgü mantar mRNA'larına hibridizasyon probları geliştirmek yararlı olacaktır. Bununla birlikte, mevcut haliyle, FISH tekniği zaten in vivo ve in vitro davranışları arasında şaşırtıcı tutarsızlıklar ortaya koymuştur C. albicans mutantlar her iki koşul da altında değerlendirilen¹², karmaşık etkileşimleri gösteren mevcut in vitro tahliller tarafından yeterince taklit olmayan doğal kommensal ortam. Ek yabani tip ve mutant konaklarda farklı C. albicans lekeleri daha fazla çalışmalar mantar-host etkileşimleri içine ek anlayışlar vermek olasıdır. Özellikle, inflamatuar barsak hastalığı modellerinde profil C. albicans öğretici olacaktır, hangi insanlarda C. albicans yüksek titreleri ile ilişkili²¹, ve C. albicans overgrowth ve hastalık diğer modelleri. FISH tekniği de belirli konak hücreleri leke immünohistochemistry ile kombine edilebilir. Genel olarak, burada sunulan yöntem memeli GI yolu içinde C. albicans lokalizasyonu ve morfolojisi belirlemek için makul hızlı ve güvenilir bir araç sağlar.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1 mL şırınga	BD	309659	herhangi bir satıcıdan
BHI kan agarı			, herhangi bir satıcıdan
C. albicans FISH probu	IDT DNA Teknolojileri	özel sipariş
Hibridizasyon inkübasyonu			buharlaşmayı azaltmak için su geçirmez oda
Kloroform	Sigma	C2432	> =% 99.5
DAPI	Roche	10236276001	herhangi bir satıcıdan ikame edilebilir
Hassas görev silecek mendilleri	Kimberley-Clark	34256CT	Kimwipes
D-glikoz	Sigma	G7021-5KG	herhangi bir satıcıdan ikame edilebilir
Etanol	Sigma	E7023	moleküler biyoloji sınıfı
Besleme iğneleri	Cadence, Inc.	7910	metal; 20 X1-1/2" W/2-1/4; sterilize etmek için otoklavlanabilir
FITC-UEA-1	Sigma	L9006-1MG	diğer floroforlar mevcuttur
FITC-WGA	Sigma	L4895-2MG	diğer floroforlar mevcuttur
Köpük pedler	Fisher	22038221	Kasetlere sığacak köpük pedler sipariş
Formamid	Sigma	47671	moleküler biyoloji sınıfı
Buzlu asetik asit	Macron İnce Kimyasallar	MK881746	ACS reaktifi, >=%99,5
Cam Coplin kavanozu	Fisher	08-815	arka arkaya 10 slayta kadar tutun
Histoloji kasetleri	Simport	M512	Çekumun ezilmemesi için derin kasetler
Hibridizasyon lamel	Sigma	GBL712222	RNaz içermeyen
Hibridizasyon fırını			herhangi bir satıcıdan ikame edilebilir
LB			herhangi bir satıcıdan ikame edilebilir
Lee'nin ortamı			Lee ve ark. 1975
Metanol	Sigma	179337	ACS reaktifi, >=%99.8
Fareler	Charles River Laboratories	028	yetişkin BALB/c; 18-21 gram (8-10 hafta)
Paraformaldehit	Fisher	50-980-487	%16 çözelti
Pararafin balmumu	Sigma	P3558-1KG	Doku gömme için
Paraplast PBS, pH 7.4	UCSF Hücre Kültürü Tesisi Medya Üretim Ünitesi	CCFAL003	kalsiyum, magnezyum içermez; herhangi bir satıcıdan ikame edilebilir
Penisilin G	Sigma	PENNA-100MU
Sabouraud dekstroz agar			olabilir herhangi bir satıcıdan ikame edilmiş
Saline	Baxter	2F7123	steril, herhangi bir satıcıdan ikame edilebilir
Sodyum klorür (NaCl)	Sigma	S3014	herhangi bir satıcıdan ikame edilebilir; RNaz içermeyen
Sodyum dodesil sülfat (SDS)	Sigma	L3771	herhangi bir satıcıdan ikame edilebilir; RNaz içermeyen
Streptomisin	Sigma	S9137-100G'yi	koruyun
Süper PAP kalemi	Life Technologies	8899	herhangi bir satıcıdan ikame edilebilir
Tris-HCl	Sigma	T3253	herhangi bir satıcıdan ikame edilebilir; RNaz içermez
Vectashield	Vektör Laboratuvarları	H-1000	DAPI
Ksilenleri	içermez Sigma	214736	reaktif sınıfı
YEPD			olabilir herhangi bir satıcıdan ikame edildi