Yöntem makalesi

Beş Omurgalı Grubu Arasında Merkezi Sinir Sistemi Mikrodamarlarının Güvenilir İzolasyon

DOI:

10.3791/60291

⸱

12 Ocak 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy, Physiology and Cell Biology, University of California Davis, 2University of Veterinary Medicine Hannover Foundation

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolün amacı lissencephalic ve gyrencephalic omurgalıların merkezi sinir sisteminin birden fazla bölgesinden mikrodamarları izole etmektir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrodamarların merkezi sinir sisteminden (CNS) izolasyonu genellikle çoğu kemirgenler olmak üzere birden fazla hayvanDan kortikal doku birleştirilerek gerçekleştirilir. Bu yaklaşım korteksiçin kan-beyin bariyeri (BBB) özelliklerinin sorgulanmasını sınırlar ve bireysel karşılaştırmaya izin vermez. Bu proje birden fazla CNS bölgelerinden nörovasküler birim (NVU) karşılaştırma sağlayan bir izolasyon yönteminin geliştirilmesi üzerinde duruluyor: korteks, serebellum, optik lob, hipotalamus, hipofiz, beyin sapı, ve omurilik. Ayrıca, başlangıçta mürin örnekleri için geliştirilen bu protokol, mikro damarları beyin yarımkürebeyaz maddesinden izole edebildiğimiz küçük ve büyük omurgalı türlerinCNS dokularında kullanılmak üzere başarıyla uyarlanmıştır. Bu yöntem, immünetiketleme ile eşleştirilmiş, protein ekspresyonu ve bireyler arasında istatistiksel karşılaştırma, doku tipi veya tedavi nicelik sağlar. Bu uygulanabilirliği, nöroinflamatuar bir hastalık olan multipl sklerozun bir minür modeli olan deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE) sırasında protein ekspresyonundaki değişiklikleri değerlendirerek kanıtladık. Ayrıca, bu yöntemle izole mikrodamarlar qPCR, RNA-seq ve Batı lekegibi downstream uygulamaları için kullanılabilir, diğerleri arasında. Bu ultracentrifugation veya enzimatik dissociation kullanmadan CNS mikrodamarları izole etmek için ilk girişimi olmasa da, tek bireyler ve birden fazla CNS bölgelerinkarşılaştırma için onun ustalık benzersizdir. Bu nedenle, aksi takdirde belirsiz kalabilir farklılıkların bir dizi soruşturma için izin verir: CNS bölümleri (korteks, serebellum, optik lob, beyin sapı, hipotalamus, hipofiz, ve omurilik), CNS doku tipi (gri veya beyaz madde), bireyler, deneysel tedavi grupları ve türleri.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Beynimiz vücudumuzdaki en önemli organdır. Bu nedenle, normalden sapmayı tetikleyebilecek dış etkenlere rağmen beyin homeostazı tutmak bir önceliktir. Bazı bilim adamlarına göre, yaklaşık 400-500 milyon yıl önce1, omurgalı hayvanlar şimdi kan-beyin bariyeri (BBB)2,3olarak bildiğimiz geliştirdi . Bu koruyucu "çit" sıkı iyonların taşınması düzenleyerek merkezi sinir sistemi (CNS) homeostazı ve fonksiyonları üzerinde en büyük etkiyi uygular, moleküller, ve kan ve CNS parankim arasında hücrelerin taşınması. BBB bozulduğunda, beyin toksik maruzkalma duyarlı hale gelir, enfeksiyon, ve inflamasyon. Bu nedenle, BBB disfonksiyonu ile ilişkili birçok, hepsi değilse, nörolojik ve nörogelişimsel bozukluklar4,5,6.

BBB sofistike fonksiyonu benzersiz CNS mikrovaskülküle nörovasküler birim (NVU) 2,3tarafından uygun atfedilir. Son derece özel endotel hücreleri, perisitler ve astrositik uç ayaklar NVU2,3hücresel bileşenleridir. Bu hücreler tarafından oluşturulan ekstrasellüler matriks de NVU ve BBB fizyolojisi için gereklidir2,3. NVU'nun temel hücresel ve moleküler bileşenleri omurgalılar arasında korunmuş olsa da, heterojenlik siparişler ve türler arasında rapor edilir7,8. Ancak, teknik sınırlamalar nörobiyoloji, biyomedikal veya çevirisel araştırmalardaki bu farklılıkları tam olarak göz önünde bulundurma yeteneğimizi engellemez.

Bu nedenle, beş omurgalı grubundan balık, amfibiler, sürüngenler, kuşlar ve memeliler gibi çok sayıda türe de uygulanabilmek için CNS bölgesine özgü mikrodamar izolasyon yöntemini genişlettik. Protokol, çevirisel alaka düzeyi9olan türler de dahil olmak üzere küçük lissensefalik ve büyük jinekolojik omurgalılarda kullanılmak üzere tanımlanmıştır. Ayrıca, bu bağlamda daha önce araştırılmayan, ancak nörofizyoloji ile ilgili ve muazzam klinik etkileri olan CNS'nin diğer bölgelerini de dahil ediyoruz: hipotalamus, hipofiz ve beyaz madde. Son olarak, nvu ve / veya BBB9,10,11 boyunca protein ekspresyonu değişiklikleri tanımlamak için güvenilir bir araç olarak bu izolasyon yöntemininkapasitesinitest etti. Kavram kanıtı olarak, EAE sırasında VCAM-1 ve JAM-B ekspresyonundaki değişikliklerin immünoresans tarafından izlenen izolasyon yöntemini kullanarak nasıl belirlenebileceğimizi gösterdik.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmanın tüm prosedürleri Kaliforniya Üniversitesi (UC), Davis Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından belirlenen kurallara uygundur. UC Davis hayvan bakımı çeşitli bağımsız kaynaklar tarafından düzenlenir ve tam Değerlendirme ve Laboratuvar Hayvan Bakımı Uluslararası Akreditasyon Derneği (AAALAC) tarafından 1966 yılından bu yana akredite edilmiştir. Porcine CNS dokuları UCD Hayvan Bilimleri Bölümü Et Bilimleri Laboratuvarı'ndan alındı. Rhesus makaklarından CNS dokuları Kaliforniya Ulusal Primat Araştırma Merkezi Patoloji Bölümü'nden (NIH P51OD011107) alındı. Laboratuvar personeli tarafından domuz ve makaklara anestezi, ötenazi veya nekropsi yapılmadı. Bu nedenle, bu konularda özel bir öneri yoktur.

NOT: Bu yöntem birden fazla tür için doğrulanmıştır, ancak sağlanan protokol fare ve domuz dokularına daha doğrudan karşılık gelir. Memeli örnekleri kullanırken optik lobile ilgili ayrıntılar geçerli değildir. Tüm biyolojik tehlikeli maddeler uygun bir biyogüvenlik düzeyinde (BSL) tesiste kullanılmalıdır. Tüm akut toksik maddeler bir duman kaputunun altında ele alınmalıdır. Tüm biyolojik tıbbi atıklar ve akut toksik atıklar düzgün bir şekilde bertaraf edilmelidir.

1. Hazırlık

  1. En az bir gün öncesinde çözümler hazırlayın (Tablo 1).
    NOT: 70 kDa molekül ağırlığı (MW) dekstran eritmek çok zordur. Çözeltinin parafin film veya folyo ile kaplı bir gecede karıştırmak için daha verimlidir. Protokol, araştırma altındaki numuneye bağlı olarak iki farklı MV-2 çözeltisi kullanılmasını gerektirir. %18 dekstran, küçük lissensefalik numuneler üzerinde protokolü gerçekleştirirken miyelini mikrodamar peletinden verimli bir şekilde ayırır. Ancak, büyük jirensefalik örneklerden CNS dokuların arayüzü içinde miyelin bir yayma geliştirir, yanı sıra hipotalamus ve küçük örneklerden hipofiz. Bu yayma% 20 dekstran kullanılarak önlenir.
  2. Poli-D-lizin kuyusu başına 50 μL yükleyerek iyi kaydıraklar hazırlayın ve tercihen biyolojik güvenlik kabini sınıfı 2 (BSC-2) ile oda sıcaklığında (RT) 2 saat kurumasını bekleyin. Fazla kurmayın. Fosfat tamponlu salin (PBS) ile iki kez durulayın ve kullanıma hazır olana kadar buzdolabında saklayın.

2. Küçük Lissencephalic Vertebrat Örneğinden CNS Doku Diseksiyonu

NOT: Makale bir C57BL6/J, 10 haftalık, ~ 25 g, erkek fare protokolün uygulama gösterir.

  1. Numune başına mv-1 çözeltisi olmak üzere sırasıyla 5 mL ve 1 mL'lik iki 15 mL konik tüp ve 1,7 mL mikrosentrifuge tüp hazırlayın. Tüpleri buzda tut.
  2. Anestezi
    1. Bir ketamin intraperitoneal enjeksiyon ile fareler anestezi, ksilazin, ve asetpromazine anestezik kokteyl 100/10/3 kg vücut ağırlığı başına mg ve sprey 70% etanol ile. Palpebral ve pedal reflekslerinin eksikliğini göz değdirerek ve sırasıyla bir ayağı çimdikleyerek değerlendirerek anesteziyi doğrulayın.
    2. Bir indüksiyon anestezi kutusu kullanarak% 5 isofluran inhalasyon güvercinler anestezi.
    3. Su tankı veya amfibi Ringer çözeltisi(Malzeme Tablosu)tutan bir balıkta %1 Tricaine'de balık ve kurbağaları anestezi edin.
    4. Ötanaziden önce 4 °C'de soğuyarak kertenkeleleri anestezi edin.
  3. Cerrahi makas ile hayvan Decapitate, kafatası ortaya çıkarmak için forseps ile deri soyma, ve foramen magnum ile LaGrange makas ile kesilmiş (Şekil 1A).
  4. Spatula ile beyni parçalayın ve MV-1 solüsyonu olan 15 mL konik tüpe aktarın. Tüpü buzda tut.
  5. Forseps ile kafatasısella turcica hipofiz almak ve MV-1 çözeltisi ile 1.7 mL mikrosantrifüj tüp transfer. Tüpü buzda tut.
  6. Vertebral sütun ortaya çıkarmak için deri ve kas çıkarın. Ekstremiteleri, göğüs kafesini ve iç organları kesin(Şekil 1B).
  7. Aşağıda açıklanan iki yöntemden biri ile omuriliği inceleyin. Daha sonra MV-1 çözeltisi ile 5 mL konik tüpe aktarın. Tüpü buzda tut.
    1. LaGrange makas ile kaudal yönde bir rostral keserek laminektomi gerçekleştirin, servikal vertebra foramenile başlayan , lomber kordon ulaşana kadar.
    2. 18 G iğne ve MV-1 çözeltisi yüklü 10 mL şırınga ile lomber vertebra foramen boyunca rostral yönde bir kaudal yıkama gerçekleştirin(Şekil 1C,D).
      NOT: Bu yöntem sadece çok küçük örnekler, çoğunlukla kemirgenler (<100 g) ile çalışır.
  8. Bir diseksiyon kapsamı kullanarak, bahar makas ile omurilikten dural kese kesmek ve çift uçlu pick ile kalan menenjler kaldırmak(Şekil 2).
  9. Beyni Petri kabına aktarın ve bir diseksiyon dürbünü kullanarak, çift uçlu kazma ile menenjleri çıkarın(Şekil 2A–C).
  10. Koku ampulleri ve talamus forceps, iris makas ve bahar makas ile excise. Çift uçlu pick kullanarak, tüm beyin ventriküllerinden koroid pleksus kaldırın. Tüm koroid pleksus kaldırmak için emin olun.
    NOT: Koroid pleksus ve koku ampulleri büyük bir kontaminasyon kaynağıdır. BBB aksine, bu kılcal damarlar yüksek fenestrated ve onlar kaldırılmaz eğer sonraki deneylerin sonuçları tehlikeye olacaktır.
  11. Forseps kullanarak, farklı CNS bölgeleri ayırın: korteks, beyincik, beyin sapı, optik lob (memeli örnekleri üzerinde değil) ve hipotalamus.

3. Büyük Jirensefalik Omurgalı Örneğinden CNS Doku Diseksiyonu

NOT: Bu protokol, mezbahadan elde edilen domuz CNS dokularını kullanır. Bu nedenle, hiçbir anestezi, ötenazi veya nekropsi burada açıklanan veya gösterilmiştir.

  1. Bir buz sandığı / kova içinde MV-1 çözeltisi yüklü bir 0.946 L (32 oz) histoloji konteyner içinde taşıma domuz CNS dokuları.
  2. Bir diseksiyon kapsamı kullanarak, bir çift uçlu pick, forceps, iris makası ve bahar makası ile menenjler çıkarın her CNS doku. Beyin ventriküllerinden koroid pleksus parçalarını çıkardığınızdan emin olun.

4. CNS Doku Homojenizasyonu

NOT: İki araştırmacıhomojenizasyon sürecine girdiğinde daha verimlidir: biri steroskop altında menenjlerin kesilmesi, diğeri ise kıymalı dokuların homojenleştirilmesidir. Bu şekilde, dokular hızla buz kovası döndürülür ve soğuk tutulur.

  1. Her CNS bölgesini ~1 mL MV-1 çözeltisi içeren bir Petri kabına yerleştirin. Tek kenarlı bir bıçak kullanarak, 1-2 mm adet elde etmek için doku kıyma.
    1. Küçük bir omurgalı numunesi için 100 mm x 20 mm Petri kabı kullanın.
    2. Büyük bir omurgalı numunesi için 150 mm x 15 mm Petri kabı kullanın.
  2. Küçük bir omurgalı örneğinin homojenizasyonu (Tablo 2 ve Tablo 3)
    1. Transfer pipeti kullanarak ptfe zararlısı ile tek bir 10 mL Potter-Elvehjem cam doku öğütücüsünün korteks, beyincik, beyin sapı, optik lob ve omuriliği ~1 mL MV-1 çözeltisine aktarın. 5 mL MV-1 çözeltisi ekleyin ve her dokuyu homojenize edin (~10 vuruş). Bireysel 15 mL konik tüplere aktarın. Tüpleri buzda tut.
      NOT: Optik loblu veya optik lobsuz küçük bir omurgalı için sırasıyla 10 mL Potter-Elvehjem öğütücüler ve 15 mL konik tüp gereklidir.
    2. Tek bir 1,7 mL tüpte forsepsli hipotalamus ve hipofiz ~100 μL MV-1 çözeltisine aktarın ve cam mikroteksle dikkatlice homojenize olun. Her mikroengiyi ~1 mL MV-1 çözeltisi ile durulayın. Tüpü buzda tut.
      NOT: Küçük bir omurgalı için 2 cam mikrotekles ve 1.7 mL tüp gereklidir.
  3. Büyük bir omurgalı örneğinin homojenizasyonu (Tablo 4 ve Tablo 5)
    1. Bir transfer pipet kullanarak, bir PTFE havaneli ile 55 mL Potter-Elvehjem cam doku öğütücü için kıyma doku aktarın ve havai karıştırıcı eklemek. Homojenize edilen belirli CNS kısmına göre önerilen MV-1 çözeltisi hacminin yarısını ekleyin (Tablo 5).
    2. Çok düşük hızda (~ 150 rpm) havai karıştırıcı açın ve dikkatle yukarı ve aşağı yaklaşık 30 s için cam tüp hareket ettirin.
    3. Havai karıştırıcıyı kapatın, daha fazla MV-1 çözeltisi ekleyin ve homojen bir bulamaç elde edene kadar adım 4.3.2'yi tekrarlayın.
    4. 50 mL konik tüpe aktarın. Tüpü buzda tut.
    5. Her CNS doku homojenizasyonu arasında değirmeni deiyonize su ile yıkayın.
      NOT: Büyük bir omurgalı için 5 veya 4, beyaz maddeli veya beyaz maddesiz, sırasıyla 50 mL konik tüplere ihtiyaç vardır. Aynı şekilde hipotalamus ve hipofiz için iki (2) 15 mL konik tüp gereklidir.

5. Mikrodamar Arınma

  1. 4.2.1, 4.2.2 veya 4.3.4 adımdan kaynaklanan santrifüj dokusu, 4 °C'de 10 dakika boyunca 2.000 x g.'de homojendir. Kırmızımsı mikrodamarların peletlerinin üstünde miyelinin büyük beyaz bir arabirimi oluşacaktır. Supernatants atın.
    1. Küçük omurgalı örneği (Tablo 2 ve Tablo 3)
      1. 5 mL serolojik pipet (~10 floş) ile 5 mL buz gibi MV-2 çözeltisinde korteks, beyincik, beyin sapı, optik lob ve omurilik peletlerini yeniden askıya alın. Her süspansiyona 5 mL buz gibi MV-2 çözeltisi ekleyin ve tüpleri çevirerek dikkatlice karıştırın.
      2. 1 mL MV-2 solüsyonu ile hipotalamus ve hipofiz peletlerini yeniden askıya alın.
    2. Büyük omurgalı örneği (Tablo 4 ve Tablo 5)
      1. Korteks, beyincik, beyin sapı ve omurilik mikrodamar peletlerine 20 mL buz gibi MV-2 çözeltisi ekleyin. Bir tüp revolver shaker üzerinde karıştırarak pelet resuspend, ~ 5 dk için 40 rpm karıştırarak. Daha fazla MV-2 çözeltisi ekleyerek korteks, beyincik, beyin sapı ve omurilik süspansiyonları konik tüpler 'hacimleri dengesi.
      2. 5 mL serolojik pipet (~10 floş) ile 5 mL MV-2 çözeltisinde hipotalamus ve hipofiz mikrodamar peletlerini yeniden askıya alın. Süspansiyonlara 5 mL buz gibi MV-2 çözeltisi ekleyin ve tüpü çevirerek dikkatlice karıştırın.
  2. 4 °C'de 15 dk için 4.400 x g santrifüj.
  3. Tüpleri yavaşça döndürerek ve süpernatantın duvarlar boyunca geçmesine izin vererek her tüpün duvarlarından sıvı arabirimindeki kalın ve yoğun miyelin tabakasını dikkatlice ayırın.
  4. Miyelin ve sıvı arabirimini atın ve her tüpün iç duvarını düşük tiftikli kağıt mendille sarılmış bir spatula ile lekelayın. Küçük omurgalı örnekleri için, transfer pipeti ile dikkatlice emerek her hipotalamus ve hipofiz tüpünden miyelin tabakasını çıkarın.
  5. Bükümlü düşük tiftik kağıt mendili yle fazla sıvıyı silin. Düşük bağlayıcı ipuçları kullanarak 1 mL MV-3 çözeltisi ile her peleti yeniden askıya alın. Tüpleri buzda tut.

6. Mikrodamar Elüsyonu ve Filtrasyonu

  1. Her CNS bölgesi için ayrı ayrı gagalara buz gibi MV-3 çözeltisi dökün. 4 °C'de tutun.
    1. Küçük omurgalı numuneler için, 50 mL kabı başına 10 mL MV-3 çözeltisi kullanın. Optik lobun dahil olup olmadığına bağlı olarak toplam 6-7 beare gereklidir.
    2. Büyük omurgalı numuneler için, 100 mL kabı başına 30 mL MV-3 çözeltisi kullanın. Beyaz maddenin dahil olup olmadığına bağlı olarak toplam 6-7 gaga gereklidir.
  2. 50 mL konik tüpün üzerine bir hücre süzgeci yerleştirin. CNS bölgesi başına bir tane kullanın. Korteks, beyin sapı, optik lob, omurilik ve hipofiz için 100 μm süzgeç kullanın. Beyincik ve hipotalamus için 70 μm hücreli süzgeç kullanın.
  3. Her süzgecinizi 1 mL buz gibi MV-3 çözeltisi ile ıslayın.
  4. Agregalardan kaçınmak için karıştırırken serolojik pipetle adım 5.5'te hazırlanan süspansiyonlara daha fazla MV-3 çözeltisi ekleyin. Mikro damarları süzgeç üzerine dikkatlice yükleyin. Buz gibi MV-3 çözeltisi ile durulayın.
    1. Küçük omurgalı numuneler için(Tablo 2 ve Tablo 3),serolojik pipet le 10-15 mL MV-3 çözeltisi ekleyin ve 5 mL MV-3 çözeltisi ile durulayın.
    2. Büyük omurgalı numuneler için, serolojik pipet ile 20 mL MV-3 çözeltisi ekleyin ve 10 mL MV-3 çözeltisi ile durulayın.
  5. Filtreleme ünitesini modifiye edilmiş bir filtre tutucuya(Şekil 2D)CNS bölgesi başına bir adet 20 m naylon net filtre yerleştirerek monte edin.
    1. Küçük omurgalı örnekleri için(Tablo 2 ve Tablo 3),korteks, beyincik, beyin sapı, optik lob ve omurilik için 25 mm modifiye filtre tutucular kullanın. Hipotalamus ve hipofiz için 13 mm modifiye filtre tutucu kullanın.
    2. Büyük omurgalı örnekleri için(Tablo 4 ve Tablo 5),korteks, beyincik, beyin sapı ve omurilik için 47 mm modifiye filtre tutucular kullanın. Hipotalamus ve hipofiz için 25 mm kullanın.
  6. Filtreyi 50 mL konik bir tüpün üzerine yerleştirin ve 5 mL buz gibi MV-3 çözeltisi ile ıslak filtre yiyerek tamponun filtre tutucudan konik tüpe dökülmesini önleyin.
  7. Eluted mikrodamarları (adım 6.4)'ı 20 μm naylon net filtrenin üzerine aktarın ve mikro damarları 5-10 mL buz gibi MV-3 çözeltisi ile durulayın.
  8. Filtreyi temiz forsepsler kullanarak kurtarın ve 6.1 adımda hazırlanan buz gibi MV-3 çözeltisini içeren kabın içine batırın.
  9. Mikro damarları filtreden yaklaşık 30 s boyunca hafifçe sallayarak ayırın. Küçük omurgalı örnekleri için, 15 mL konik bir tüp içinde beher içeriği dökün. Büyük omurgalı örnekleri için, 50 mL konik bir tüp içinde beher içeriği dökün.
  10. 4 °C'de 5 dk için 2.000 x g'lık santrifüj ve düşük bağlayıcı lı pipet ucu kullanarak 1 mL buz gibi MV-3 çözeltisi içinde peleti yeniden askıya alın.
    1. Küçük omurgalı numuneler için süspansiyonu (adım 6.10'dan) 1.7 mL mikrosantrifüj tüpe ve santrifüje 20.000 x g'de 4 °C'de 5 dk'ya aktarın.
      NOT: Bu dönüş, sağlam bir verim sağlamak için maksimum hızda (~20.000 x g)tezgah üstü bir santrifüjde gerçekleştirilir.
    2. Büyük omurgalı numuneler için, 6.10 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne süspansiyonu aktarın, 4 mL MV-3 çözeltisi ekleyin ve 4 °C'de 5 dk için 2.000 x g'de santrifüj ekleyin.

7. İmmünoboyama

NOT: Hematoksilin ve eozin (H&E) boyası protokol fizibilitesinin kanıtı olarak sürüngen, amfibi ve balık örneklerine yapıldı. Bu nedenle, bu örnekler için immünetiketleme için bir öneri yoktur.

  1. Mikrosantrifüj tüplerinden süpernatant çıkarın.
  2. Düşük bağlayıcı lı pipet ucu(Malzeme Tablosu)kullanarak 1x steril PBS pelet resuspend . Mikro damarların birden fazla kez boru landırarak agrega oluşturmasını engelleyin. Küçük omurgalı numuneler için(Tablo 3),pelet boyutuna göre ~100 μL-2.000 μL kullanın. Büyük omurgalı örnekleri için(Tablo 5),pelet boyutuna göre ~1.000 μL-4.000 μL kullanın.
  3. Düşük bağlayıcılı pipet ucu kullanarak, mikro damarları iyi kaydıraklara aktarın, yan duvarlardan kaçınarak her kuyunun ortasına eklemeye dikkat edin.
  4. Bir BSC-2 içinde ortaya iyi slaytlar ayarlayın ve RT 20 ila 30 dakika kurumaya bırakın.
    NOT: Agrega oluşumunu önlemek için nispeten yüksek hacimli 1x PBS kullanılır. Bu nedenle, mikrodamarların poli-D-lizin kaplama tarafından tutulduğundan emin olmak için fiksasyon dan önce slaytların kurutulması gerekmektedir.
  5. Bir transfer pipeti ile pipetleme yaparak artık 1x PBS'yi çıkarın, 200 μL %4 paraformaldehit (PFA) ekleyin ve RT'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
  6. Pipet fiksatif çözeltiyi dışarı ve RT 5 dakika için 1x PBS 200 μL ile 3x yıkayın.
    NOT: Bu noktada balık, amfibi ve sürüngen CNS mikrodamarlarında H&E boyama işlemi yapıldı.
  7. Kuyu kaydıraä ına 200 μL engelleme tamponu ekleyin ve 37 °C' de 60 dakika kuluçkaya yatırın.
  8. Bir transfer pipet ile engelleme tampon u çıkarın ve antikor dilüent(Malzeme Tablosu)birincil antikor kokteyl 200 μL ekleyin. Gece boyunca 4 °C'de kuluçkaya yatırın.
  9. Ana antikor kokteylini çıkarmak için pipet ve RT'de 5 dakika boyunca 200 μL 1x PBS ile 3x yıkayın.
  10. 1x PBS'de seyreltilmiş ikincil antikor kokteylini(Malzeme Tablosu)yükleyin ve RT'de 2 saat boyunca ışıktan korunan kuluçkaya yatırın.
  11. Pipet ikincil antikor kokteyli dışarı ve 3x 200 μL 1x PBS ile 5 dakika RT, ışıktan korunan. Son yıkamadan sonra iyi kaydıraktan sonra kaydıraktan sonra çerçeveyi ayırın ve 1x PBS'yi düşük tiftik kağıt silme ile kurulayın.
  12. Bir coverslip ekleyin, sıvı antifade montaj lı orta, ve 4′, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) nükleer boyama için. RT'de bir gecede ışıktan korunarak kurusun.
  13. Kuruduktan sonra, konfokal mikroskopi ve veri toplama için hazır olana kadar 4 °C'de bir slayt kutusundaKi ışıktan korunun.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Murine CNS'den izole edilen mikrodamarlar nörovasküler ünite2,3'üntüm içsel hücresel bileşenlerini gösterdi. Endotel hücreleri için trombosit endotel hücreli adezyon molekülü-1 (PECAM, CD31 olarak da bilinir) veya isolectin IB4 (endotel hücreli glycocalyx bağlayan bir glikoprotein) kullanarak, trombosit kaynaklı büyüme faktörü-β (PDGFRβ) veya perisitler için nöron-glial antijen 2 (NG2) ve astrositik uç ayaklar için aquaporin-4 (AQ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BBB sıkı sofistike bir mimari ile birleştiğinde beyin mikrovaskületür endotel hücrelerinin benzersiz özelliklerini içerir,, "peg-soket"- kavşaklar, ve yapışma plakları CNS homeostaz için kritik2,3,19. Endotel hücreleri özellikleri indüklenen ve perisitler ve çevreleyen astroglia son ayak süreçleri2tarafından korunur,3,19. BBB mikrovaskü...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr. Cruz-Orengo California Üniversitesi, Davis, Veterinerlik Okulu Start Up Fonları tarafından desteklendi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
10X PBSThermoFisherBP39920Bloke edici ve antikor seyreltici için kullanılır.
%20 PFAElektron Mikroskobu Bilimleri15713-SFiksatif olarak kullanılır (%4 PFA)
70.000 MW DekstranMillipore Sigma9004-54-0MV-2 çözeltisi için kullanılır
Adson ForsepsGüzel Bilim Araçları (FST)11006-12Kas ve cildin çıkarılması için kullanılır
Adson Forseps, öğrenci kalitesiFST91106-12Yukarıdakiyle aynı ancak daha ucuz
Sığır serumu albümin (BSA)Millipore SigmaA7906-100GMV-3 çözeltisi, bloke edici ve antikor seyreltici
Corning 100 & mu için kullanılır; m Hücre süzgeciMillipore SigmaCLS431752-50EA
Corning 70 & mu; m Hücre süzgeciMillipore SigmaCLS431751-50EA
Corning Masaüstü düşük bağlayıcı uçlarMillipore SigmaCLS4151Aşağıdaki ile aynı ancak daha ucuz.
Cultrex Poli-D-Lizin Ar-Ge D3439-100-01Sürgülü kaplama için kullanılır
Eşek anti-Keçi IgG-ALEXA 555ThermoA21432İkincil antikor olarak kullanılır. 1:200 oranında önerilen seyreltme.
Eşek anti-Fare IgG-ALEXA 488ThermoA21202İkincil antikor olarak kullanılır. 1:200 oranında önerilen seyreltme.
Eşek anti-Tavşan IgG-ALEXA 488ThermoA21206İkincil antikor olarak kullanılır. 1:200 oranında önerilen seyreltme.
Eşek anti-Tavşan IgG-ALEXA 647ThermoA31573İkincil antikor olarak kullanılır. 1:200 oranında önerilen seyreltme.
Eşek anti-sıçan IgG-DyLight 650ThermoSA5-10029İkincil antikor olarak kullanılır. 1:200 oranında önerilen seyreltme.
Çift Uçlu Doku AlmaFST18067-11Meninkslerin ve koroid pleksusun çıkarılması için kullanılır
Dumont #3c ForsepsFST11231-20Daha hassas ve/veya küçük CNS doku işleme için kullanılır (hipofiz gibi)
Dumont #7 ForsepsFST11274-20CNS tisssue diseksiyonu ve kullanımı için kullanılır
Dumont #7 Forseps, öğrenciFST91197-00Yukarıdakiyle aynı ancak daha ucuz
ep Dualfilter T.I.P.S. LoRetention İpuçlarıEppendorf22493008Yukarıdaki ipuçlarından daha iyi kalite (daha pahalı).
Ekstra İnce Graefe Forseps, tırtıklıFST11151-10Kemik çıkarmak için kullanılır
İnce Makas, keskinFST14060-09Domuz ve makak dural kesesinin çıkarılması için kullanılır
Cam Havaneli 1.5 mL Mikrosantrifüj Tüpü Doku Öğütücü Homojenizatör, 10'lu PaketChang Bioscience Inc. (eBay)GP1.5_10Küçük veteriner hipotalus ve hipofiz için kullanılır.
Keçi anti-CXCL12, biyotinilePeproTech500-P87BGBTTüm örneklerden CNS mikro damarlarında birincil antikor olarak kullanılır. Önerilen seyreltme: 1:20.
Keçi anti-JAM-BR& DAF1074Nöroinflamasyonu değerlendirmek için birincil antikor olarak kullanılır. Önerilen konsantrasyon: 5 μ g/mL'dir.
Keçi anti-Fare IgG-ALEXA 488ThermoA11001İkincil antikor olarak kullanılır. 1:200 oranında önerilen seyreltme.
Keçi anti-Fare IgG-ALEXA 555ThermoA21424İkincil antikor olarak kullanılır. 1:200 oranında önerilen seyreltme.
Keçi anti-PDGFR ve beta;Ar-Ge DAF1042Tüm örneklerden CNS mikro damarlarında birincil antikor olarak kullanılır. Önerilen konsantrasyon: 5 μ g/mL'dir.
Keçi anti-Tavşan IgG-ALEXA 555ThermoA21249İkincil antikor olarak kullanılır. 1:200 oranında önerilen seyreltme.
Keçi anti-Tavşan IgG-DyLight 488Thermo35552İkincil antikor olarak kullanılır. 1:200 oranında önerilen seyreltme.
Keçi anti-sıçan IgG-DyLight 650ThermoSA5-10021İkincil antikor olarak kullanılır. 1:200 oranında önerilen seyreltme.
Graefe Forseps, kavisli uç, 1X2 dişFST11054-10Naylon filtre ağını tutmak ve sallamak için kullanın
HBSS, 1X kalsiyum ve magnezyum içeren tamponCorning21-022-CMMV-1 çözeltisi için kullanılır
HEPES, 1M sıvı tamponuCorning25-060-CIMV-1 çözeltisi için kullanılır
İzolektin GS-IB4-Biotin-XXThermoFisher Scientific (Thermo)I21414Endotel hücre glikokalisinin D-galaktosil kalıntılarını bağlayan baklagil Griffonia simplicifolia'dan izole edilen glikoprotein. Kuş ve domuz CNS mikro damarları için kullanılır. Önerilen konsantrasyon: 5 μ g/mL'dir.
LaGrange Makas, tırtıklıFST14173-12Kafatası diseksiyonu ve laminektomi için kullanılır (domuz ve makak hariç)
Millicell EZ slayt 8 oyuklu üniteMillipore SigmaPEZGS0816
Fare anti-CLDN5Thermo35-2500Tüm örneklerden CNS mikro damarlarında birincil antikor olarak kullanılır. Önerilen konsantrasyon: 5 μ g/mL'dir.
Fare anti-GGT1Abcamab55138Tüm örneklerden CNS mikro damarlarında birincil antikor olarak kullanılır. Önerilen konsantrasyon: 5 μ g/mL'dir.
Fare anti-İnsan CD31R& DBBA7Primat CNS mikrodamarlarında birincil antikor olarak kullanılır. Önerilen konsantrasyon: 16.5 μ g/mL'dir.
Fare anti-NFMThermoRMO-270Tüm örneklerden CNS mikro damarlarında birincil antikor olarak kullanılır. Önerilen konsantrasyon: 5 μ g/mL'dir.
Fare anti-&alfa; SMAThermoMA5-11547Tüm örneklerden CNS mikro damarlarında birincil antikor olarak kullanılır. 1:200 oranında önerilen seyreltme.
Naylon Filtre Ağı, ruloMillipore SigmaNY600001013 mm çapında filtre ağı disklerine kadar lazerle kesilmiştir. Küçük veteriner hipotalus ve hipofiz için kullanılır.
Naylon Filtre Ağları, 25 mmMillipore SigmaNY2002500Hipotalamus ve hipofiz hariç çoğu küçük omurgalı CNS dokusunda kullanılır. Makak ve domuz hipotalamus ve hipofiz için kullanılır.
Naylon Filtre Ağları, 47 mmMillipore SigmaNY2004700Hipotalamus ve hipofiz hariç, makak ve domuz CNS dokuları için kullanılır.
ThermoFisherP36935ile ProLong Gold antifade reaktifiSlaytları kaplamak için kullanılır.
Tavşan anti-AQP4Millipore SigmaA5971Tüm örneklerden CNS mikro damarlarında birincil antikor olarak kullanılır. 1:200 oranında önerilen seyreltme.
Tavşan anti-LSRMillipore SigmaSAB2107967Tüm örneklerden CNS mikro damarlarında birincil antikor olarak kullanılır. Önerilen konsantrasyon: 5 μ g/mL'dir.
Tavşan anti-NG2Millipore SigmaAB5320Tüm örneklerden CNS mikro damarlarında birincil antikor olarak kullanılır. 1:200 oranında önerilen seyreltme.
Tavşan anti-OSPAbcamab53041Tüm örneklerden CNS mikro damarlarında birincil antikor olarak kullanılır. Önerilen konsantrasyon: 1 μ g/mL'dir.
Tavşan anti-VE-CadherinAbcamab33168Tüm örneklerden CNS mikro damarlarında birincil antikor olarak kullanılır. Önerilen konsantrasyon: 5 μ g/mL'dir.
Tavşan anti-ZO-1Thermo61-7300Tüm örneklerden CNS mikro damarlarında birincil antikor olarak kullanılır. Önerilen konsantrasyon: 5 μ g/mL'dir.
Sıçan anti-CD31Becton DickinsonBD 550274Murin CNS mikrodamarları için birincil antikor olarak kullanılır. Önerilen konsantrasyon: 5 μ g/mL'dir.
Sıçan anti-GFAPThermo13-0300Tüm örneklerden CNS mikro damarlarında birincil antikor olarak kullanılır. 1:200 oranında önerilen seyreltme.
Sıçan anti-VCAM-1Becton DickinsonBD 553329Nöroinflamasyonu değerlendirmek için birincil antikor olarak kullanılır. Önerilen konsantrasyon: 5 μ g/mL'dir.
Steril Ringer Solüsyonu, FrogAldon CorporationIS5066Amfibi anestezisi için kullanılır
Streptavidin-ALEXA 555ThermoS32355Biyotinile edilmiş primer antikorları etiketlemek için ikincil antikor olarak kullanılır. Önerilen 1:500 seyreltme.
Streptavidin-ALEXA 647ThermoS32357Biyotinile edilmiş birincil antikorları etiketlemek için ikincil antikor olarak kullanılır. Önerilen 1:500 seyreltme.
Cerrahi Makas, keskinFST14002-12Kas ve derinin çıkarılmasında kullanılır
Cerrahi Makas, keskin-küntFST14001-16Dekapitasyon için kullanılır (domuz ve makak hariç)
Swinnex Filtre Tutucu, 13 mmMillipore SigmaSX0001300Lazer kesim ile modifiye edilmiştir. Küçük veteriner hipotalus ve hipofiz için kullanılır.
Swinnex Filtre Tutucu, 25 mmMillipore SigmaSX0002500Lazer kesim ile modifiye edilmiştir. Hipotalamus ve hipofiz hariç çoğu küçük omurgalı CNS dokusunda kullanılır. Makak ve domuz hipotalamus ve hipofiz için kullanılır.
Swinnex Filtre Tutucu, 47 mmMillipore SigmaSX0004700Lazer kesim ile modifiye edilmiştir. Hipotalamus ve hipofiz hariç makak ve domuz CNS dokuları için kullanılır.
Triton X-100ThermoFisher50-165-7277Bloke edici ve antikor seyreltici için kullanılır.
Wheaton 120 Vac Tepegöz KarıştırıcıVWR (Tedarikçi DWK Yaşam Bilimleri)62400-904 (DWK #903475)Hipotalamus ve hipofiz hariç, 55 mL doku öğütücülü makak ve domuz CNS dokuları için kullanılır.
PTFE havaneli Wheaton Potter-Elvehjem doku öğütücü, 10 mLVWR (Tedarikçi DWK Yaşam Bilimleri)14231-384 (DWK #357979)Hipotalamus ve hipofiz hariç çoğu küçük omurgalı CNS dokusunda kullanılır. Makak ve domuz hipotalamus ve hipofiz için kullanılır.
PTFE havaneli Wheaton Potter-Elvehjem doku öğütücü, 55 mLVWR (Tedarikçi DWK Yaşam Bilimleri)14231-372 (DWK #357994)Hipotalamus ve hipofiz hariç makak ve domuz CNS dokuları için kullanılır.
DAPI

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bundgaard, M., Abbott, N. J. All vertebrates started out with a glial blood-brain barrier 4-500 million years ago. Glia. 56, 699-708 (2008).
  2. Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, a020412(2015).
  3. Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier. Handbook of Clinical Neurology. 133, 39-59 (2016).
  4. Kealy, J., Greene, C., Campbell, M. Blood-brain barrier regulation in psychiatric disorders. Neuroscience Letters. , (2018).
  5. Sweeney, M. D., Kisler, K., Montagne, A., Toga, A. W., Zlokovic, B. V. The role of brain vasculature in neurodegenerative disorders. Nature Neuroscience. 21, 1318-1331 (2018).
  6. Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. Blood-Brain Barrier: From Physiology to Disease and Back. Physiological Reviews. 99, 21-78 (2019).
  7. Wilhelm, I., Nyul-Toth, A., Suciu, M., Hermenean, A., Krizbai, I. A. Heterogeneity of the blood-brain barrier. Tissue Barriers. 4, e1143544(2016).
  8. O'Brown, N. M., Pfau, S. J., Gu, C. Bridging barriers: a comparative look at the blood-brain barrier across organisms. Genes & Development. 32, 466-478 (2018).
  9. Cruz-Orengo, L., et al. CXCR7 influences leukocyte entry into the CNS parenchyma by controlling abluminal CXCL12 abundance during autoimmunity. Journal of Experimental Medicine. 208, 327-339 (2011).
  10. Serres, S., et al. VCAM-1-targeted magnetic resonance imaging reveals subclinical disease in a mouse model of multiple sclerosis. FASEB Journal. 25, 4415-4422 (2011).
  11. Tietz, S., Engelhardt, B. Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions. Journal of Cell Biology. 209, 493-506 (2015).
  12. Sohet, F., et al. LSR/angulin-1 is a tricellular tight junction protein involved in blood-brain barrier formation. Journal of Cell Biology. 208, 703-711 (2015).
  13. Cruz-Orengo, L., et al. Enhanced sphingosine-1-phosphate receptor 2 expression underlies female CNS autoimmunity susceptibility. Journal of Clinical Investigation. 124, 2571-2584 (2014).
  14. Dayton, J. R., Franke, M. C., Yuan, Y., Cruz-Orengo, L. Straightforward method for singularized and region-specific CNS microvessels isolation. Journal of Neuroscience Methods. 318, 17-33 (2019).
  15. Smyth, L. C. D., et al. Markers for human brain pericytes and smooth muscle cells. Journal of Chemical Neuroanatomy. 92, 48-60 (2018).
  16. Granberg, T., et al. In vivo characterization of cortical and white matter neuroaxonal pathology in early multiple sclerosis. Brain. 140, 2912-2926 (2017).
  17. Datta, G., et al. Neuroinflammation and its relationship to changes in brain volume and white matter lesions in multiple sclerosis. Brain. 140, 2927-2938 (2017).
  18. Tommasin, S., Gianni, C., De Giglio, L., Pantano, P. Neuroimaging Techniques to Assess Inflammation in Multiple Sclerosis. Neuroscience. 403, 4-16 (2019).
  19. Liebner, S., et al. Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease. Acta Neuropathologica. 135, 311-336 (2018).
  20. Cornford, E., Hyman, S. Localization of brain endothelial luminal and abluminal transporters with immunogold electron microscopy. NeuroRx. 2, 27-43 (2005).
  21. Boulay, A. C., Saubamea, B., Decleves, X., Cohen-Salmon, M. Purification of Mouse Brain Vessels. Journal of Visualized Experiments. , 53208(2015).
  22. Paul, D., Cowan, A. E., Ge, S., Pachter, J. S. Novel 3D analysis of Claudin-5 reveals significant endothelial heterogeneity among CNS microvessels. Microvascular Research. , (2012).
  23. Munikoti, V. V., Hoang-Minh, L. B., Ormerod, B. K. Enzymatic digestion improves the purity of harvested cerebral microvessels. Journal of Neuroscience Methods. 207, 80-85 (2012).
  24. Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. M., Decleves, X. Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy. Brain Research. 1134, 1-11 (2007).
  25. Bourassa, P., Tremblay, C., Schneider, J. A., Bennett, D. A., Calon, F. Beta-amyloid pathology in human brain microvessel extracts from the parietal cortex: relation with cerebral amyloid angiopathy and Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica. 137, 801-823 (2019).
  26. Porte, B., et al. Proteomic and transcriptomic study of brain microvessels in neonatal and adult mice. PLoS One. 12, e0171048(2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Kan Beyin Bariyeri zellikleriN rovask ler Birim Kar la t rmasMikrodamar zolasyon Tekni iMSS Dokusu DiseksiyonuMV 1 zeltisi HomojenizasyonuMikrodamar Safla t rma Protokolmm n Etiketleme Tespit Y ntemleriDeneysel Otoimm n EnsefalomiyelitProtein Ekspresyon Kuantifikasyonu

İlgili makaleler