Burada, abd gıda ve ilaç İdaresi (FDA) onaylı Escherichia coli ticari uygulamalar için karşılaştırıldığında Pseudomonas aeruginosa genetik olarak değiştirilmiş suşlarının zayıflamasını değerlendirmek için enfeksiyon fare modelibasit ve tekrarlanabilir bir protokol açıklar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Pseudomonas aeruginosa In-Frame Gen Silme Mutantlar Üretimi ve Enfeksiyon Basit Bir Fare Modelinde Virülans Zayıflama sıiçin Test
Bu makalede
Özet
Özet
Mikroorganizmalar genetik olarak çok yönlü ve çeşitlidir ve birçok ticari ürün ve biyofarmasötik kaynağı haline gelmiştir. Bu ürünlerin bazıları doğal olarak organizmalar tarafından üretilse de, diğer ürünler üretim verimini artırmak için organizmanın genetik mühendisliğine ihtiyaç duyarlar. Escherichia coli Avirulent suşları geleneksel biyofarmasötik üretmek için tercih edilen bakteri türleri olmuştur; ancak, bazı ürünlerin E. coli için üretmesi zordur. Böylece, diğer bakteri türlerinin avirulent suşları bazı ticari ürünlerin üretimi için yararlı alternatifler sağlayabilir. Pseudomonas aeruginosa, E. coli'yeuygun bir alternatif sunabilecek yaygın ve iyi çalışılmış bir Gram-negatif bakteridir. Ancak, P. aeruginosa fırsatçı bir insan patojenidir. Burada, pEX100T-NotI plazmid kullanarak sıralı genomik deletiyonlar yoluyla P. aeruginosa nonpatojenik suşları oluşturmak için kullanılabilecek bir prosedür ayrıntılı. Bu yöntemin en büyük avantajı işaretsiz bir gerinim üretmektir. Bu yöntem, ticari ürünlerin üretimi için yüksek zayıflatılmış P. aeruginosa suşları oluşturmak veya diğer özel kullanımlar için suşları tasarlamak için kullanılabilir. Biz de E. coliFDA onaylı BL21 suşu ile karşılaştırıldığında genetiği değiştirilmiş suşu zayıflatma test etmek için doğrulanmış test suşlarının intraperitoneal enjeksiyon yoluyla bakteriyel sistemik enfeksiyonun basit ve tekrarlanabilir fare modeli açıklar.
Giriş
Pseudomonas aeruginosa insanlarda hayatı tehdit eden hastalıklara neden olabilir fırsatçı bir bakteriyel patojen, özellikle immunocompromised. P. aeruginosa patojenite proteazlar ve lipopolisakkarit de dahil olmak üzere birçok virülans faktörlerin ifade kaynaklanmaktadır, yanı sıra koruyucu bir biyofilm oluşturmak için yeteneği1. Virülans faktörleri üretme ve insanlarda hastalığa neden olma becerisi nedeniyle, P. aeruginosa'yı ticari ürünler yapmak için kullanmak güvenlik kaygılarını da ortaya çıkarmaktadır. E. coli nonpatojenik suşları geleneksel olarak insan kullanımı için tıbbi ve ticari ürünlerin biyomühe....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Hayvan deneyleri başlamadan önce kullanılacak protokol Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmalıdır. Açıklanan protokolün onayı Marshall Üniversitesi'ndeki (Huntington, WV, ABD) IACUC aracılığıyla alındı.
1. Plazmid Tasarımı
- pEX100T-NotI plazmidkullanarak genetik bir silme oluşturmak için, istenilen silme sırasını çevreleyen DNA bölgelerini klonlamak ve plazmidin NotI kısıtlama bölgesine yerleştirin. Plazmid kesici uç, hedef silme dizisinin yaklaşık 500 nükleotitine doğrudan bitişik olan hedef dizinin yukarısında yaklaşık 500 nükleotit içermelidir. Ayrıca, kesici uç, 5' ve 3' uçlarında NotI tanıma d....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Şekil 2'degösterildiği gibi, hedeflenen genomik silme, ilgi bölgesini güçlendiren özel astarlarla koloni PCR kullanılarak doğrulanabilir. Genomik silme taşıyan koloniler, yabani tip kolonilere kıyasla daha kısa bir PCR bant boyutu sağlayacaktır. 10-12 koloniden oluşan bir PCR ekranı genellikle hedeflenen silme yitirmesini taşıyan en az bir koloniyi tespit etmek için yeterlidir. Birden fazla ekran turundan sonra silme işlemi algılanmazsa, çekimle başlayan yord.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
pEX100T-Not1 plazmid, marker içermeyen ve çerçeve içi ardışık genomik silmelerin etkili bir aracısi. Bakteri suşları zayıflatılmış virülans için mühendislik zaman, nokta mutasyonları üreten yerine tüm gen dizilerinin silinmesi öldürücü bir fenotip reversiyon olasılığını azaltır. Ayrıca, her patojengen delemesi patojeni daha da zayıflatarak zayıflama nın stabilitesini güçlendirir.
Bu yöntem aynı zamanda sadece plazmid kesici uç tasarımıdeğiştirerek, nokta mutasyonları ve eklemeler gibi deletion.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazar Hongwei D. Yu Baş Bilim Görevlisi ve Progenesis Technologies, LLC kurucularından biridir.
Teşekkürler
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) tarafından desteklenmiştir R44GM113545 ve P20GM103434 hibe.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Düz kapaklı 0,2 mL tüpler | ThermoScientific | AB-0620 | Fisher Scientific |
| 1 mL Şırınga | BD | 22-253-260 | Fisher Scientific |
| 1,5 mL tek kullanımlık polistiren küvet | Fisher Scientific | 14955127 | |
| 1,5 mL Mikrosantrifüj Tüpleri | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 2,0 mL Kriyojenik | Şişeler Corning | 430659 | Fisher Scientific |
| 27G iğne | BD | 14-821-13B | ile Fisher Scientific |
| 50 mL tüpler | Fisher Scientific | 05-539-13 | Fisher Scientific Accublock aracılığıyla |
| Dijital Kuru Banyo | Labnet | NC0205808 | Fisher Scientific Tezgah |
| Üstü Santrifüj 5804R | Eppendorf | 04-987-372 | aracılığıyla |
| Tezgah Üstü Mikrosantrifüj | Sorvall | 75-003-287 | Fisher Scientific |
| Kabin İnkübatörü | VWR | 1540 | |
| Karbenisilin disodyum tuzu | Fisher Scientific | BP2648250 | |
| Kültürü Test Tüpü, Polistiren | Fisher Scientific | 14-956-6D | Fisher Scientific aracılığıyla Tek |
| Kullanımlık Aşılama Döngüleri | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
| Dneasy UltraClean Mikrobiyal Kiti (50) | Qiagen | 12224-50 | veya tercih edilen yöntem/satıcı |
| E.Z.N.A. Cycle Pure Kit (50) | Omega bio-tek | D6493-01 | veya tercih edilen yöntem/satıcı |
| EcoRI-HF, kısıtlama endonükleaz | New England BioLabs | R3101L | |
| Elektroporasyon Küvetleri | Bulldog Bio | NC0492929 | Fisher aracılığıyla Scientific |
| FastLink II DNA Ligasyon Kiti | Epicentre Technologies | LK6201H | Fisher Scientific |
| Gentamisin Sülfat | Fisher Scientific | BP918-1 | |
| Gliserol | Fisher Scientific | BP229-4 | |
| GoTaq G2 Renksiz Master Mix | Promega | M7833 | Fisher Scientific |
| Isothesia Isofluran | Henry Schein aracılığıyla Hayvan Sağlığı | 29405 | |
| IVIS Lumina XRMS Serisi III In Vivo Görüntüleme Sistemi | Perkins ve Elmer | CLS136340 | |
| Kanamisin monosülfat | Fisher Scientific | BP906-5 | |
| LE agaroz | Genemate | 3120-500 | Fisher Scientific |
| Luria Et Suyu | Difco | 240230 | Fisher Scientific |
| MicroPulser aracılığıyla Elektroporatör | BioRad | 1652100 | |
| Noble agar, Fisher | Scientific NotI-HF aracılığıyla ultra saf Affymetris/USB | AAJ10907A1 | |
| , kısıtlama endonükleaz | New England BioLabs | R3189 | |
| One Shot TOP10 Electrocomp E. coli | Fisher | Scientific | |
| Fosfat tamponlu tuzlu su tozu | aracılığıyla C404052Sigma | P3813-10PAK | Sigma-Aldrich |
| Prizma 7 | GraphPad | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ | |
| >Pseudomonas izolasyon agar | Difco | 292710 | Fisher Scientific |
| Pseudomonas izolasyonu aracılığıyla et suyu | Alpha Biosciences | P16-115 | Özel yapım toplu |
| QIAprep Spin Miniprep Kiti (250) | Qiagen | 27106 | veya tercih edilen yöntem/satıcı |
| Çalkalama İnkübatörü | New Brunswick Scientific | Innova 4080 | 200 rpm'de sallama |
| SimpliAmp Termal Döngüleyici | Uygulamalı Biyosistemler | A24811 | |
| Yağsız Süt | Difco | DF0032-17-3 | aracılığıyla Fisher Scientific |
| Küçük Plakalar (100 OD x 10 mm) | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| SmartSpec Plus Spektrofotometre | Bio-Rad | 170-2525 | veya tercih edilen yöntem/satıcı |
| Sucrose | Fisher | Scientific S5-500 | |
| Kürdan, yuvarlak | Elmas | Her marka kürdan, otoklavlanmış | |
| TOPO TA Klonlama Kiti, sıralama için | Invitrogen | 45-0030 | |
| XAF-8 Anestezi Sistemi Filtreleri | Perkins ve Elmer | 118999 | |
| XGI 8 Gaz Anestezi Sistemi | Kaliper Yaşam Bilimleri/Xenogen |
Kaynaklar
- Gellatly, S. L., Hancock, R. E. Pseudomonas aeruginosa: new insights into pathogenesis and host defenses. Pathogens and Disease. 67 (3), 159-173 (2013).
- Valentine, M. E., et al. Generation of a highly attenuate....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
