Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Pseudomonas aeruginosa In-Frame Gen Silme Mutantlar Üretimi ve Enfeksiyon Basit Bir Fare Modelinde Virülans Zayıflama sıiçin Test

6.4K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/60297

⸱

8 Ocak 2020

 ,  , 
1Progenesis Technologies, LLC, 2Department of Biomedical Sciences, Pediatrics, Joan C. Edwards School of Medicine at Marshall University

Bu makalede

Özet

Burada, abd gıda ve ilaç İdaresi (FDA) onaylı Escherichia coli ticari uygulamalar için karşılaştırıldığında Pseudomonas aeruginosa genetik olarak değiştirilmiş suşlarının zayıflamasını değerlendirmek için enfeksiyon fare modelibasit ve tekrarlanabilir bir protokol açıklar.

Özet

Mikroorganizmalar genetik olarak çok yönlü ve çeşitlidir ve birçok ticari ürün ve biyofarmasötik kaynağı haline gelmiştir. Bu ürünlerin bazıları doğal olarak organizmalar tarafından üretilse de, diğer ürünler üretim verimini artırmak için organizmanın genetik mühendisliğine ihtiyaç duyarlar. Escherichia coli Avirulent suşları geleneksel biyofarmasötik üretmek için tercih edilen bakteri türleri olmuştur; ancak, bazı ürünlerin E. coli için üretmesi zordur. Böylece, diğer bakteri türlerinin avirulent suşları bazı ticari ürünlerin üretimi için yararlı alternatifler sağlayabilir. Pseudomonas aeruginosa, E. coli'yeuygun bir alternatif sunabilecek yaygın ve iyi çalışılmış bir Gram-negatif bakteridir. Ancak, P. aeruginosa fırsatçı bir insan patojenidir. Burada, pEX100T-NotI plazmid kullanarak sıralı genomik deletiyonlar yoluyla P. aeruginosa nonpatojenik suşları oluşturmak için kullanılabilecek bir prosedür ayrıntılı. Bu yöntemin en büyük avantajı işaretsiz bir gerinim üretmektir. Bu yöntem, ticari ürünlerin üretimi için yüksek zayıflatılmış P. aeruginosa suşları oluşturmak veya diğer özel kullanımlar için suşları tasarlamak için kullanılabilir. Biz de E. coliFDA onaylı BL21 suşu ile karşılaştırıldığında genetiği değiştirilmiş suşu zayıflatma test etmek için doğrulanmış test suşlarının intraperitoneal enjeksiyon yoluyla bakteriyel sistemik enfeksiyonun basit ve tekrarlanabilir fare modeli açıklar.

Giriş

Pseudomonas aeruginosa insanlarda hayatı tehdit eden hastalıklara neden olabilir fırsatçı bir bakteriyel patojen, özellikle immunocompromised. P. aeruginosa patojenite proteazlar ve lipopolisakkarit de dahil olmak üzere birçok virülans faktörlerin ifade kaynaklanmaktadır, yanı sıra koruyucu bir biyofilm oluşturmak için yeteneği1. Virülans faktörleri üretme ve insanlarda hastalığa neden olma becerisi nedeniyle, P. aeruginosa'yı ticari ürünler yapmak için kullanmak güvenlik kaygılarını da ortaya çıkarmaktadır. E. coli nonpatojenik suşları geleneksel olarak insan kullanımı için tıbbi ve ticari ürünlerin biyomühendisliğinde kullanılmaktadır. Ancak, bazı ürünler E. coli yapmak zordur, ve birçok ekleme organları paketlenmiş, çıkarma zahmetli hale. Salgıverim büyük olasılıkla verimi artırmak ve arıtma süreçlerini kolaylaştırmak gibi, belirli ürünler yapmak ve salgılamak yeteneği ile tasarlanmış bakteriyel suşları, son derece arzu edilir. Böylece, diğer bakteri türlerinin patojenik olmayan suşları (örneğin, daha fazla salgı yolları kullanan türler) E. coli'yeyararlı alternatifler sağlayabilir. Biz son zamanlarda P. aeruginosabir suşu gelişimi rapor , PGN5, hangi organizmanın patojenitesi ve toksisitesi yüksek zayıflatılmış2. Daha da önemlisi, bu tür hala polisakkarit aljinat büyük miktarlarda üretir, P. aeruginosa biyofilm ticari olarak ilginç bir bileşeni.

PGN5 suşu, organizmanın patojenitesine katkıda bulunduğu bilinen beş geni(toxA, plcH, phzM, wapR, aroA)sırayla silmek için pEX100T-NotI plazmid ile iki aşamalı bir allelik değişim prosedürü kullanılarak oluşturuldu. pEX100T-NotI Plazmid pEX100T, Herbert Schweizer's labgeliştirilenbirden fazla klonlama sitesi içinde bir NotI restriksiyon enzim tanıma sitesi SmaI değiştirerek oluşturuldu3 ,4. Restriksiyon enzimi NotI için tanıma sitesi SmaI ile karşılaştırıldığında daha nadir bir DNA dizisidir ve klonlanan dizilerde bulunma olasılığı daha düşüktür, bu nedenle klonlama amacıyla daha uygundur. Plazmid, ß-laktamaz kodlayan ve karbenisin direncini ortaya koyan bla geni ve sakaroza duyarlılık sağlayan B. subtilissacB geni de dahil olmak üzere seçime olanak sağlayan genleri taşır (Şekil 1A). Plazmid aynı zamanda E. coliile uyumlu çoğaltma(ori)ve konjugasyon yoluyla E. coli'den Pseudomonas türlerine plazmid transferine izin veren transferin(oriT)kökenini de taşır. Ancak, plazmid Pseudomonasile uyumlu çoğaltma bir kökeni yoksun , ve böylece Pseudomonas türleri içinde çoğaltmak olamaz (yani, bir Pseudomonas intihar vektörü). Bu özellikler pEX100T-NotI'yi Pseudomonas kromozomundaki genetik silmeleri hedeflemek için ideal kılmıştır. Plazmid klonlama adımları E. coli kullanılarak gerçekleştirilir ve ortaya çıkan plazmid dönüşüm veya konjugasyon ile Pseudomonas aktarılır. Daha sonra, homolog rekombinasyon olayları ve seçici adımlar sayesinde, hedeflenen çerçeve içi silme, işaretleyicisiz oluşturulur. P. aeruginosa kromozomundan genomik bölgeleri sırayla silebilmek için bu yöntem PGN5 gibi yüksek oranda zayıflatılmış Pseudomonas suşları oluşturmak veya diğer özel kullanımlar için suşları tasarlamak için kullanılabilir (örn. plazmid yayılımı için enforükleazlarda eksik suşlar veya ilgi proteinlerinin üretimi için protelazlarda eksik suşlar).

Bakteri suşlarının genel virülansı büyüme koşulları ve evrelerinden etkilenir ve bu süre zarfında mutasyonlar sık görülür. Bu nedenle, genetiği değiştirilmiş suşların güvenliğini ölçmek zor olabilir. Sistemik virülans için bakteriyel izole değerlendirmek için, C57BL/6 fareler5intraperitoneal enjeksiyon u tarafından daha önce yayınlanmış bir enfeksiyon protokolü uyarlanmış. Bu prosedürü, kullanılan suşların hassas dosupve kolay doğrulanmasına olanak sağlayan enjeksiyon için dondurulmuş bakteri stokları kullanmak üzere modifiye ettik. Bu modelde, Biyofarmasötik üretimi için FDA onaylı olan E. coli suşu BL21, suş göreceli patogenezi belirlemek için bir kontrol güvenlik standardı olarak kullanılmıştır6,7,8. Bu yöntemi kullanmanın en büyük avantajı, enfeksiyon öncesi ve sonrası bakteri hücre numarası, fenotip ve genetik belirteçler için doğrulanmış olan bulaşma suşları, tekrarlanabilir olması ve varyasyon kaynaklarını en aza indirmesidir. Bu kontrollü adımlarla gerekli hayvan sayısı azalır. Bu modelde, enjekte edilen intraperitoneally e. coli BL21'e eşit veya daha az C57BL/6 murine mortalite oranlarına neden olan P. aeruginosa suşları zayıflatılmış kabul edilebilir. Bu basit fare enfeksiyonu modeli, referans olarak FDA onaylı E. coli suşunu kullanarak diğer türlerden genetik olarak tasarlanmış suşların zayıflatılmış patojenliğini değerlendirmek için de kullanılabilir. 1-7. adımlar P. aeruginosa (Şekil 1)ve 8-12 adımlarında sıralı genomik silmelerin oluşumunu ayrıntılı olarak inceleyin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Hayvan deneyleri başlamadan önce kullanılacak protokol Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmalıdır. Açıklanan protokolün onayı Marshall Üniversitesi'ndeki (Huntington, WV, ABD) IACUC aracılığıyla alındı.

1. Plazmid Tasarımı

  1. pEX100T-NotI plazmidkullanarak genetik bir silme oluşturmak için, istenilen silme sırasını çevreleyen DNA bölgelerini klonlamak ve plazmidin NotI kısıtlama bölgesine yerleştirin. Plazmid kesici uç, hedef silme dizisinin yaklaşık 500 nükleotitine doğrudan bitişik olan hedef dizinin yukarısında yaklaşık 500 nükleotit içermelidir. Ayrıca, kesici uç, 5' ve 3' uçlarında NotI tanıma dizisini (GCGGCCGC) içermelidir(Şekil 1B).

2. Plazmid Hazırlama

  1. Seçenek 1: Geleneksel klonlama yordamlarından yararlanın. Genomik bölgeleri ilgi geninin yukarı ve aşağı akışını yükseltmek için PCR'yi kullanın, ardından crossover PCR9,10 oluşturulan parçalara katılmak için, PCR ürün ve plazmidin insülinin endokleaz sindirimi ve ligasyon11 (Şekil 1B,C).
  2. Seçenek 2: Silme sırasını silico'da tasarladıktan sonra, plazmid pEX100T-NotI'ye eklemek için de novo sentezleyen bir şirketle sözleşme sözleşmesi. Birçok şirket hızlı ve verimli bir şekilde ilgi plazmid oluşturmak için klonlama sürecini kolaylaştıran var. Ayrıca, sekans plazmidlerin doğumdan önce mutasyonsuz olduğunu doğrulayın.

3. E. coli Dönüşümü

  1. Elektrobeceriksiz E. coli'yi plazmid ile üreticinin tavsiyelerine göre dönüştürün. Steril bir aşılama döngüsü kullanarak, izole koloniler için dönüşüm reaksiyonunun 10 μL'lik bir kısmı önceden ısıtılmış Luria Broth (LB) agar plakası üzerine 100 μg/mL karbenicillin ve inkübat ile bir gecede 37 °C'de tamamlanır.
    NOT: Kültür bakterileri için kullanılan tüm ekipman ve ortamlar kurumun güvenlik kurallarına uygun olarak tedavi edilmelidir.
  2. Geçit iki kez.
    1. Tabağı kuvözden çıkarın ve izole edilmiş bir koloniyi tanımlayın. Steril bir aşılama döngüsü kullanarak, koloniyi alın ve izole koloniler için 100 μg/mL karbenicillin ile takviye edilmiş önceden ısıtılmış lb agar plakası alın. Bir gecede 37 °C'de kuluçkaya yatırın. Saf bir kültür oluşturmak için bu adımı bir kez daha tekrarlayın.
  3. Steril aşılama döngüsü kullanarak, son agar plakasından tek bir koloni ile 5 mL LB aşılayın. Bir gecede 37 °C'de bir sallayarak kuvözde kültür yerleştirin. Ertesi gün, bu kültürün 1 mL'sini 1 mL ile %5 oranında cryovial'da karıştırın ve -80 °C'de saklayın ve dondurulmuş bir suşu oluşturun.

4. Bakteriyel Suş Hazırlama ve Triparental Konjugasyon

  1. Et suyu kültürlerini aşılamak ve bir gecede 37 °C'de sallanan bir kuluçka makinesine yerleştirmek için aşağıdaki suşlardan oluşan agar plakalarından izole edilmiş tek bir koloni kullanın.
    1. E. coli pEX100T-NotI'yi 5 mL LB'ye ekleyin ve 100 g/mL karbenicillin ekleyin.
    2. Psödomonas İzolasyon Suyu (PIB) 5 mL içine P. aeruginosa zorlanma PAO1 ekleyin.
    3. E. coli prk2013'ü 5 mL LB'ye ekleyin ve 50 g/mL kanamisin ekleyin.
      NOT: Prk2013 plazmid E. coli değil, P. aeruginosaçoğalır bir yardımcı plazmid olduğunu ; E. coli donörden P. aeruginosa alıcısına pEX100T-NotI plazmidi harekete geçirmek trans-etkili transfer genleri taşır12. P. aeruginosa bir Biyogüvenlik Düzeyi 2 (BSL-2) patojendir. BSL-2 organizmalarile çalışırken lütfen kurumun güvenlik yönergelerine uyun.
  2. Ertesi gün, bir gece kültürlerini kuvözden çıkarın ve her kültürden 0,5 mL'lik bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe ekleyin. 5 dk. 6.000 x g santrifüj.
  3. Pipet önceden ısıtılmış LB agar plaka üzerine bir damlacık tüm hücre süspansiyon. Damlacık kurumasını bekleyin. Daha sonra plakayı ters çevirin ve 37 °C'de 4-6 saat kuluçkaya yatırın.
  4. Kuluçkadan sonra, hücreleri mikrosantrifüj tüpünde 1 mL LB'ye toplamak için steril bir aşılama döngüsü kullanın. Pipet yukarı ve aşağı hücreleri karıştırmak için.
  5. Bir hücre dağıtıcısı kullanarak, seri hücreleri eşit bir kuru önceden ısıtılmış Pseudomonas İzolasyon Agar üzerine (PIA) plaka carbenicillin 300 μg/mL ile desteklenmektedir. Hücre karışımının artan hacimleri (örn. 10 μL, 100 μL, 500 μL) birden fazla plaka çizgi. Bir gecede 37 °C'de kuluçkaya yatırın.

5. P. aeruginosa Tek crossover Rekombinantların Tespiti

  1. Kuvözden plakaları çıkarın ve izole karbenicillin dirençli koloniler için kontrol edin. PEX100T-NotI plazmid P. aeruginosaçoğalamaz çünkü , karbenicillin takviyeli plakalar üzerinde büyüdü koloniler plazmid kromozom entegre olduğu hücrelerden ortaya çıkmıştır.
    1. Bu kolonilerden en az 4'ü seçin ve 300 μg/mL carbenicillin ile takviye edilmiş önceden ısıtılmış PIA plakalarına izolasyon için çizgi seçin. 37 °C'de bir gecede kuluçka plakaları.
  2. Kuvözdeki plakaları çıkarın ve büyümeyi kontrol edin. Karbenicillin dirençli koloniler tek crossover rekombinantlar olmalıdır (yani, plazmid insert homolog bir bölge ve P. aeruginosakromozomu arasında bir rekombinasyon olayı ile kromozom içine plazmid dahil var).
    1. Önceden ısıtılmış plakalar üzerine steril kürdan ile Patch 8 veya daha fazla koloniler: 1) PIA 300 μg/mL carbenicillin ve 2) PIA ile takviye 300 μg/mL karbenisin ve% 10 sakaroz (gliserol olmadan).
    2. Adım 5.1'den koloni büyümesi elde edilememişse, çekimi tekrarlayın ve 4.5 adımda oluşan hücre karışımının hacmini artırın. Çok fazla büyüme meydana geldiyse, çekimi tekrarlayın ve çizgili hacmi azaltın.
    3. Konjugasyon tekrar tekrar başarısız olursa, P. aeruginosa zorlanma elektroyetkili hücreleri hazırlamak ve doğrudan pEX100T-NotI plazmid ile dönüştürmek. Elektrobeceriksiz P. aeruginosa ve dönüşüm hazırlanması için ayrıntılı protokoller başka bir yerde mevcuttur13,14.
  3. Bir gecede 37 °C'de kuluçka plakaları.
  4. Kuvözdeki plakaları çıkarın ve büyümeyi kontrol edin. Gerçek tek crossover rekombinantlar karbenicillin dirençli ve sakaroz duyarlı olacak (yani, PIA karbenicillin ile desteklenen büyüdü koloniler, ama carbenicillin ve sakaroz ile desteklenen PIA büyümedi).
    1. 4 veya daha fazla gerçek tek crossover rekombinantseçin ve seçim olmadan LB 5 mL içine her aşılamak. Bir gecede 37 °C'de bir titreyen kuluçka makinesinde kuluçkaya yatırın.
    2. Tek crossover rekombinantları algılanmadıysa, çekimi tekrarlayın.

6. P. aeruginosa Double-crossover Rekombinantların Tespiti

  1. Her et suyu kültürü için, pia bir önceden ısıtılmış plaka üzerine kültür 10 μL aşılamak 10% sakaroz ile takviye (gliserol olmadan) ve izole koloniler için çizgi. 37 °C'de bir gecede kuluçka plakaları.
  2. Ertesi gün, kuvözden plakaları çıkarın ve büyüme için onları kontrol edin. Sakaroza dirençli koloniler çift çapraz rekombinantolmalıdır (yani, plazmid insertin diğer homolog bölgesi ile P. aeruginosa kromozomu arasındaki rekombinasyon olayı ile plazmidi kromozomdan çıkarmış olmalıdır).
    1. Önceden ısıtılmış plakalar üzerine steril kürdan ile En az 20 koloniler Yama: 1) PIA, 2) PIA ile takviye 10% sakaroz (gliserol olmadan), ve 3) PIA ile takviye 300 μg/mL karsinin.
  3. 37 °C'de bir gecede kuluçka plakaları.
  4. Kuvözdeki plakaları çıkarın ve büyüme için inceleyin. Gerçek çift crossover rekombinantlar karbenicillin duyarlı ve sakaroz dirençli olacak (yani, PIA ve PIA sakaroz ile desteklenen koloniler, ama pia karbenicillin ile takviye büyümedi).

7. Koloni PCR ile Gen Silme Onayı

  1. PCR ile silme ekranı için 10-20 koloni hazırlayın.
    1. Steril bir kürdan ile şüpheli bir çift çapraz rekombinant büyüme pick up ve 1x fosfat tamponlu salin (PBS) 50 μL hücreleri askıya. 10 0 dk için 100 °C'de süspansiyonu kaynatın, 3 dk 13.000 x g'dasantrifüj koyun ve buza yerleştirin.
  2. Hedeflenen silme için kolonileri ekrana PCR gerçekleştirin.
    1. İlgi geninin silinmesini onaylamak için 25 μL PCR reaksiyonunda şablon olarak 1 μL'lik süpernatant kullanın.
    2. Genomik silme bölgesini güçlendiren gen özel astarlar kullanın. Genomik silme bölgesini artı 100-200 bp yukarı ve aşağı akım dizilerinin yan bölgesini güçlendiren astarlar kullanın.
    3. Üst zorlanma (örneğin, PAO1) ile ayrı bir kontrol PCR reaksiyonu hazırlayın.
      NOT: Termocycler koşulları astar çiftleri için en uygun tavlama sıcaklığına, kullanılan polimeraz kokteyline ve yükseltilecek bölgenin uzunluğuna bağlı olarak değişir.
  3. PCR ürünlerinde agarose jel elektroforezi gerçekleştirin. İlgi alanının silindiği koloniler, silinme den yoksun kolonilere göre daha küçük amplifikasyon ürünleri verir (Şekil 2).
  4. PCR onaylı silme ile bir veya daha fazla koloni seçin. İzole koloniler için önceden ısıtılmış PIA plaka(lar) üzerine çizgi ve bir gecede 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
  5. En azından bir kez daha geçit. Kuvözden plaka(lar) çıkarın ve izole edilmiş bir koloniyi tanımlayın. Steril bir aşılama döngüsü kullanarak, koloniyi alın ve izole koloniler için önceden ısıtılmış PIA agar plakası çizgi. Bir gecede 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
  6. Her son plakadan bir koloni seçin ve 5 mL PIB aşılamak için kullanın. Bir gecede 37 °C'de sallayarak bir kuluçka makinesine yerleştirin.
    1. Bu kültürün 1 mL'sini 1 mL'lik yağsız sütü bir cryovial'da karıştırın ve -80 °C'de saklayın ve süzme stoku oluşturun.
    2. Bu kültürü kullanarak, zorlanmadan genomik DNA hazırlamak (örneğin, bir DNA arıtma kiti kullanarak). PcR ve ilgi bölgesine özgü astarlar kullanarak genomik silme bölgesini güçlendirin.
      1. Bu PCR ürünlerini (örneğin, DNA arıtma kiti veya fenol-kloroform ekstraksiyonu yla) arındırın ve ya doğrudan genlere özgü astarlarla sıralanabilir veya plazorta özgü astarlarla sıralamak için bir vektöre bağlanın.
  7. Gen deleksiyonu sıralama yoluyla onaylandıktan sonra, bu işlemi yeni silme gerilimi ile tekrarlayarak çok sayıda marker içermeyen genomik silme işlemini sırayla oluşturun. İstenilen zorlanma oluşturulduğunda, hedeflenen silmeleri doğrulamak ve süreç boyunca meydana gelen genomdaki diğer değişiklikleri (örneğin PAO1 gibi referans zorlanmayla karşılaştırıldığında) tespit etmek için tüm genom dizisini kullanın. Genlere açıklama yaptıktan sonra sırayı GenBank'a yatırın ve katılım numaralarını kaydedin.

8. Hayvan Testleri için Bakteriyel Zorlanma Hazırlanması

  1. P. aeruginosa suşlarının zayıflatılmış patojenitesini test etmek için, öncelikle doğrulanmış kültürleri ve stokları hazırlayın. P. aeruginosa suşlarını, p. aeruginosa (öldürücü) ve FDA onaylı E. coli (örneğin, BL21) türünü patojenik olmayan bir güvenlik kontrolü olarak hizmet vermeye hazırlayın.
  2. Sıralı ve doğrulanmış dondurulmuş stoklardan seçici agar üzerine test edilen bakterilerin suşları çizgi. Bir gecede 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
  3. Steril bir aşılama döngüsü ile, her bir gerginlik tek bir koloni almak ve izole koloniler için çizgi tekrar seçici medya üzerine. Bir gecede 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
  4. Kuvözdeki plakaları çıkarın. Her zorlanma için, LB plakaları üzerine izolasyon için tek bir koloni ve çizgi seçin.
  5. 37 °C'de 24 saat büyümeden sonra, 250 mL LB içeren 500 mL'lik bir şişeyi her bir suştan izole edecek tek bir koloni ile inoküle edin.
    1. Doğrulama adımı: aynı koloninin kalıntılarını kullanarak, suşta yapılan genetik değişikliklerin varlığını doğrulamak için PCR ve suşa özgü astarlar ve/veya astarlar kullanarak suş doğrulayın. Sunulan örnekte suşların doğrulanması için aşağıdaki astarları kullanın:
      E. coli BL21:
      T7 polimeraz F:TGGCTATCGCTAATGGTCTTACG
      T7 polimeraz R:TTACGCGAACGCGAAGTCC

      VE2 ve PGN5:
      aroA F: GCGAACGCCAACAGCCGATAAAGC
      aroA R: ATCTGGCTCGCGATGCCGGTCC
  6. Kültürleri 160 rpm ve 37 °C'de, log faz ı büyümeye ulaşana kadar (yani, od600 spektrofotometrede 0,4-0,6 ölçümü) titreterek kuluçkaya yatırın.
  7. Günlük fazı elde edildiğinde elde edilen OD600 değerini kullanarak, mL başına 2,5 x 109 koloni şekillendirme birimi (CFU) verim için gereken et suyu hacmini hesaplayın. Pelet 10 dk için 4.500 x g 50 mL tüpler hesaplanan et suyu hacmi.
  8. Supernatant atın ve hücreleri yıkamak için 1x PBS 50 mL kullanarak bir tüp içinde pelet resuspend. Santrifüj tekrar 4.500 x g 10 dk için.
  9. Supernatant atın ve 1x PBS% 5 yağsız süt 25 mL pelet resuspend.
    1. Doğrulama adımı: CFU/mL sayısını belirlemek için uygun plaka sayımlarını gerçekleştirmek için 25 mL resuspension örneğini kullanın.
  10. Aliquot 2 mL skim süt kültürü 2 mL cryovials 2 mL kültür stokları içine resuspension. Sıvı nitrojende flaş donma ve kullanmadan önce en az bir gecede -80 °C'de saklayın.

9. Hayvan Testleri için Depolanan Stokların Büyüme ve Geriniminin Doğrulanması.

  1. Her bir suş için - 80 °C depolama dan dondurulmuş stokların en az 3 cryovials çıkarın ve 2-4 saat için 4 °C'de çözülme. Herhangi bir dondurulmuş stok kalırsa, 37 °C'de kısa bir süre sıcak.
  2. Her zorlanma doğrulamak için her cryovial küçük örnekler alın.
    1. CFU/mL sayısını belirlemek için uygun plaka sayımları gerçekleştirin. Bazı bakteri hücrelerinin ölümü nedeniyle donma sonrası daha az CFU/mL olması normaldir.
    2. Her bir zorlanmayı doğrulamak için PCR ve gerginliğe özel astarları kullanın.
    3. Fenotipdoğrulamak için seçici ortam üzerine her zorlanma çizgi.
  3. Suşların doğru genotip ve fenotip olduğunu doğruladıktan ve CFU/mL'yi doğruladıktan sonra hayvan testlerine devam edin.

10. Enjeksiyon ile Bakteriyel Suşları ile Hayvanların Aşılanması

  1. Enjeksiyonların sabahında, test edilen bakteri suşlarının cryovials'ını çıkarın ve enjekte edilecek her fare için 3-4 saat çözülme 0,5 mL için 4 °C'de çözülün. Eritme den sonra buz üzerinde şişeleri tutun ve 2 saat içinde fareler enjekte.
  2. Eritildikten sonra, her cryovial'ı 10 dk için 4.500 x g'de yeni bir 2 mL tüpe ve santrifüje aktarın, supernatant'ı atın ve hücre peletini 1 mL 1x PBS'de yeniden askıya alın.
  3. 10 m için 4.500 x g tekrar santrifüj. 1x PBS'de 2.5 x 109 CFU/mL'ye kadar ekineksit ve resuspend pelet. Yeniden askıya alma için gereken 1x PBS miktarını belirlemek için, 2.2.1 adımda dondurulmuş stoklarda geçerli plaka sayılarından elde edilen CFU/mL verilerini kullanın. Kullanılan 1x PBS tam miktarı suşları arasında biraz değişecektir.
    1. Yukarıda açıklandığı gibi CFU/mL, genotip ve fenotipi doğrulamak için her suşson süspansiyon 3 örnek alın.
  4. Her zorlanma için, 1,5 mL PBS/hücre süspansiyonu, tüpün girişme sayısını sınırlamak için 5 fare başına bir 2 mL tüpiçine yerleştirin. Ayrıca, kontrol enjeksiyonları için 1x PBS tüpleri hazırlayın.
  5. Fareleri (bu deney için grup başına 10 erkek ve 10 dişi C57BL/6) ve enjeksiyonlar için gerekli malzemeleri (şırıngalar, iğneler, keskinlik kapları, belirteçler, kalem ve kağıt,vb.) toplayın. Steril hayvan cerrahi odasına geçin. Dezenfekte mendilile tüm yüzeyleri silin.
    1. Deneycinin sıkıntı ve yaralanma riskini ortadan kaldırmak için, bir seferde cerrahi odaya sadece bir cinsiyet ve deneysel fare grubu getirin (örn. belirli bir türe bulaştığında 10 erkek fareden oluşan bir grup). Isırılırsa eldiven delinme ortadan kaldırmak için lateks eldiven iki çift giyin. Kontaminasyonu önlemek için laboratuvar önlüğü, güvenlik gözlükleri ve yüz maskesi takın.
  6. Kontrol grubunun enjeksiyonlarına 1x PBS ile başlayın. Bu herhangi bir yan etkiler injekse enjeksiyon sonucu olup olmadığını tespit edecektir.
    1. Kafesten bir fare çıkarın. Aynı anda yalnızca bir fareyi kaldırın.
    2. Faretartın ve kilo kaybı sonrası enjeksiyon için izlemek için kalıcı marker ile kuyruğunu işaretleyin.
    3. Yeni bir 1 mL şırınga ve 27 G iğne açın (kontaminasyonu ortadan kaldırmak için her fare için yeni bir şırınga ve iğne kullanın) ve 200 μL steril 1x PBS enjekte edin.
      1. Başparmak ve işaret parmağını kullanarak fareyi kulaklarının arkasından yakalayın. Tutunmak için boyun ense cilt kıvrım oluşturmak için Çimdik - sıkı bir kat boyun hareketi ve enjeksiyon sırasında ısırılmış olma riskini azaltır. Az hareket ile fare düz tutmak için serçe parmağı kullanarak avuç içine güvenli kuyruk.
      2. Fareyi ters çevirin ve iğneyi 30° açıyla orta çizginin sol veya sağ tarafına, periton boşluğuna yerleştirin. İğneyi organlara değil, intraperitoneal bölgeye yerleştirildiğinden emin olmak için bir kez hafifçe kaldırın. PBS'yi yavaşça enjekte edin ve iğneyi geri çekin.
      3. Kullanılan iğneyi belirlenmiş bir biyolojik tehlike keskinliği kabına yerleştirin. Şırıngayı veya iğneyi tekrar kullanmayın. Enjeksiyon yerinde bir bolus tipiktir.
    4. Enjeksiyondan sonra fareyi ayrı bir kafese taşıyın.
    5. İşlemi bir sonraki fareyle tekrarlayın. Bir kafesin tüm fareleri enjekte edildikten sonra, hemen orijinal kafeslerine geri dönün.
  7. Kontrol grubuna enjekte edildikten sonra, aynı prosedürden sonra test edilecek suşların süspansiyonlarını enjekte etmeye başlayın.
    1. Hücre süspansiyonunun 200 μL'sini enjekte edin. 2,5 x 109 CFU/mL hücre süspansiyonları ile başlarken, her fare 5 x 108 CFU alır.
      NOT: Bu konsantrasyonlar, her bir suş ölümcül dozbelirlemek için ön hayvan araştırma ile optimize edildi. Dosing diğer suşları / türler için ayarlanması gerekebilir.
  8. Tüm enjeksiyonlar tamamlandıktan sonra, sıkıntıyı hafifletmek için fareleri barınma odasına geri getirin. Dezenfekte mendilleri ile temiz çalışma alanı.
  9. Ölü fareler için kafesleri 72 saat ve 10 gün boyunca her 12 saat kontrol ederek enjeksiyon dan sonra mortalite için hayvanları izlemek. Hastalık nedeniyle kilo kaybı belirlemek için farelerin ağırlığı her 12 saat kaydedin.
  10. Duruş farkı, bakım veya oyuk eksikliği, hareketsizlik veya solunum değişiklikleri gibi enjeksiyonu takip eden saatlerde olumsuz davranışlar kaydedin. Enjeksiyonla ilişkili yaralanmadan ölen fareler olumsuz davranışlar sergiler ve enjeksiyondan sonra hızlı bir şekilde ölürler. Öte yandan, enfeksiyondan ölen fareler 18 saat sonrasına kadar olumsuz davranış veya ölüm sergilemeye başlamaz. Hızlı veya zahmetli solunum, hareketsizlik, kambur duruş, batık gözler, şiddetli dehidratasyon veya diğerleri gibi olumsuz davranışlar veya yaygın morbidite belirtileri gösteren fareler gereksiz acıyı azaltmak için ötenazi yapılmalıdır ( onaylı IACUC protokolleri). Ancak, deneylerimizde, deney sırasında herhangi bir fare için ötenazi gerekli değildi. Hayatta kalan fareler testin tamamlanmasından 10 gün sonra ötenaziye alındı.
  11. 10 günlük izleme süresinin ardından, kalan hayvanların tamamen iyileşmesini ve test sırasında uygulanan herhangi bir enfeksiyondan kurtulmalarına izin verin. IACUC prosedürü ne göre ötenazi hayvanlar.

11. Hayvan Ölümlerinin İstatistiksel Analizi

  1. Grafik yazılımlarını kullanarak istatistiksel analiz yapın. Grafik üretebilen ve istatistiksel analiz yapabilen her türlü yazılım uygundur.
  2. Mortalite verilerini çizmek için, test edilen grupları temsil etmek için zaman (h) ve Y sütunu temsil etmek için X sütununa kullanın.
  3. Çalışmada, hayatta kalma veya ölümü gösteren = 0 (sıfır) veya kod = 1 kullanarak her fareyi veya konuyu temsil edin.
    1. Ölen her hayvan için, ölüm sırasında o grubun Y sütununa X sütununa bir tane yerleştirin. Bir grup içinde tek bir zaman noktasında birden fazla ölüm varsa, bu zaman noktasının bir kopyası X sütununa yerleştirilebilir. Örneğin, bir grup içindeki üç denek 3 saat le ölürse, 3 saat lik zaman noktası X sütununda üç kez görünür.
    2. Bir grup içinde hayatta kalan tüm hayvanlar için, ölçülen son zaman noktasında Y sütununa sıfır yerleştirin. Örneğin, dört fare hayatta kalırsa, Y sütununda dört sıfırla işaretlenmiş X sütununa dört bitiş noktası yerleştirin.
  4. Tüm gruplar için hayvan verileri girilen sonra, bir hayatta kalma grafiği oluşturmak için bir hayatta kalma grafiği şablonu kullanın.
    1. Varsayılan kodlamayı 0 ve 1 olarak bırakın.
    2. Grafiğin parametrelerini yüzde olarak ayarlayın.
  5. Hayatta kalma eğrisi için parametreler seçildikten sonra, Mantel-Cox (günlük sıralaması) testini kullanarak istatistiksel analiz yapın.
  6. İstatistiksel verileri kullanarak Kaplan-Meier çizimlerini biçimlendirin.
    NOT: Ebeveyn suşu ndan daha az veya buna eşit olan mortalite oranları gösteren suşlar ve FDA onaylı zorlanma (örneğin, E. coli BL21) zayıflatılmış kabul edilebilir.

12. Biyolüminesans ile Enfeksiyonun Görselleştirilmesi

  1. Enfeksiyonun ilerlemesini görselleştirmek için, PGN5 ve VE2 suşu testiniçine bir kromozombiyolüminesans operon(luxCDABE)yerleştirin. Bu suşları etiketlemek için kullanılan plazmidler ve protokol Schweizer laboratuvarında geliştirilmiştir ve13nolu bakteri türü/türü ile uyumlu olmayabilir. Daha da önemlisi, enfeksiyonun görselleştirilmesi isteğe bağlıdır; bu nedenle, yukarıda açıklanan mortalite çalışmasının yapAbilmesi için bu operonun genomik takılması gerekli değildir.
  2. Yukarıda açıklanan yöntemi kullanarak suşları hazırlayın ve doğrulayın. Ayrıca, her doğrulama adımında etiketli suşlarda biyolüminesans olup olup yok edin.
  3. Suşlar hazırlandıktan sonra, yukarıdaki adımları takip eden biyolüminesans suşları ile 10'lu gruplar halinde hayvanlara enjekte edin.
  4. Biyolüminesans yeteneğine sahip bir hayvan görüntüleme sistemi kullanarak 24 saat için her 3 saat hayvanlar görüntü.
    1. Önce kamera parametrelerini ayarlayarak ve hayvanlar için sahne ısıtma tarafından görüntüleyici hazırlamak. Ayrıca oksijen akışını dakikada 1,5 L olarak ayarlayın (veya üreticinin tavsiyelerine uyarak).
    2. Görüntüleyici ve sahne stabilize edildikten sonra, enjeksiyondan hemen sonra bir fareyi anestezi odasına yerleştirin ve yaklaşık 4 dakika boyunca O2 akışı ile odaya %3,5 izofluran verin. Anestezi yöntemleri kullanılan oda ve/veya anestezik ajana bağlı olarak değişebilir; üreticinin tavsiyelerine uyun. Çekilme refleks testi ile uygun anesteziyi belirleyin.
    3. Fareyi dengelenmiş sıcaklık aşamasına taşıyın. Fareyi kollarını uzatarak sırtına yerleştirin ve görüntüleme işlemi boyunca %2,5 izofluran uygulanması için fareyi bir burun konisi ile oturtun.
    4. Kapıyı kapatın ve biyolüminesans görüntüler ve fare x-ışınları almak.
    5. Görüntüleme tamamlandığında fareyi kafesine geri döndürün ve izleyin. Fare 3-5 dakika içinde bilincini yeniden kazanmalıdır.
    6. Her gruptan farklı bir fare kullanarak, her seferinde 24 saat boyunca her 3 saatte bir fareleri görüntülemeye devam edin. Anesteziye yeniden maruz kalma nın yan etkisi olma olasılığı nedeniyle fareyi 24 saat içinde yeniden görüntüleme. Tek bir fare her 24-36 saat anestezi sadece bir doz almalıdır. Görüntüleme zaman noktaları arasındaki görüntüleyiciyi kapatın.
      NOT: Biyolüminesans, enjekte edilen gerinimden bağımsız olarak kaybolur. Biyolüminesans yoğunluğu ve uzun ömürlü bakteri sayısı, fare zorlanma, bakteriyel zorlanma, vb dahil olmak üzere birçok faktöre bağlı olarak değişecektir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Şekil 2'degösterildiği gibi, hedeflenen genomik silme, ilgi bölgesini güçlendiren özel astarlarla koloni PCR kullanılarak doğrulanabilir. Genomik silme taşıyan koloniler, yabani tip kolonilere kıyasla daha kısa bir PCR bant boyutu sağlayacaktır. 10-12 koloniden oluşan bir PCR ekranı genellikle hedeflenen silme yitirmesini taşıyan en az bir koloniyi tespit etmek için yeterlidir. Birden fazla ekran turundan sonra silme işlemi algılanmazsa, çekimle başlayan yord...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

pEX100T-Not1 plazmid, marker içermeyen ve çerçeve içi ardışık genomik silmelerin etkili bir aracısi. Bakteri suşları zayıflatılmış virülans için mühendislik zaman, nokta mutasyonları üreten yerine tüm gen dizilerinin silinmesi öldürücü bir fenotip reversiyon olasılığını azaltır. Ayrıca, her patojengen delemesi patojeni daha da zayıflatarak zayıflama nın stabilitesini güçlendirir.

Bu yöntem aynı zamanda sadece plazmid kesici uç tasarımıdeğiştirerek, nokta mutasyonları ve eklemeler gibi deletion...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazar Hongwei D. Yu Baş Bilim Görevlisi ve Progenesis Technologies, LLC kurucularından biridir.

Teşekkürler

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) tarafından desteklenmiştir R44GM113545 ve P20GM103434 hibe.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Düz kapaklı 0,2 mL tüplerThermoScientificAB-0620Fisher Scientific
1 mL ŞırıngaBD22-253-260Fisher Scientific
1,5 mL tek kullanımlık polistiren küvetFisher Scientific14955127
1,5 mL Mikrosantrifüj TüpleriFisher Scientific05-408-129
2,0 mL KriyojenikŞişeler Corning430659Fisher Scientific
27G iğneBD14-821-13Bile Fisher Scientific
50 mL tüplerFisher Scientific05-539-13Fisher Scientific Accublock aracılığıyla
Dijital Kuru BanyoLabnetNC0205808Fisher Scientific Tezgah
Üstü Santrifüj 5804REppendorf04-987-372aracılığıyla
Tezgah Üstü MikrosantrifüjSorvall75-003-287Fisher Scientific
Kabin İnkübatörüVWR1540
Karbenisilin disodyum tuzuFisher ScientificBP2648250
Kültürü Test Tüpü, PolistirenFisher Scientific14-956-6DFisher Scientific aracılığıyla Tek
Kullanımlık Aşılama DöngüleriFisher Scientific22-363-597
Dneasy UltraClean Mikrobiyal Kiti (50)Qiagen12224-50veya tercih edilen yöntem/satıcı
E.Z.N.A. Cycle Pure Kit (50)Omega bio-tekD6493-01veya tercih edilen yöntem/satıcı
EcoRI-HF, kısıtlama endonükleazNew England BioLabsR3101L
Elektroporasyon KüvetleriBulldog BioNC0492929Fisher aracılığıyla Scientific
FastLink II DNA Ligasyon KitiEpicentre TechnologiesLK6201HFisher Scientific
Gentamisin SülfatFisher ScientificBP918-1
GliserolFisher ScientificBP229-4
GoTaq G2 Renksiz Master MixPromegaM7833Fisher Scientific
Isothesia IsofluranHenry Schein aracılığıyla Hayvan Sağlığı29405
IVIS Lumina XRMS Serisi III In Vivo Görüntüleme SistemiPerkins ve ElmerCLS136340
Kanamisin monosülfatFisher ScientificBP906-5
LE agarozGenemate3120-500Fisher Scientific
Luria Et SuyuDifco240230Fisher Scientific
MicroPulser aracılığıyla ElektroporatörBioRad1652100
Noble agar, FisherScientific NotI-HF aracılığıyla ultra saf Affymetris/USBAAJ10907A1
, kısıtlama endonükleazNew England BioLabsR3189
One Shot TOP10 Electrocomp E. coliFisherScientific
Fosfat tamponlu tuzlu su tozuaracılığıyla C404052SigmaP3813-10PAKSigma-Aldrich
Prizma 7GraphPadhttps://www.graphpad.com/scientific-software/prism/
>Pseudomonas izolasyon agarDifco292710Fisher Scientific
Pseudomonas izolasyonu aracılığıyla et suyuAlpha BiosciencesP16-115Özel yapım toplu
QIAprep Spin Miniprep Kiti (250)Qiagen27106veya tercih edilen yöntem/satıcı
Çalkalama İnkübatörüNew Brunswick ScientificInnova 4080200 rpm'de sallama
SimpliAmp Termal DöngüleyiciUygulamalı BiyosistemlerA24811
Yağsız SütDifcoDF0032-17-3aracılığıyla Fisher Scientific
Küçük Plakalar (100 OD x 10 mm)Fisher ScientificFB0875713
SmartSpec Plus SpektrofotometreBio-Rad170-2525veya tercih edilen yöntem/satıcı
SucroseFisherScientific S5-500
Kürdan, yuvarlakElmasHer marka kürdan, otoklavlanmış
TOPO TA Klonlama Kiti, sıralama içinInvitrogen45-0030
XAF-8 Anestezi Sistemi FiltreleriPerkins ve Elmer118999
XGI 8 Gaz Anestezi SistemiKaliper Yaşam Bilimleri/Xenogen
aracılığıyla

Kaynaklar

  1. Gellatly, S. L., Hancock, R. E. Pseudomonas aeruginosa: new insights into pathogenesis and host defenses. Pathogens and Disease. 67 (3), 159-173 (2013).
  2. Valentine, M. E., et al. Generation of a highly attenuated strain of Pseudomonas aeruginosa for commercial production of alginate. Microbial Biotechnology. , (2019).
  3. Schweizer, H. P., Hoang, T. T. An improved system for gene replacement and xylE fusion analysis in Pseudomonas aeruginosa. Gene. 158 (1), 15-22 (1995).
  4. Damron, F. H., Qiu, D., Yu, H. D. The Pseudomonas aeruginosa sensor kinase KinB negatively controls alginate production through AlgW-dependent MucA proteolysis. Journal of Bacteriology. 191 (7), 2285-2295 (2009).
  5. Yu, H., Boucher, J. C., Hibler, N. S., Deretic, V. Virulence properties of Pseudomonas aeruginosa lacking the extreme-stress sigma factor AlgU (sigmaE). Infection and Immunity. 64 (7), 2774-2781 (1996).
  6. Baeshen, M. N., et al. Production of Biopharmaceuticals in E. coli: Current Scenario and Future Perspectives. Journal of Microbiology and Biotechnology. 25 (7), 953-962 (2015).
  7. Marisch, K., Bayer, K., Cserjan-Puschmann, M., Luchner, M., Striedner, G. Evaluation of three industrial Escherichia coli strains in fed-batch cultivations during high-level SOD protein production. Microbial Cell Factories. 12, 58(2013).
  8. Ferrer-Miralles, N., Domingo-Espin, J., Corchero, J. L., Vazquez, E., Villaverde, A. Microbial factories for recombinant pharmaceuticals. Microbial Cell Factories. 8, 17(2009).
  9. Horton, R. M., Cai, Z. L., Ho, S. N., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. Biotechniques. 8 (5), 528-535 (1990).
  10. Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77 (1), 61-68 (1989).
  11. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
  12. Figurski, D. H., Helinski, D. R. Replication of an origin-containing derivative of plasmid RK2 dependent on a plasmid function provided in trans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (4), 1648-1652 (1979).
  13. Choi, K. H., Schweizer, H. P. mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa. Nature Protocols. 1 (1), 153-161 (2006).
  14. Choi, K. H., Kumar, A., Schweizer, H. P. A 10-min method for preparation of highly electrocompetent Pseudomonas aeruginosa cells: application for DNA fragment transfer between chromosomes and plasmid transformation. Journal of Microbiological Methods. 64 (3), 391-397 (2006).
  15. Liang, R., Liu, J. Scarless and sequential gene modification in Pseudomonas using PCR product flanked by short homology regions. BMC Microbiology. 10, 209(2010).
  16. Martinez-Garcia, E., de Lorenzo, V. Engineering multiple genomic deletions in Gram-negative bacteria: analysis of the multi-resistant antibiotic profile of Pseudomonas putida KT2440. Environmental Microbiology. 13 (10), 2702-2716 (2011).
  17. Song, C. W., Lee, S. Y. Rapid one-step inactivation of single or multiple genes in Escherichia coli. Biotechnology Journal. 8 (7), 776-784 (2013).
  18. Yan, M. Y., et al. CRISPR-Cas12a-Assisted Recombineering in Bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 83 (17), (2017).
  19. Prakash, O., Nimonkar, Y., Shouche, Y. S. Practice and prospects of microbial preservation. FEMS Microbiology Letters. 339 (1), 1-9 (2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Fare Enfeksiyon ModeliKoloni PCRAgaroz Jel Elektroforezintraperitonal EnjeksiyonBiyol minesans G r nt lemepEX100T NotI PlazmidiS kroz Diren Taramas
Pseudomonas aeruginosa In-Frame Gen Silme Mutantlar Üretimi ve Enfeksiyon Basit Bir Fare Modelinde Virülans Zayıflama sıiçin Test
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.