Method Article

Fare İskelet Kas Ekstranında Primer Miyoblastların İzolasyon ve Farklılaşması

DOI:

10.3791/60310

⸱

October 15th, 2019

 , 
1Scripps Research, Department of Molecular Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Miyoblastlar polinükleatlı miyotüpler ve sonunda iskelet kası miyofiberleri oluşturmak için farklılaşan öncül hücrelerdir. Burada, genç yetişkin fare iskelet kaslarından etkili izolasyon ve birincil miyoblast kültürü için bir protokol salıyoruz. Bu yöntem, kültürdeki kas hücrelerinin moleküler, genetik ve metabolik çalışmalarını mümkün kılar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Primer miyoblastlar iskelet kasının farklılaşmamış çoğalan öncüleridir. Onlar kültürlü ve kas öncüleri olarak çalışılmış veya kas gelişiminin daha sonraki aşamalarında ayırt etmek için indüklenen. Burada sağlanan protokol, genç yetişkin fare iskelet kas ekstrandan mıyoblast hücrelerinin son derece çoğalan popülasyonunun izolasyonu ve kültürü için sağlam bir yöntem tanımlanmaktadır. Bu hücreler farklı fare modellerinin iskelet kasının metabolik özelliklerinin yanı sıra eksojen DNA ile transfeksiyon veya viral ekspresyon vektörleri ile transdüksiyon gibi diğer downstream uygulamalarında da yararlıdır. Bu hücrelerin farklılaşma ve metabolik profil düzeyi maruz kalma uzunluğuna ve miyoblast farklılaşmasını sağlamak için kullanılan ortamın bileşimine bağlıdır. Bu yöntemler fare kas hücre metabolizması ex vivo çalışması için sağlam bir sistem sağlar. Daha da önemlisi, in vivo modellerinaksine, burada açıklanan yöntemler genişletilebilir ve tekrarlanabilirlik yüksek düzeyde çalışılabilir bir hücre popülasyonu sağlar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genellikle genel metabolik sağlığın bir göstergesi olarak atıfta bulunulsa da, birden fazla çalışma, yaşlı erişkinlerde vücut kitle indeksi (VKİ) sürekli mortalite yüksek risk ile ilişkili olmadığını göstermiştir. Bugüne kadar, bu popülasyonda azaltılmış mortalite ile tutarlı olduğu gösterilen tek faktör kaskütlesi1 artmıştır. Kas dokusu vücuttaki insülin duyarlı hücrelerin en büyük kaynaklarından birini temsil eder, ve bu nedenle genel metabolik homeostazbakımındakritik 2 . Egzersiz yoluyla iskelet kas dokusunun aktivasyonu hem lokal insülin duyarlılığı hem de genel metabolik sağlık artışlar ile ilişkilidir3. In vivo modelleri kas fizyolojisi ve entegre metabolizma üzerinde kas fonksiyonunun etkisi eğitimi için gerekli iken, miyotüplerin birincil kültürleri hayvan çalışmalarının karmaşıklığını azaltan bir sistem sağlar.

Doğum sonrası kaslardan elde edilen miyoblastlar, çok sayıda tedavi ve büyüme koşullarının etkisini son derece tekrarlanabilir bir şekilde incelemek için kullanılabilir. Bu uzun ve myoblast izolasyon ve kültür için çeşitli yöntemler4,5,6,7,8,9tarif edilmiştir kabul edilmiştir. Bu yöntemlerden bazıları yenidoğan kasları kullanmak ve miyoblastlar nispeten düşük sayıda verim5,8, büyük ölçekli çalışmalar için çeşitli hayvanlar gerektiren. Ayrıca, miyoblastların kültüre getirilmesinde en yaygın kullanılan yöntemler, diğer hücre türlerine göre daha az yapışık olan miyoblastlar için zenginleştirmek için "ön kaplama" yöntemini kullanır. Burada açıklanan alternatif zenginleştirme yönteminin, son derece çoğalan miyoblast popülasyonunu zenginleştirmek için çok daha verimli ve tekrarlanabilir olduğunu gördük. Özetle, bu protokol, genç erişkin kas eksperlerinden son derece çoğalan miyoblastların kültür ortamına büyüme yoluyla izolasyonuna olanak sağlamaktadır. Miyoblastlar tekrar tekrar hasat edilebilir, birkaç gün içinde, hızla genişletilmiş, ve miyotüpler içine ayırt etmek için indüklenen. Bu protokol, spontan seğirme miyotüpleri sevese doğru sağlam bir şekilde ayıran çok sayıda sağlıklı miyoblast hücresi üretir. Çeşitli genotiplere sahip farelerin primer miyotubelarında metabolizma ve sirkadiyen ritimleri incelememizi sağladı. Son olarak, 96 kuyulu plakalarda oksijen tüketim oranlarının ölçümlerini kullanarak miyotüplerin oksidatif metabolizma çalışmaları için hazırlanmasına yönelik yöntemleri de sunuyoruz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol Scripps Research'ün hayvan bakım yönergelerine uyar.

1. Kas Dokusu Ekstremitelerinin Toplanması ve İşlenmesi

  1. Diseksiyondan bir gün önce, tüm diseksiyon ekipmanlarını (forsepsler, jiletler ve makaslar) sterilize edin ve gerekli tüm ortamları hazırlayın: fosfat tamponlu salin (PBS), MB Kaplama ortam (DMEM'in 12,5 mL'si, 12,5 mL HAMS F12, 20 mL ısı yalıtımlı fetal sığır serum (FBS), amniyotik sıvı orta takviyesi 5 mL ve Kaplama Çözeltisi (DMEM 24 mL, HAMS F12 24 mL, kollajen 1.7 mL, matrigel 1 mL).
  2. Diseksiyon günü, her kas için kaplama solüsyonu ile bir 6 cm çanak kat diseksiyon edilecek. Her plakanın yüzeyine 2 mL Kaplama Çözeltisi ekleyin, yüzeyde eşit bir kat oluşturmak için hafifçe sallayın ve plakaları 1 saat boyunca 4 °C'de çözeltiyle kuluçkaya yatırın.
  3. Kaplama Çözeltisini plakalardan çıkarın ve stok çözeltisine geri dönün.
    NOT: Kaplama Çözeltisi altı aya kadar yeniden kullanılabilir ve 4 °C'de saklanmalıdır.
  4. Bağlanmamış kollajen ve matrigel kaldırmak için PBS 2 mL ile iki kez plakaları durular.
  5. Diseksiyon sırasında plakaları 37 °C doku kültürü kuluçka makinesine yerleştirin.
  6. Plastik bir torba ya da steril 15 cm çanak içine kalın emici kağıt 2-3 yaprak yerleştirerek nemli bir hazne hazırlayın ve steril su ile kağıt yüzeyini ıslatmak için bir pipet kullanın.
  7. Sterilize etmek için 5 dakika boyunca UV ışığı altında oda yerleştirin.
  8. İstenilen kasları 4 ila 8 haftalık bir fareden ayırın. Kas dokusunu sterilize etmek için, 40 μg/mL gentamicin içeren PBS'de hafifçe durulayın.
    NOT: Kuadriseps ve gastroknemius kasları için, plaka başına bir kas plaka. Soleus için, plantaris ve EDL, bir tabakta her iki bacak kasları birleştirir.
  9. Kası steril 10 cm kaplamasız Petri kabına aktarmak için steril çömleler kullanın. 0.5-1.0 mL kaplama ortamını kas üzerine, doku nemli ama yüzer değil gibi ekleyin (Şekil 1A).
  10. Kasları hafifçe küçük parçalara (yaklaşık 1-3 mm3)dilimlemek için steril bir neşter veya jilet kullanın.
    NOT: En iyi sonuçlar için kas dokusu işleme en aza indirmek için önemlidir.
  11. Kas parçalarını önceden kaplanmış 6 cm'lik bir plakanın yüzeyine aktarmak için forceps veya pipet kullanın. Çok yavaşça doku üzerinde Kaplama Media ek bir 0.8 mL bindirme. Doku parçalarını nemli tutmak için yeterli ortam olmalı ancak yüzer olmamalıdır(Şekil 1B).
  12. Kas parçalarını içeren 6 cm'lik tabakları nemli haznenin içine yerleştirin ve 48 saat(Şekil 1C)için bir kuluçka makinesine (37 °C, %5 CO2)dönün.
    NOT: Kas parçalarının miyoblast büyümesine izin vermek için plaka yüzeyine yapışması hayati önem taşır. Plakaları/hazneyi en az 48 saat hareket ettirin.
  13. 48 saat sonra, kas parçalarının bağlı olduğundan emin olmak için plakaları dikkatlice kontrol edin. Kaplama Media 2 mL ile bindirme, parçaları çıkarmak için değil dikkat.
    NOT: Plakalarda gözle görülür bir kontaminasyon veya enkaz varsa, kas parçalarını dikkatlice yıkayın. Plaka 2 mL PBS / gentamicin çözeltisi plaka kenarında ve ucu hafifçe kas dokusu üzerinde yıkamak için. PBS'yi çıkarın ve yıkama adımını tekrarlayın. İkinci yıkamanın ardından, Kaplama Media'nın 2 mL'lik kaplamasını tamamlayın.
  14. Miyoblastları hasat etmeden önce plakaları 37 °C'lik kuluçka makinesinde 3 gün (orijinal diseksiyondan 5 gün) kadar saklayın. Miyoblastların büyümesini her gün kontrol edin.
    NOT: Kas ekstremitelerinden çıkan hücrelerin görünümü değişken ve heterojen olacaktır. Birincil miyoblastlar küçük, yuvarlak ve parlak hücreler olarak görünür. Ancak, bu aşamada ki görünümlerine göre tanımlamak ne gerekli ne de güvenilirdir (Şekil 2).

2. Hasat Outgrowing Myoblasts

  1. Hazırlamak ve önceden Sıcak Myoblast Media (DMEM 17.5 mL, HAMS F12 17.5 mL, FBS 10 mL, amniyotik sıvı orta takviyesi 5 mL), tripsin, ve PBS / gentamisin. Coat bir T25 şişesi kas grubu başına Kaplama Solüsyonu ile hasat ediliyor ve adım 1.2'de açıklandığı gibi (Bkz. Tablo 1).
  2. Kaplama Media çıkarın ve yavaşça PBS / gentamicin 2 mL ile kas ekstremite durulayın. PBS'yi hızlı bir şekilde çıkarın (bir seferde bir tabak durulayın ve plakanın bu adımda PBS'de olmasına izin vermeyin).
  3. 1 mL PBS/gentamicin'i hafifçe ekleyin ve tabağı 37 °C kuluçka makinesine 1 dakika yerleştirin.
  4. PBS/hücreleri 15 mL'lik bir santrifüj tüpte toplamak için P1000 pipet kullanın.
  5. Tabağa 1 mL tripsin ekleyin ve 3 7 °C'lik kuluçka makinesine 3 dk. Tripsin/hücreleri toplayın ve PBS koleksiyonuyla birleştirin. Santrifüj tüpüne 8 mL Myoblast Media ekleyin ve karıştırmak için hafifçe ters çevirin.
  6. Kas plakalarına 2 mL Kaplama Solüsyonu'nu hafifçe kaplayın ve 37 °C inkübatöre geri dönün.
  7. 200 x g3 dakika için bir santrifüj içinde hücreleri içeren santrifüj tüpler spin .
  8. Hücre peletinden kaçınmak için dikkatli olmak için ~ 1 mL supernatant aspire. Myoblast Media'yı yavaşça ekleyin (tablo 1'ebakınız) ve hücreleri önceden kaplanmış şişeye aktarın ve 37 °C'lik kuluçka makinesine yerleştirin. Bu P0 hasadı. Mikroskop altında gözlenirse çok az hücre olabilir(Şekil 3).
  9. Yukarıda açıklanan hasadı her gün üç defaya kadar tekrarlayın. Üçüncü hasattan sonra ekseleri atın.

3. Çoğalan Miyoblastların Genişlemesi ve Zenginleşmesi

NOT: P0 hasadı heterojen (~%60 miyoblast) olacaktır. Sonraki 2 pasajseçici miyoblastlar hasat pbs kullanın. Daha yapışık hücrelerin çoğu geride bırakılacak ve hızla çoğalan miyoblastlar 2 pasaj içinde ≥95% saf olacaktır. Miyoblastlar kurulduktan sonra, spontan farklılaşmayı önlemek için düşük yoğunlukta tutulmalıdır.

  1. Bölüm 2'den ~40-50% konfluent hücrelerden oluşan her T25 şişesi için, 5 mL Kaplama Çözeltisi ile bir Adet T75 şişesi katlayın ve 4 °C'de 1-4 saat boyunca yerleştirin.
  2. Kaplama Çözeltisini şişelerden çıkarın ve stok çözeltisine geri dönün. Şişeleri 2 mL PBS/gentamicin ile iki kez durulayın ve 37 °C inkübatöre yerleştirin.
  3. P0 myoblast T25 şişelerinden medya aspire. Hücreleri 2 mL sıcak PBS/gentamisin ile kısa bir süre durulayın. Şişeden PBS'yi aspire edin.
    NOT: Bu adımın amacı (3.3) bakteriyel kontaminasyon olasılığını azaltmaktır. Hızlı ve nazik bir şekilde yapılırsa, miyoblast kaybına neden olmamalıdır. İstenirse miyoblast korumasını en üst düzeye çıkarmak için atlanabilir.
  4. Miyoblastiçeren her şişeye 2 mL sıcak PBS (tripsin değil) pipet. PBS'li şişeleri 37 °C'lik kuluçka makinesine 3 dakika yerleştirin.
    NOT: Miyoblastlar PBS ile şişelerden kolayca ayırılmalıdır. Bu adımda tripsin yerine PBS kullanmak miyoblast popülasyonunun diğer hücre tipleri ile kontaminasyonunu azaltmak için çok önemlidir.
  5. Hücreleri 37 °C'lik kuluçka makinesinden çıkarın ve hücreleri yerinden çıkarmak için şişelerin yan tarafına sıkıca dokunun. Serbestçe yüzen miyoblastlar için hafif bir mikroskop altında kontrol edin.
  6. Mataraları bir doku kültürü başlığına dik olarak yerleştirin ve tüm hücrelerin yerinden edilmesini sağlamak için 10 mL Myoblast Media ile şişelerin altını 2-3 kez durulayın.
  7. Hücre/ortam karışımını 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde toplayın. Santrifüj 3 dk 200 x g.
  8. Hücre peletönlemek için dikkatli olmak, yaklaşık 1 mL ortam aspire. Yavaşça santrifüj tüp için Myoblast Media uygun bir hacim ekleyin ve yavaşça karıştırın.
  9. Hücre karışımını yeni T75 şişelerine dağıtın. Her yeni T75 şişesine 10 mL Myoblast Media ekleyin. Hücreleri dağıtmak ve bir gecede 37 °C inkübatöre yerleştirmek için şişeleri yatay olarak hafifçe sallayın.
  10. İki gün sonra, PBS ile bir kez daha geçiş, üç T75 şişeiçine her T75 şişesi bölme.
    NOT: Miyoblastların %50-60'tan fazla konfluent olmasına izin vermeyin, çünkü bu onların ayırt edici bir başlangıç yapmasına ve prolifaterif kapasiteyi kaybetmesine neden olur.
  11. Ek geçişler için tripsin kullanın. PBS verimleri >%95 miyoblastlarla iki kez geçiş; saflığı daha da geliştirme girişimleri daha da kötü farklılaşmaya yol açma eğilimindedir.

4. Primer Miyoblastların Miyotüplere Farklılaşması

  1. Kaplamalı plakalar üzerindeki Myoblast Media'daki P2 plakalı (veya daha sonraki geçit) miyoblastlar (önerilen kaplama ve kaplama hacimleri ve hücre sayıları için Tablo 1'e bakınız). İki veya üç gün sonra, hücreler %70-80 birleştiğinde, ortamı Farklılaşma Ortamına (24 mL DMEM, 24 mL HAMS F12, 1,5 mL ısı inaktive at serumu, 0.5 mL İnsülin-Selenyum-Transferrin) değiştirin.
  2. Primer miyoblastların miyotüplere farklılaşması sırasında farklılaşma ortamını her gün değiştirin. Farklılaşma genellikle Gün 4-5 tarafından tamamlanır ve kendiliğinden seğirme uzatılmış, erimiş hücreler tarafından işaretlenir. 6 gün içinde farklılaştırılmış miyotüpler üzerinde deneyler yapın. Genellikle hücreler farklılaşmayı başlattıktan beş veya altı gün sonra test edilir.

5. 96 kuyulu Plakalarda Miyoblastlarda veya Miyotubelarda Oksijen Tüketim Oranının Ölçülmesi

  1. Her kuyuda 25 μL kaplama çözeltisi içeren 96 kuyulu plakalar. Herhangi bir kabarcıkları kaldırmak için 1 dk için 58 x g plakaları santrifüj.
  2. 4 °C'de 1-4 saat kaplama çözeltisi içinde plakaları kuluçkaya yatırın. Kaplama çözeltisini çıkarmak için çok kanallı pipet kullanın ve 25 μL soğuk PBS/gentamisin'de üç kez yıkayın. Hiçbir kabarcıklar sıkışıp olduğundan emin olmak için bu yıkar en az bir santrifüj.
  3. Her kuyuya 40 μL Farklılaştırma Ortamı ekleyin. Kabarcıkları önlemek ve ortam tek düze bir tabaka almak için yüzey gerilimini kaldırmak için 58 x g 1 dakika boyunca hiçbir hücre ile kaplı plaka üzerinde medya santrifüj.
  4. Her kuyuya 40°L ek bir ortamda asılı olan hücreleri ekleyin. 58 x gtekrar spin .
    NOT: Kaplama tutarlılığı en iyi sonuçlar için önemlidir ve iyi başına kaplanmış hücre sayısı her deneysel kurulum için optimize edilmelidir, ve büyük olasılıkla ~ 10,000-25,000 miyoblastlar aralığında olacak 96-iyi plaka iyi başına farklılaşma medya plakalı.
  5. Farklılaşma sırasında medyayı günlük olarak hafifçe değiştirin. Ortamı aspire etmeyin, daha çok bir pipet ile kaldırın, hücreleri sökme veya havaya maruz önlemek için arkasında küçük bir hacim bırakarak. Örneğin, aynı anda 80 μL yerine üç tekrar için bir seferde 50 μL değiştirin.
  6. Koşul başına 8-15 kuyu kullanın. Hücreler tek tip bir miyotüpler tabakası oluşturmuyorsa bazı kuyuları atlamak gerekebilir.
    NOT: Onlar buharlaşma için son derece duyarlı olduğu için plaka kenarlarında kuyular atlayın. Sistematik hatalardan kaçınmak için deneysel çoğaltmalar için plaka kurulumünü değiştirin.
  7. Tam farklılaşmadan sonraki 1-2 gün içinde farklılaştırılmış miyotüplerde istenilen titreyi yapın (Diferansiyasyonun başlangıcından itibaren 4-6. gün). Oksijen tüketim oranlarının ölçülmesi için önerilen aletler ve reaktifler Malzemeler Tablosu'ndalistelenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sağlanan protokolün Bölüm 1'inden sonra, standart bir ışık mikroskobu altında görülebilecek eksplants'lerden çıkan birincil hücreler sağlamalıdır(Şekil 2). Heterojen bir hücre popülasyonu dışarı büyüyen ve her kas dokusu ekstrüzyon çevreleyen görülecektir. Miyoblastlar küçük, yuvarlak, parlak küreler olarak görünür. Protokolün 2. Protokolün 3. Protokolün Bölüm 4'ü takip ederek daha fazla deneysel manipülasyon için tam farklılaştı...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İskelet kası metabolik homeostazın kurulması ve bakımı için hayati önem taşımaktadır11. Kas fizyolojisi çalışması, bireyler arası değişkenlik ve özellikle insan çalışmaları söz konusu olduğunda örnek almada güçlük nedeniyle karmaşıktır. Kültürlü primer miyotüpler kas fizyolojisi birçok özelliği recapitulate gösterilmiştir, kalsiyum homeostaz dahil12, hasarlı kas dokusunun rejenerasyon5, egzersiz yanıt metabolik değişiklikler13...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar Melbourne Üniversitesi'nden Dr Matthew Watt ve Johns Hopkins Üniversitesi'nden Dr Anastasia Kralli yardım mokbel veark. 6çalışmalarına dayalı bu protokolü benimseyen için minnettarız. Ayrıca Dr. Sabine Jordan'a bu protokolün laboratuarımızda geliştirilmesi ve benimsenmesi için teşekkür ederiz. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri R01s DK097164 ve DK112927 tarafından K.A.L. tarafından finanse edilmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
< güçlü > Kaplama Çözümü: < / güçlü >
DMEMGibco10569010Kullanmadan önce daima gentamisin (hacimce 1: 1.000) ekleyin; 24 mL
HAMS F12Lonza12-615FKullanmadan önce daima gentamisin (hacimce 1:1,000) ekleyin; 24 mL
KolajenYaşam TeknolojileriA10644011.7 mL
MatrigelFisherCB40234A1 mL
< güçlü > Kaplama Ortamı: < / güçlü >
DMEMGibco10569010Kullanmadan önce daima gentamisin (hacimce 1: 1.000) ekleyin; 12,5 mL
HAMS F12Lonza12-615FKullanmadan önce daima gentamisin (hacimce 1:1,000) ekleyin; 12,5 mL
Isı ile İnaktive Edilmiş FBSYaşam Teknolojileri1600004420 mL; normal FBS olarak satın alınabilir ve 40 &°C içine yerleştirilerek ısıyla etkisiz hale getirilebilir; 20 dakika C su banyosu
AmniomaxLife Technologies125560235 mL
Myoblast Media: < / güçlü >
DMEMGibco10569010Kullanmadan önce daima gentamisin (hacimce 1: 1.000) ekleyin; 17.5 mL
HAMS F12Lonza12-615FKullanmadan önce daima gentamisin (hacimce 1:1.000) ekleyin; 17,5 mL
Isı 10mL'lik 16000044Life Technologies; normal FBS olarak satın alınabilir ve 40 ° C'ye yerleştirilerek ısıyla inaktive edilebilir; 20 dakika boyunca C su banyosu
AmniomaxLife Technologies125560235 mL
Farklılaşma Ortamı: < / güçlü >
DMEMGibco10569010Kullanmadan önce daima gentamisin (hacimce 1: 1.000) ekleyin; 24 mL
HAMS F12Lonza12-615FKullanmadan önce daima gentamisin (hacimce 1:1,000) ekleyin; 24 mL
Isı İnaktive AtSerumu SigmaH11381.5 mL
İnsülin-Selenyum-TransferrinYaşam Teknolojileri41400045 0.5 mL
Diğer Malzemeler: < / güçlü >
PBSGibco14040133
GentamisinSigmaG1397
TrypLEGibco12604013
DMSOSigma472301Hücreleri dondurmak için Myoblast Besiyerinde %10 DMSO olarak hazırlayın
ForsepsHerhangi Bir
Tıraş BıçağıHerhangi Bir
MakasHerhangi Bir
Whatman kağıdıVWR21427-648
60 mm plakaVWR734-2318
10 cm plakaVWR25382-428 (CS)
T25 ŞişelerThermoFisher156367
T75 ŞişelerThermoFisher156499
Santrifüj Tüpleri (15 mL)BioPioneerCNT-15
Oksijen Tüketim Oranları:
Denizatı XFe96 AnalizörüAgilentDenizatı XFe96 AnalizörüHücre dışı ortamın asitleştirilmesiyle okunan oksijen tüketim oranlarını ölçmek için kullanılan alet
Denizatı XFe96 FluxPakAgilent102416-100XFe96 Analizöründe kullanım için 96 oyuklu plakalar
Denizatı XF Hücresi Mito Stres Test KitiAgilent103015-100bileşenleri, tahlil oluşturulduktan sonra diğer tedarikçilerden satın alınabilir; bazı öneriler aşağıda listelenmiştir
Denizatı XF Palmitate-BSA FAO substratıAgilent102720-100bileşenleri, tahlil oluşturulduktan sonra diğer tedarikçilerden satın alınabilir; bazı öneriler aşağıda listelenmiştir
asidi oksidasyonunun ölçümü içinpalmitik asitSigmaP5585-10G
Yağ asidi oksidasyonunun ölçümü içinKarnitinSigmaC0283-5G
Yağ asidi oksidasyonunun ölçümü içinEtomoxirSigmaE1905
BSASigmaA7030yağ asidi oksidasyonunun ölçümünde kullanım için kontrol olarak veya palmitik asit ile konjugasyonda kullanılır
inaktive edilmiş FBS Yağ ,

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Srikanthan, P., Karlamangla, A. S. Muscle mass index as a predictor of longevity in older adults. American Journal of Medicine. 127 (6), 547-553 (2014).
  2. Lee-Young, R. S., Kang, L., Ayala, J. E., Wasserman, D. H., Fueger, P. T. The physiological regulation of glucose flux into muscle in vivo. Journal of Experimental Biology. 214 (2), 254-262 (2010).
  3. Sjøberg, K. A., et al. Exercise increases human skeletal muscle insulin sensitivity via coordinated increases in microvascular perfusion and molecular signaling. Diabetes. 66 (6), 1501-1510 (2017).
  4. Girgis, C. M., Clifton-Bligh, R. J., Mokbel, N., Cheng, K., Gunton, J. E. Vitamin D signaling regulates proliferation, differentiation, and myotube size in C2C12 skeletal muscle cells. Endocrinology. 155 (2), 347-357 (2014).
  5. Smith, J., Merrick, D. Embryonic skeletal muscle microexplant culture and isolation of skeletal muscle stem cells. Methods in Molecular Biology. 633, 29-56 (2010).
  6. Mokbel, N., et al. K7del is a common TPM2 gene mutation associated with nemaline myopathy and raised myofibre calcium sensitivity. Brain. 136 (2), 494-507 (2013).
  7. Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270, 725-727 (1977).
  8. Rando, T. A., Blau, H. M. Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy. Journal of Cell Biology. 125 (6), 1275-1287 (1994).
  9. Musarò, A., Carosio, S. Isolation and Culture of Satellite Cells from Mouse Skeletal Muscle. Methods in Molecular Biology. 1553, 155-167 (2017).
  10. Smolina, N., Bruton, J., Kostareva, A., Sejersen, T. Assaying mitochondrial respiration as an indicator of cellular metabolism and fitness. Methods in Molecular Biology. 1601, 79-87 (2017).
  11. Elliott, B., Renshaw, D., Getting, S., Mackenzie, R. The central role of myostatin in skeletal muscle and whole body homeostasis. Acta Physiologica. 205 (3), 324-340 (2012).
  12. Smolina, N., Kostareva, A., Bruton, J., Karpushev, A., Sjoberg, G., Sejersen, T. Primary murine myotubes as a model for investigating muscular dystrophy. BioMed Research International. , (2015).
  13. Nedachi, T., Fujita, H., Kanzaki, M. Contractile C 2 C 12 myotube model for studying exercise-inducible responses in skeletal muscle. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 295 (5), E1191-E1204 (2008).
  14. Chen, M. B., et al. Impaired activation of AMP-kinase and fatty acid oxidation by globular adiponectin in cultured human skeletal muscle of obese type 2 diabetics. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 90 (6), 3665-3672 (2005).
  15. Douillard-Guilloux, G., Mouly, V., Caillaud, C., Richard, E. Immortalization of murine muscle cells from lysosomal α-glucosidase deficient mice: A new tool to study pathophysiology and assess therapeutic strategies for Pompe disease. Biochemical and Biophysical Research Communications. 388 (2), 333-338 (2009).
  16. Varga, B., et al. Myotube elasticity of an amyotrophic lateral sclerosis mouse model. Scientific Reports. 8 (1), 5917(2018).
  17. Kriebs, A., et al. Circadian repressors CRY1 and CRY2 broadly interact with nuclear receptors and modulate transcriptional activity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (33), 8776-8781 (2017).
  18. Cho, Y., et al. Perm1 enhances mitochondrial biogenesis, oxidative capacity, and fatigue resistance in adult skeletal muscle. FASEB Journal. 30 (2), 674-687 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Primary MyoblastsMouse Skeletal MuscleCell IsolationTissue ExplantMyoblast DifferentiationCell CultureFlow CytometryLight MicroscopySeahorse AssayOxygen Consumption

Related Articles