Bu protokol, araştırmacılara, biyomateryal implant mikroçevresini modelleyen çeşitli polimerik yüzeylere ve adsordi protein katmanlarına yanıt olarak bir murine makrofaj hücre hattında TLR bağımlı NF-кB/AP-1 transkripsiyon faktörü aktivitesini ölçmenin hızlı ve dolaylı bir yöntemini sağlar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Polimerik Yüzeylerde Adsorbe Protein Katmanlarında Sinyalizasyonu NF-kB/AP-1 Sinyallerini İnceleyecek Bir Makrofaj Muhabiri Hücre Tetkik
Bu makalede
Özet
Özet
Yabancı cisim reaksiyonu olarak bilinen implante biyomateryale verilen kalıcı inflamatuar konak yanıtı, biyomedikal cihazların ve doku mühendisliği yapılarının geliştirilmesi ve uygulanmasında önemli bir sorundur. Makrofajlar, doğuştan gelen bir bağışıklık hücresi, cihazın ömrü boyunca implant yerinde kalır, çünkü yabancı cisim reaksiyonunun önemli oyuncuları, ve yaygın olarak bu zararlı konak yanıtı bir anlayış kazanmak için çalışılır. Birçok biyomalzeme araştırmacısı, implante edilmiş malzemeler üzerindeki adsord protein katmanlarının makrofaj davranışını etkilediğini ve daha sonra ev sahibi nin tepkisini etkilediğini göstermiştir. Bu yazıda yöntemler makrofaj yanıtları değerlendirmek için polimer biyomalzeme yüzeylerde hücresel hasar molekülleri içeren adsordi protein katmanları kullanarak bir in vitro modeli açıklar. Bir NF-кB/AP-1 muhabiri makrofaj hücre hattı ve ilişkili kolorimetrik alkalen fosfataz testi, in vivo'da biyomateryal yüzeylerde oluşan karmaşık adsordit protein tabakalarının bir modeli olarak, kan proteinleri ve hasarla ilişkili moleküler desenler içeren karmaşık adsorditprotein katmanlarına yanıt olarak NF-кB/AP-1 transkripsiyon faktörü aktivitesini dolaylı olarak incelemek için hızlı bir yöntem olarak kullanılmıştır.
Giriş
Yabancı cisim reaksiyonu (FBR), implante edilmiş bir malzemenin veya cihazın (örneğin, ilaç dağıtım cihazları, biyosensörler) inflamatuar arabulucuların kalıcı salınımı yoluyla ve implante edilen malzeme ile çevre dokuarasındakientegrasyonu engelleyerek performansını olumsuz etkilenebilen kronik bir konak tepkisidir 1 . Bu doğuştan gelen immün yanıt implantasyon prosedürü ile başlatılır veimplant1 etrafında doğuştan gelen bağışıklık hücreleri ve fibröz kapsül oluşumu uzun süreli varlığı ile karakterizedir. Malzeme ana bilgisayar yanıtları bağlamında, makrofaj-malzeme etkileşimleri ana yanıtın ilerlemesi ve FBR
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Medya ve Reaktif Hazırlama
- Fibroblast ortamı hazırlayın. 450 mL Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamını (DMEM), 50 mL fetal sığır serumunu (FBS) ve 5 mL penisilin/streptomisin'i birleştirin. 4 °C'de 3 aya kadar saklayın.
- 50 mL aliquots muhabir makrofaj büyüme medya hazırlayın. 45 mL DMEM, 5 mL FBS, 5 μg/mL mikoplazma eliminasyon reaktifi(Malzeme Tablosu)ve 200 μg/mL phleomisin D1(Malzeme Tablosu)birleştirin. 4 °C'de 3 aya kadar saklayın.
- 50 mL aliquots muhabir makrofaj tsay medya hazırlayın. 45 mL DMEM, 5 mL ısı inaktive FBS (HI-FBS), 5 g/mL mikoplazma eliminasyon reaktifi ve 200 μg/mL phleomisin D1'i bir....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Polimer kaplı yüzeyler için temizleme yöntemleri, kaplamada herhangi bir bozulma olmaması için test edilmiştir, bu da su temas açısında kaplamasız cam kapak kaymasına bir değişiklik olarak görülebilir(Şekil 2). PMMA kaplı mikroskop slaytlarının 1 saat boyunca p etanolle ıslatılması pmma kaplamasını(Şekil 2,
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Laboratuvarımızın ana odak noktası katı biyomalzeme yumuşak doku implantlarına yapılan ana yanıttır ve özellikle implantasyon işlemi sırasında oluşan hücresel hasarın konak yanıtını nasıl etkilediğidir. Burada sunulan çalışma, hücresel hasar sırasında (implant cerrahisinden) biyomalzemelere makrofaj tepkileri üzerine salınan moleküllerin etkisini araştırmak için bir muhabir makrofaj hücre hattı ve in vitro-generated DAMP içeren hücresel lysate kullanılarak yapılan ön deneyleri açıklamaktadır. Fibroblast hücreli lysate, b.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
Yazarlar minnetle Kanada Sağlık Araştırma Projesi Enstitüleri (PTJ 162251), Queen's University Senato Danışma Araştırma Komitesi ve Kanada Yenilik John Evan Liderlik Fonu (Proje 34137) ve Araştırma ve Yenilik Ontario Araştırma Fonu (Proje 34137) için altyapı desteği operasyonel fon kabul. L.A.M. Queen's University R. Samuel McLaughlin Bursu, Kanada Kanada Yüksek Lisans Bursu Yüksek Lisans Ödülü ve Ontario Lisansüstü Bursu tarafından desteklendi. Yazarlar NF-κB/AP-1 muhabiri makrofaj hücre hattı ve Dr Michael Blennerhassett ve Sandra Lourenssen kendi jel görüntüleme sistemi ve plaka okuyucu kullanımı için yaptığı cömert hediye için Dr Myron Szewczuk teşekkür etmek isti....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Hücre kültürü reaktifleri< / em>< / güçlü> | |||
| anti-fare / insan CD282 (TLR2) | Biolegend | 121802 | |
| CLI-095 (TLR4 inhibitörü) | Invivogen | TLRL-CLI95 | |
| C57 kompleman plazması K2 EDTA 10ml, yenilikçi sınıf ABD menşeili | Yenilikçi Araştırma | IGMSC57-K2 EDTA-Compl-10ml | Fare plazması |
| Dulbecco'nun modifiye kartal ortamı (DMEM) | Sigma Aldrich | D6429-500ML | |
| Dulbecco'nun fosfat tamponlu salin (DPBS) | Fisher Scientific | 14190250 | Kalsiyum yok, magnezyum yok |
| Fetal sığır serumu (FBS), araştırma sınıfı | Wisent | 98150 | |
| LPS-EK | Invivogen | TLRL-EKLPS | Escherichia coli K12'den lipopolisakkarit |
| NIH / 3T3 fibroblastlar | ATCC | CRL-1658 | |
| Pam3CSK4 | Invivogen | tlrl-pms | Sentetik triasillenmiş lipopeptid - TLR1/2 ligand |
| Penisilin / streptomisin | Sigma Aldrich | P4333-100ML | |
| Plasmocin | Invivogen | ANT-MPP | Mikoplazma eliminasyon reaktifi |
| RAW-Blue cells | Invivogen | raw-sp | NF-κ B / AP-1 raportör makrofaj hücre hattı |
| Tripan mavisi çözeltisi,% 0.4 | Fisher Scientific | 15250061 | |
| TrypLE ekspres enzimi (1X) | Fisher Scientific | 12604021 | hayvan kökenli içermeyen rekombinant hücre ayrışma enzimi |
| Zeocin | Invivogen | ANT-ZN-1 | |
| < güçlü >< >Kitler ve tahliller< / em>< / güçlü> | |||
| ELISA ön kaplamalı plakalar, fare IL-6 | Biolegend | B213022 | |
| ELISA ön kaplamalı plakalar, fare TNF-&alfa; | Biolegend | B220233 | |
| Endotoksin (Escherichia coli) - Kontrol standardı endotoksin (CSE) | Cape Cope Inc. Associates | Kromojenik endotoksin testinde standart eğri için | E0005-5 |
| LAL suyu, 100 mL | Cape Cope Inc. Associates | WP1001 | Kromojenik endotoksin testi ile kullanılır |
| Mikro BCA protein testi | Fisher Scientific | PI23235 | |
| Limulus amebosit lizat (LAL) Pirokrom endotoksin test kiti | Associates of Cape Cope, Inc. | C1500-5 | Kromojenik endotoksin tahlil reaktifi |
| QUANTI-Blue alkalin fosfataz tespit ortamı | Invivogen | rep-qb2 | Dolaylı olarak NF-&kappa'yı ölçmek için alkalin fosfataz testi; B/AP-1 aktivitesi |
| Polimerik kaplama reaktifleri | |||
| Kloroform, susuz | Sigma Aldrich | 288306-1L | |
| Etil alkol susuz | Ticari Alkoller | P006EAAN | Sigma: Reaktif alkol, susuz, 676829-1L |
| Düz konik ince uçlu forseps | Fisher Scientific | 16-100-113 | |
| Florinert FC-40 çözücü | Sigma Aldrich | F9755-100ML | fPTFE |
| Hücre kültürü sınıfı su için florlu çözücü (endotoksin içermez) | Fisher Scientific | SH30529LS | |
| Poli (metil metakrilat) (PMMA) | Sigma Aldrich | 182230-25G | |
| Sylgard 184 elastomer kiti | Fisher Scientific | 50822180 | |
| Teflon-AF (fPTFE) | Sigma Aldrich | 469610-1G | Poli[4,5-difloro-2,2-bis (triflorometil)-1,3-dioksol-ko-tetrafloroetilen] |
| Sarf malzemeleri< / em>< / güçlü > | |||
| Yapışkan plaka contaları | Fisher Scientific | AB-0580 | |
| Axygen mikrotüpler, 1.5 mL | Fisher Scientific | 14-222-155 | |
| Borosilikat cam sintilasyon şişeleri, beyaz polipropilen kapaklı | Fisher Scientific | 03-337-4 | |
| Clear PS 48 oyuklu plaka | Fisher Scientific | 08-772-52 | |
| Clear TCPS 96 oyuklu plaka | Fisher Scientific | 08-772-2C | |
| Şeffaf TCPS 48 kuyulu plaka | Fisher Scientific | 08-772-1C | |
| Kapak camları, daireler | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
| Falcon doku kültürü ile muamele edilmiş şişeler, T25 | Fisher Scientific | 10-126-10 | |
| yapışkan-Slayt 8 Kuyu | Ibidi | 80828 | |
| Superfrost mikroskop slaytları | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Doku kültürü ile muamele edilmiş şişeler, T150 | Fisher Scientific | 08-772-48 |
Kaynaklar
- Anderson, J. M., Rodriguez, A., Chang, D. T. Foreign body reaction to biomaterials. Seminars in Immunology. 20 (2), 86-100 (2008).
- Anderson, J. M., Miller, K. M. Biomaterial biocompatibility and the macrophage. Biomaterials. 5 (1), 5-10 (1984).
- Collier, T. O., Anderson, J. M.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
