Yöntem makalesi

İnsan İmmün Yetmezlik Virüsü/Simian İmmün Yetmezlik Virüsü Araştırmalarında Yeni Nesil Viral RNA/DNA in situ Hibridizasyon Uygulamaları

2.1K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/60318

⸱

17 Haziran 2020

 ,  ,  , 
1AIDS and Cancer Virus Program, Frederick National Laboratory for Cancer Research, Leidos Biomedical Research Inc., 2Vaccine and Gene Therapy Institute and Oregon National Primate Research Center (ONPRC), Oregon Health and Science University (OHSU)

Bu makalede

Özet

Burada, formalinle sabitlenmiş parafine gömülü (FFPE) dokularda spesifik viral RNA veya DNA dizilerini tanımlamak için yeni nesil bir in situ hibridizasyon testi sunuyoruz. Bu yaklaşım, RNA ve DNA'nın düşük kopyalarının 24 saatten daha kısa sürede çok yüksek hassasiyet ve özgüllük ile görselleştirilmesini sağlar.

Özet

İn situ hibridizasyon, doku bölümlerindeki tek tek hücreler içindeki spesifik RNA veya DNA dizilerini tanımlamak için güçlü bir tekniktir ve fizyolojik süreçler ve hastalık patogenezi hakkında önemli bilgiler sağlar. İn situ hibridizasyon (ISH), virüsler tarafından enfekte olmuş hücrelerin yerini değerlendirmek için uzun yıllardır kullanılmaktadır, ancak son zamanlarda, doku morfolojisini korurken tek moleküllü görselleştirme elde etmek için eşzamanlı sinyal amplifikasyonuna ve arka plan baskılamasına izin veren benzersiz bir prob tasarım stratejisi ile yeni nesil bir ISH yaklaşımı geliştirilmiştir. Bu yeni nesil ISH, dallanmış PCR gibi bir yaklaşıma dayanır, ancak in situ olarak gerçekleştirilir ve formalinle sabitlenmiş parafine gömülü (FFPE) dokularda RNA veya DNA'yı rutin olarak tespit etmede klasik ISH yöntemlerinden veya in situ PCR yaklaşımlarından daha kolay, hassas ve tekrarlanabilirdir. Laboratuvarımız son birkaç yıldır insan immün yetmezliği (HIV) ve simian immün yetmezliği (SIV), viral RNA (vRNA) ve/veya viral DNA (vDNA) pozitif hücrelerin çok sayıda FFPE dokusunda tespiti için bu ISH platformunu uygulamaktadır. Bu ayrıntılı teknik el yazması ile, araştırmalarında yeni nesil ISH'yi kullanmakla ilgilenen tüm bireylerle bilgi ve tavsiyelerimizi paylaşmak istiyoruz.

Giriş

ISH, tamamlayıcı DNA, RNA veya modifiye edilmiş nükleik asit ipliklerini (yani problar) bir hücre veya doku bölümü içindeki spesifik DNA veya RNA dizilerine hedeflemek ve görselleştirmek için kullanılan deneysel yaklaşımdır. ISH, dokulardaki spesifik nükleik dizilerin spesifik lokalizasyonuna ve görselleştirilmesine izin verir, bu da hedef ile hücresel ortamı arasındaki ekspresyon seviyesini, organizasyonunu, dağılımını ve etkileşimlerini anlamak için önemlidir, bu da qPCR gibi diğer popüler tekniklerin kullanılmasıyla elde edilemeyen değerli bilgilerdir. Yakın zamana kadar, ISH yaygın olarak etiketli bir tamamlayıcı DNA veya tamamlayıcı bir RNA (riboprob) ile gerçekleştiriliyordu. Bu problar ya radyo, floresan veya antijen etiketli bazlarla doğrudan konjuge edildi (ör., 35S, FITC ve digoksigenin) daha sonra sırasıyla otoradyografi, floresan mikroskobu veya immünohistokimya tespit yaklaşımları kullanılarak dokuda lokalize edildi ve nicelleştirildi. Bu yerinde teknolojiler değerli yaklaşımlar olmaya devam ederken, daha az emek yoğun, daha basit, daha hızlı, hassas ve spesifik yaklaşımlar geliştirmek için iyileştirme için geniş bir alan vardır.

İlk olarak 2012'de tanımlanan, konakçı haberci RNA'nın (mRNA) tespiti için alternatif bir ticari yeni nesil ISH yaklaşımı (örneğin, RNAscope testi), dallanmış PCR'ye dayanmaktadır. mRNA tespiti, FFPE hücrelerinde ve dokularında, tek tek hücrelerde tek RNA molekülü görselleştirmesine yaklaşan bir hassasiyetlegerçekleştirilir 1. Bu yaklaşımın özgüllüğü, iki çift-Z hedef probunun, bir sinyal ön yükselticisinin1'i sırayla bağlaması için ilgili tamamlayıcı RNA (veya DNA) dizilerine bitişik olarak bağlanması benzersiz koşulu altında elde edilir. Bu, dallanmış DNA'ya (bDNA) benzer sonraki hibridizasyon adımları yoluyla bir sinyal amplifikasyon kaskadının başlatılmasına izin verir1,2. Ek olarak, bu yaklaşım oldukça hızlı ve kolaydır, sadece 1 günde (<8 saat) elde edilen sonuçlar, Radio-ISH 1,2 dahil olmak üzere alternatif tekniklerle 4 haftaya kadar önemli bir avantajdır. Bu yeni nesil ISH, HIV / SIV araştırmaları için yeni bakış açıları ve fırsatlar açtı. HIV tedavisinin önündeki en büyük engeller, hastalığın erken evrelerinde kurulan hücresel ve doku rezervuarlarıdır 3,4. Bu tekniğin genel amacı, viral bir rezervuar görevi gören ve enfekte bir konakçı içinde kalıcı olan ana doku bölmelerini tanımlamak, lokalize etmek ve nihayetinde anlamaktır. Bu da HIV'e karşı etkili tedavi stratejilerinin geliştirilmesine yardımcı olacaktır.

Bu yazıda, dubleks yeni nesil RNA/DNA multipleks ISH protokolümüzü (örneğin, RNAscope/DNAscope) ayrıntılı olarak açıklıyoruz ve yeni nesil ISH'yi örneklerimize ve spesifik hedeflerimize göre optimize etmek için mevcut RNA ISH protokolünü nasıl değiştirdiğimizi açıklıyoruz. Bu protokol, 5 μm doku kesitleri içinde HIV/SIV viral RNA ve viral DNA'nın görselleştirilmesine, lokalizasyonuna ve miktarının belirlenmesine izin verir. Hem vRNA'nın hem de vDNA'nın eşzamanlı görselleştirilmesi, iki özel prob setinin birleştirilmesiyle gerçekleştirilir: vDNA kodlama zincirini hedefleyen bir duyu (C1 SIVmac239 Gag-Pol-Sense probu [416141-C1]) ve viral genomun farklı bölgelerini kapsayan vRNA transkriptlerini (C2 SIVmac239 Vif-Env-Nef-Tar-Anti-Sense probu [416131-C2]) hedefleyen bir anti-sens (Tablo 1), C1 ve C2 olmak üzere iki farklı görselleştirme kanalı kullanarak. Bu protokolde, C1 ve C2 kanalları, farklı renklerdeki sinyalleri (yani kırmızı AP ve kahverengi HRP) görselleştirmemize ve probları farklı yaklaşımlarla tespit etmemize olanak tanır. Doku fiksasyon işlemi ve kesme hariç, bu test 2 gün sürer. Burada, hücre peletleri veya doku kesitleri üzerinde gerçekleştirilebilen dubleks vRNA ve vDNA in situ hibridizasyon protokolü sunulmaktadır.

Protokol

1. Kesit ve slayt hazırlıkları

  1. Parafin bloklarını kesin ve 5 +/- 1 μm'lik bölümleri kesmek için bir mikrotom kullanın. Bölümleri veya hücre peletlerini 40-45 °C RNaz içermeyen su banyosunda yüklü mikroskop slaytlarına monte edin. Havayla kuruyan slaytlar gece boyunca 37 °C veya RT'de.
    NOT: Slaytlar oda sıcaklığında (RT) 3 aya kadar ve 4 °C'de 6 aya kadar saklanabilir.
  2. FFPE slaytlarını deparafinize edin.
    1. Slaytları kuru fırında 60 °C'de 1 saat pişirin.
    2. Bir davlumbazda, iki slayt boyama kabını ~200 mL taze ksilen ile ve iki ek boyama kabını ~200 mL taze %100 etanol ile doldurun. Kapları kapaklarla örtün.
    3. Slaytları bir rafa yerleştirin ve ilk ksilen içeren kabın içine daldırın. Çalkalama ile RT'de 5-10 dakika inkübe edin.
    4. Slaytları ikinci ksilen içeren tabağa yerleştirin ve çalkalama ile RT'de 5-10 dakika inkübe edin.
    5. Slaytları hemen% 100 etanol içeren tabağa yerleştirin. Slaytları RT'de çalkalama ile 5-10 dakika inkübe edin.
    6. Slaytları hemen% 100 etanol içeren ikinci tabağa yerleştirin ve çalkalama ile RT'de 5-10 dakika inkübe edin.
    7. Rafı etanolden çıkarın, fazla etanolü çıkarmak için rafın yan tarafına hafifçe vurun ve RNaz içermeyen suda 5-15 dakika durulayın.

2. Fırın hazırlığı

  1. Hibridizasyon fırınını açın ve sıcaklığı 40 °C'ye ayarlayın.
  2. Bir tepsiye bir bez veya sağlam emici kağıt havlu yerleştirin ve nem kontrolünü sağlamak için çift damıtılmış suyla tamamen ıslatın.
  3. Kapalı tepsiyi fırına yerleştirin ve fırın kapağını kapatın. Kullanmadan önce tepsiyi 40 °C'de en az 30 dakika ısıtın. Kullanılmadığı zaman tepsiyi fırında tutun.

3. Isı kaynaklı epitop alımı

  1. 0.5x sitrat bazlı ISH hibridizasyon hedef alma tamponu hazırlayın (10 nmol / L, pH = 6, Malzeme Tablosuna bakınız). Isıtma plakası üzerindeki bir beherde kaynatın.
  2. Slaytları 30 dakika boyunca kaynayan hedef alma tamponuna yerleştirerek ısıya bağlı epitop alımını gerçekleştirin.
  3. Slaytları hedef alma tamponundan çıkarın ve hemen çift damıtılmış suda yıkayın. Havada kurutmadan önce 5 dakika boyunca% 100 etanol içinde kurutun.
  4. Slaytlar hava ile kuruduktan sonra, slayt üzerindeki doku bölümünü çevrelemek için hidrofobik bariyer kalemi uygulayın. Hidrofobik bariyerin tamamen kurumasına izin verdiğinizden emin olun.

4. Proteaz ön tedavisi

  1. Kurutulmuş slaytları kilitli bir sürgülü rafa yerleştirin, ardından proteaz ön işlem reaktiflerini (proteaz sindirim solüsyonu, 2,5 μg/mL) steril, soğuk, PBS ile 1:5 oranında seyrelterek hazırlayın. İyice karıştırın.
    NOT: Ticari olarak temin edilebilen kitte farklı konsantrasyonlara sahip üç farklı proteaz reaktifi sağlanmaktadır. Proteaz III (standart), Proteaz IV (güçlü) ve Protease Plus (hafif). Bir çalışmada uygulamadan önce proteaz sindirim süresini ve seyreltmesini ampirik olarak test edin, çünkü optimal koşullar doku tipine, fiksasyona ve kalınlığa bağlı olarak değişecektir (bkz. Tartışma).
  2. Seyreltilmiş proteaz solüsyonunu, doku bölümlerini tamamen kaplamak için slaytlar üzerine dağıtın. Slaytları hemen bir fırında (adım 1.4'te hazırlanan) 40 °C'de 20 dakika inkübe edin ve slaytların nemli hibridizasyon tepsisinde sızdırmaz hale getirildiğinden emin olun. Protokolün geri kalanında doku bölümlerinin kurumasına izin vermeyin.
  3. Kilitli sürgülü rafı çift damıtılmış suyla dolu bir yıkama tepsisine daldırarak hemen 3x durulayın.
  4. Endojen peroksidaz bloğunu, peroksidaz solüsyonunu tamamen kaplayacak şekilde her doku bölümüne damlatarak gerçekleştirin. Slaytları RT'de 10 dakika inkübe edin. Bittiğinde, bölümleri 3x çift damıtılmış suyla durulayın.

5. Prob hibridizasyonu, ve sinyal amplifikasyonu

NOT: Buharlaşmayı önlemek için, inkübasyon adımları sırasında dokuların kurumaması için nem kontrollü tepsinin düzgün bir şekilde kapatıldığından emin olun. 40 °C'de kalmasını sağlamak için yıkama adımı sırasında nem haznesini tekrar fırına yerleştirin.

  1. Üreticinin önerdiği şekilde bir tüpe 1 hacim C2 probunu 50 hacim C1 probuna pipetleyerek C2 probunu ve C1 probunu 1:50 oranında karıştırın. Tüpü birkaç kez ters çevirin. Kullanmadan önce herhangi bir çökeltiyi çözmek için hedef prob karışımını 40 ° C fırında ~ 10 dakika önceden ısıtın.
    NOT: Karışık hedef problar 4 °C'de 6 aya kadar saklanabilir.
  2. Slaytları sudan çıkarın. Durulayın ve doku bölümlerinden fazla suyu çıkarmak için slaytlara hafifçe vurun veya hafifçe vurun. Probu hemen slaytların üzerine dağıtın ve her doku bölümünün herhangi bir hava kabarcığı olmadan tamamen kaplandığından emin olun. Prob karışımını gece boyunca 40 °C'de nem odasında inkübe edin.
  3. Ertesi gün, slaytları fırından çıkarın ve RT'de 5 dakika boyunca 0.5x yıkama tamponu içeren yıkama tepsisine yerleştirin. Yıkama adımını bir kez daha tekrarlayın.
  4. Slaytları yıkama tamponundan çıkarın. Durulayın ve doku bölümlerinden fazla yıkama tamponunu çıkarmak için slaytlara hafifçe vurun veya hafifçe vurun.
  5. Slaytlar üzerinde hibridizasyon tamponu B'de (%20 formamid, 5x SSC, %0.3 litdodesil sülfat, %10 dekstran sülfat, bloke edici reaktifler) kullanıma hazır AMP 1 reaktifini (2 nmol/L) ticari olarak dağıtın, doku bölümünün herhangi bir hava kabarcığı olmadan tam olarak kaplanmasını sağlayın. Nem odasında 40 °C'de 30 dakika inkübe edin. 1.6.3-1.6.4 adımlarını tekrarlayın ve her biri 2 dakika boyunca yıkamayı gerçekleştirin.
  6. Piyasada bulunan AMP 2'yi dağıtın. Doku bölümünün herhangi bir hava kabarcığı olmadan tamamen kaplandığından emin olun. Slaytları nem odasında 40 °C'de 15 dakika inkübe edin. 5.3-5.4 arasındaki adımları tekrarlayın ve her biri 2 dakika boyunca yıkamayı gerçekleştirin.
  7. Piyasada bulunan AMP 3'ü dağıtın. Doku bölümünün herhangi bir hava kabarcığı olmadan tamamen kaplandığından emin olun. Slaytları nem odasında 40 ° C'de 30 dakika inkübe edin. 5.3-5.4 arasındaki adımları tekrarlayın ve her biri 2 dakika boyunca yıkamayı gerçekleştirin.
  8. Piyasada bulunan AMP 4'ü dağıtın. Doku bölümünün herhangi bir hava kabarcığı olmadan tamamen kaplandığından emin olun. Slaytları nem odasında 40 °C'de 15 dakika inkübe edin. 5.3-5.4 arasındaki adımları tekrarlayın ve her biri 2 dakika boyunca yıkamayı gerçekleştirin.
  9. Piyasada bulunan AMP 5'i dağıtın. Doku bölümünün herhangi bir hava kabarcığı olmadan tamamen kaplandığından emin olun. Slaytları nem odasında 40 ° C'de 30 dakika inkübe edin. Adım 5.3-5.4'ü tekrarlayın ve her biri 2 dakika boyunca yıkamayı gerçekleştirin.
  10. Piyasada bulunan AMP 6'yı dağıtın. Doku bölümünün herhangi bir hava kabarcığı olmadan tamamen kaplandığından emin olun. Slaytları nem odasında 40 °C'de 15 dakika inkübe edin. Adım 5.3-5.4'ü tekrarlayın ve her biri 2 dakika boyunca yıkamayı gerçekleştirin.
  11. Algılamadan önce, slaytları 1x TBS-Tween 20'de (%0,05 v/h) bir kez durulayın. Slaytları yıkama tamponundan çıkarın, durulayın ve doku bölümlerinden fazla yıkama tamponunu çıkarmak için slaytlara hafifçe vurun veya hafifçe vurun. Hemen 1x TBS-Tween tamponu ile doldurulmuş yıkama tepsisine yerleştirin.

6. Kanal 1 (C1) hedef sinyali algılama

NOT: Bu, alkalin fosfataz etiketleri içeren 2-plex tespit kitlerinden ( Malzeme Tablosuna bakınız) Kırmızı Alkalin Fosfataz ve Hızlı Kırmızı Kromojen Amplifikasyonu 6 ve kromojenik algılama kullanılarak gerçekleştirilir. Kırmızı bir sinyal oluşturmak için alt tabaka olarak hızlı kırmızı kullanır.

  1. Hızlı RED-B'den Hızlı RED-A'ya 1:60 oranında seyreltme kullanarak hızlı kırmızı (FR) çalışma solüsyonu hazırlayın. İyice karıştırın. Çökeltiyi azaltmak ve daha temiz bir sinyal elde etmek için, kromojen çözeltisini bir şırınga kullanarak 0.45 μm'lik bir MCE membranından süzün.
    NOT: Hızlı RED-B solüsyonunu 5 dakika içinde kullanın. Direkt güneş ışığına veya UV ışığına maruz bırakmayın.
  2. Slaytları TBS-Tween'den çıkarın, durulayın ve doku bölümlerinden fazla tamponu çıkarmak için slaytlara hafifçe vurun veya hafifçe vurun.
  3. Karışık, filtrelenmiş FR solüsyonunu her bir doku bölümüne dağıtın ve her bölümün tamamen kaplandığından emin olun. RT'de 6-8 dakika inkübe edin. Mikroskop altında gözlemleyin.
  4. Slaytları 0.5x yıkama tamponu 2x'te durulayın. Slaytları yıkama tamponundan çıkarın, durulayın ve doku bölümlerinden fazla yıkama tamponunu çıkarmak için slaytlara hafifçe vurun veya hafifçe vurun.
  5. Piyasada bulunan AMP 7'yi dağıtın. Doku bölümünün herhangi bir hava kabarcığı olmadan tamamen kaplandığından emin olun. Slaytları nem odasında 40 ° C'de 10 dakika inkübe edin. Adım 5.3-5.4'ü tekrarlayın ve her biri 2 dakika boyunca yıkamayı gerçekleştirin.
  6. Piyasada bulunan AMP 8'i dağıtın. Doku bölümünün herhangi bir hava kabarcığı olmadan tamamen kaplandığından emin olun. Slaytları nem odasında 40 °C'de 15 dakika inkübe edin. Adım 5.3-5.4'ü tekrarlayın ve her biri 2 dakika boyunca yıkamayı gerçekleştirin.
  7. Piyasada bulunan AMP 9'u dağıtın. Doku bölümünün herhangi bir hava kabarcığı olmadan tamamen kaplandığından emin olun. Slaytları nem odasında 40 ° C'de 30 dakika inkübe edin. Adım 5.3-5.4'ü tekrarlayın ve her biri 2 dakika boyunca yıkamayı gerçekleştirin.
  8. Piyasada bulunan AMP 10'u dağıtın. Doku bölümünün herhangi bir hava kabarcığı olmadan tamamen kaplandığından emin olun. Slaytları nem odasında 40 ° C'de 30 dakika inkübe edin. Adım 5.3-5.4'ü tekrarlayın ve her biri 2 dakika boyunca yıkamayı gerçekleştirin.

7. Kanal 2 (C2) hedef sinyali algılama

NOT: Bu, piyasada bulunan Kahverengi HRP ve DAB Kromojen Kitleri kullanılarak gerçekleştirilir (bkz. Malzeme Tablosu). 2-plex tespitinden elde edilen amplifikasyon 10, yaban turpu peroksidaz etiketlerini içerir ve kahverengi bir sinyal oluşturmak için DAB kullanılarak kromojenik tespit gerçekleştirilir.

  1. DAB sinyalinin en iyi şekilde algılanması için piyasada bulunan kitleri kullanın ve üreticinin talimatlarına uyun (bkz. Malzeme Tablosu). Mikroskop altında gözlemleyin.
    DİKKAT: DAB toksiktir. Bu kimyasalı kullanırken ve atarken uygun önlemleri ve güvenlik yönergelerini izleyin.

8. Boyama ve montaj

  1. Slaytları hematoksilen ile boyayın.
    1. Slaytları çalkalarken slaytları %50 taze filtrelenmiş hematoksilen ile 30 saniye boyunca boyayın. Slaytlar mor renkte görünür. Su berraklaşana kadar slaytları yukarı ve aşağı çalkalarken hemen akan suda durulayın. Doku bölümleri mor kalacaktır.
    2. Daha iyi bir kontrast elde etmek için, karşı lekeli slaytları 1 dakika boyunca lityum karbonat ile doyurulmuş damıtılmış suya yerleştirin. Slaytları çalkalarken akan suda en az 3 kez iyice durulayın. Son durulama için çift damıtılmış su kullanın.
    3. FR organik çözücülere karşı hassas olduğundan, FR ile boyanan slaytların su bazlı montaj ortamı ile kaplanması ve gece boyunca RT'de kurutulması gerekecektir.
  2. Slaytları monte edin.
    1. Su bazlı montaj ortamı ile kaplanmış doku bölümlerinin kuru olduğundan emin olun.
    2. Montaj reaktifi kullanarak kapak kaymadan önce slaytları ksilene batırın. Lamel ve doku bölümü arasındaki hava kabarcıklarını önlediğinizden veya çıkardığınızdan emin olun ve RT'de 16 saat kurumaya bırakın.

9. CellProfiler5 kullanarak RNAscope için kantitatif görüntü analiz protokolü

  1. Kısaca, yazılımın hematoksilen ve FR lekelerini ayrı görüntülere ayıracağından emin olun. İlgilenilen nesneleri tanımlayın ve ölçün: çekirdekler, viryonlar, pozitif hücreler ve toplam FR pozitif boyama. Ölçümleri bir CSV dosyasında saklayın ve analiz edilen görüntüyü kaydedin.
  2. Lekeleri ayıran, orijinal ilgi bölgesini (ROI) ayrı hematoksilen ve FR görüntülerine bölen "Renkleri karıştır" seçeneğini seçin.
  3. Hemosiderin, dövme veya benzeri özellikler analize müdahale ederse, hematoksilen, FR ve DAB ile ikinci bir "Karışımı Kaldır" adımı ekleyin. En yoğun FR piksellerini bulmak için ikinci FR görüntüsünü kullanın. Bu ikinci görüntü, gerçek FR boyama için bir maske olarak kullanılacaktır.
  4. İsteğe bağlı olarak, lekeli görüntüleri eşiklemeden önce düzeltin. Bu ampirik bir karardır ve her zaman gerekli değildir. Pozitif pikselleri seçmek için "IdentifyPrimaryObjects" kullanarak tek tek lekeli görüntüleri eşikleyin.
  5. Üç farklı nesne türünü tanımlayın (virion, virion agregaları, üretken hücre).
    1. Çekirdeklerin hematoksilen ile boyanmış 4-100 piksel (px) çapında nesneler olduğundan emin olun. Eşiklemeden sonra demolleyin ve delikleri doldurun. "IntenseFastRed" nesneler 4-100 piksel çapındadır ve B hücre foliküllerindeki (BCF) foliküler dendritik hücrelerde (FDC'ler) görüldüğü gibi viryonlar, pozitif hücreler ve agrega pozitif boyamayı içerir. Bu görüntü, yanlış pozitifleri (örn. hemosiderin) filtrelemek için kullanılır.
    2. FR küçük pozitiflerin 2-12 piksel çapında nesneler olduğundan emin olun. Bu ölçüm virionları ve vDNA+ hücrelerini içerir. Bu aralığın dışındaki tüm nesneleri atın. Eşiklemeden sonra demolleyin ve delikleri doldurun.
    3. FR büyük pozitiflerin olduğundan emin olun: 9-100 piksel çaplı nesneler. Bu ölçüm, vRNA+ pozitif hücreleri ve agrega pozitif boyamayı içerir. Eşikten sonra dökün. Küçük ve büyük FR pozitif nesnelerin boyutları çakışabilir. Bunlar daha sonraki bir adımda ayrılacaktır.
      NOT: Yazılım (örneğin, Cellprofiler) nesne boyutları için pikseller kullanır ve burada kullanılanlar 0,2510 μm/pikselde (40x) taranan slaytlardan türetilmiştir.
  6. Sonuçları tanımlayın ve ayıklayın.
    1. Herhangi bir nesne tanımlandıktan sonra, virionların, üretken enfekte olmuş hücrelerin ve çekirdeklerin sayısı için sonuçları tanımlayın ve çıkarın.
    2. Yanlış pozitifleri (örn. hemosiderin) kaldırmak için FastRedSmallPositives nesnesini ayarlamak için IntenseFastRed nesnesini maskeleyerek viryonları tanımlayın.
    3. Ardından, pozitif hücreleri tanımlayın ve FR pozitif boyamayı toplayın. FastRedLargePositives'ten yanlış pozitifleri ve virionları, IntenseFastRed ve virion nesne seti ile maskeleyerek kaldırın.
    4. Nuclei ile tekrar maskeleyerek rafine FastRedLargePositives'ten pozitif hücreleri çıkarın. Artık dokunmayan nesneleri bölün ve sonuçları nesne alanına göre filtreleyerek küçük nesneleri kaldırın (≤6 piksel). Bu, çekirdek örtüşmesinin maskelenmesiyle oluşan lekeleri ortadan kaldırır. Sonuç, pozitif hücrelerdir.
    5. Son olarak, toplam FR pozitiflerini tanımlayın. Bu adım, daha büyük bir üst nesnede bulunan nesneleri bulmak için IdentifyTertiaryObjects'i kullanır. Bu durumda, rafine edilmiş FastRedLargePositives nesne kümesi üst öğedir ve pozitif hücreler çıkarılır.
  7. Virionların ve pozitif hücrelerin sayısını sayın.
  8. Toplam pozitif alanı ölçün ve pikselden mm'yedönüştürün 2. İsteğe bağlı olarak, analiz doğrudan sayımlar yerine standart bir hücre ve virion boyutlarının kullanılmasını gerektiriyorsa, viryonların ve pozitif hücrelerin kapladığı alanı mm2 olarak kaydedin.
  9. Pozitif nesneleri orijinal görüntünün üzerine yerleştirin ve sonucu kaydedin.
    NOT: ISH verileri, daha iyi bir anlayış ve qPCR verileriyle karşılaştırmayı kolaylaştırmak için 106 çekirdek (hücre) başına virion sayısı ve 106 çekirdek (hücre) başına üretken olarak enfekte olmuş vRNA+ hücre sayısı ile rapor edilir, ancak sonuçlar mmcinsinden doku alanına göre de rapor edilebilir.

Sonuçlar

Önceki bir el yazması 2,6,7,8,9,10,11'de, vRNA veya vDNA'yı tespit eden yeni nesil ISH platformlarının, SIV/HIV genomunun 5' gag-pol kısmını hedefleyen duyu probları (vDNA) ve genomun 3' yarısındaki genleri hedefleyen antisens problar (vRNA) kullanılarak birleştirilebileceğini bildirdik (vif, vpx, vpr, tat, env ve nef) ve 5' genomundaki TAR elementi (Tablo 1). Bu yaklaşım, transkripsiyonel olarak aktif hücreleri (vRNA+, vDNA+) transkripsiyonel olarak aktif olmayan (varsayılan olarak latent olarak) enfekte hücrelerden veya aynı doku bölümü2'de transkripsiyonel olarak yetersiz provirüsleri (vRNA-, vDNA+) barındıran hücrelerden ayırır (Şekil 1).

figure-results-1
Şekil 1: Aynı doku kesitinde viral RNA ve vDNA tespiti. Akut SIV ile enfekte RM lenf nodunda hem RNA hibridizasyonunun (kırmızı) hem de DNA hibridizasyonunun (kahverengi) kombinasyonu, aynı doku bölümünde vRNA ve vDNA'yı tespit etme yeteneğini gösterir ve transkripsiyonel olarak sessiz vDNA+ vRNA- hücrelerini yerinde tanımlamak için güçlü bir yaklaşım sağlar. Bu şekil Deleage C. ve ark.2'den değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tek Plex RNA/DNAscope Prob Setleri
AdACD Kataloğu #ZZ sayısıAçıklama
SIVmac239 (Anlam Karşıtı)31281183D01065.1'in 1251-9420bp'si (gag, pol, vif, vpx, vpr, tat, env ve nef) dahilinde algılama önleyici prob hedefleme
SIVmac239 (Anlamlı)31407183D01065.1'in 1251-9420bp'si (gag, pol, vif, vpx, vpr, tat, env ve nef) içinde ters ipliği hedefleyen algılama probu
V-HIV1-Clade A (Anti-Sens)41610180HIV-1 Clade A Konsensüsünün 879-7629bp'si dahilinde anti-sens prob hedeflemesi (gag, pol, vif, vpr, tat, rev, vpu, env ve nef)
V-HIV1-Clade A (Anlamlı)42634180HIV-1 Clade A Konsensüsünün 879-7629bp'si (gag, pol, vif, vpr, tat, rev, vpu, env ve nef) içinde ters ipliği hedefleyen algılama probu
V-HIV1-Clade B (Anti-Sense)41611178AF324493.2, HIV-1 Clade B NL4-3'ün 854-8291bp'si (gag, pol, vif, vpr, tat, rev, vpu, env ve nef) dahilinde anti-sens prob hedefleme
V-HIV1-Klad B (Anlamlı)42553178AF324493.2, HIV-1 Clade B NL4-3'ün 854-8291bp'si (gag, pol, vif, vpr, tat, rev, vpu, env ve nef) içinde ters ipliği hedefleyen algılama probu
V-HIV1-Clade D (Anti-Sense)41612176HIV-1 Clade D Konsensüsünün 894-7697bp'si içinde anti-sens prob hedeflemesi (gag, pol, vif, vpr, tat, rev, vpu, env, nef)
V-HIV1-Klad D (Anlamlı)42635176HIV-1 Clade D Konsensüsünün 894-7697bp'si içinde ters ipliği hedefleyen algılama probu (gag, pol, vif, vpr, tat, rev, vpu, env, nef)
Multi-Plex RNA/DNAscope Prob Setleri
AdACD Kataloğu #ZZ sayısıAçıklama
V-SIVmac239-gag-pol-Sense-C1416141-C140D01065.1'in 1251-4093bp'si (gag ve pol) içindeki ters ipliği hedefleyen algılama probu
V-SIVmac239-vif-env-nef-tar-C2 (Anlam karşıtı)416131-C247D01065.1'in 5381-10257bp'si (vif, vpx, vpr, tat, env, nef ve TAR elemanı) içinde algılama önleyici prob hedefleme
V-HIV1-Clade_B-gag-pol-sense-C1444051-C140854-3940bp AF324493.2, HIV-1 Clade B NL4-3 (gag ve pol) içinde ters ipliği hedefleyen algılama probu
V-HIV1-Clade_B-vif-vpr-tat-rev-vpu-env-nef-tar-C2 (Anti-sens)444061-C240AF324493.2'nin 5042-9673bp'si, HIV-1 Clade B NL4-3 (vif, vpr, tat, env, nef ve TAR elemanı) içinde anti-sens prob hedefleme
V-HIV1-Clade_C-gag-pol-sense-C1444021-C148HIV-1 Clade C konsensüs dizisinin 888-5032bp'si (gag ve pol) içinde ters ipliği hedefleyen algılama probu
V-HIV1-Clade_C-vif-vpr- rev-vpu-env-nef-tar-C2 (Anti-anlamlı)444041-C249HIV-1 Clade C konsensüs dizisinin 5078-9698bp'si (vif, vpr, tat, env, nef ve TAR elemanı) içinde anti-sens prob hedeflemesi
V-HIV1-Clade_AE-gag-pol-sense-C1444011-C155890-4812bp AF259954.1, HIV-1 Clade AE (gag ve pol) içinde ters ipliği hedefleyen algılama probu
V-HIV1-Clade_AE-vif-vpr-tat-rev-vpu-env-nef-tar-C2 (Anti-sens)444031-C2575052-9694bp AF259954.1, HIV-1 Clade AE (vif, vpr, tat, env, nef ve TAR elemanı) içinde anti-sens prob hedefleme

Tablo 1: HIV-1 ve SIV'in vRNA ve vDNA'sını hedef alan probların listesi.

Tartışma

Yerinde hibridizasyon, iyi korunmuş bir ortamda bir hedefi lokalize etmek için her kritik adımı uyarlayabilmek için nükleik asit kimyası, hücre biyolojisi ve histoloji hakkında titizlik ve temel bilgi gerektiren titiz bir testtir. Bu tartışmada, doğru ve yorumlanabilir sonuçlar elde etmek için sorun gidermenin çok önemli olduğu kritik adımları vurgulamak istiyoruz.

Dokuların sabitlenmesi ve işlenmesi kritiktir ve testin en iyi sonuçları verebildiğinden emin olmak için önceden ele alınmalıdır. Nötr tamponlu PFA (%4 taze hazırlanmış) fiksatif, dubleks tahlil için en uygunudur. Bununla birlikte, test, uygun kriyoseksiyon sonrası fiksasyon koşulları ile donmuş dokular (OCT) üzerinde de gerçekleştirilebilir.

Doku kesitlerinin ön tedavisi çok önemli bir adımdır. Bu tahlilde iki ön işlem adımı vardır: ilki, ısıya bağlı bir epitop alımıdır (HIER). Bu adım, metilen köprüsü çapraz bağlarının tersine çevrilmesi ve sabit dokularda ihtiyaç duyulan protein yapılarının restorasyonu için önemlidir. Bu işlemin etkinliği zamana, sıcaklığa, geri alma tamponunun türüne ve pH'a bağlıdır. İkinci ön işlem, proteaz kaynaklı bir epitop alımıdır (PIER). Bu adım, antijeni veya nükleotidleri açığa çıkaran peptitleri parçalar ve proteinaz K, tripsin ve pepsin gibi enzimleri kullanır. Bu, hem doku morfolojisine hem de ilgilenilen hedefe potansiyel olarak zarar verebilecek son derece hassas bir adımdır. Enzimin konsantrasyonunun yanı sıra inkübasyon süresi ve sıcaklığı bu süreçte kritik öneme sahiptir. Aşırı sindirim, zayıf çekirdek sınırına ve nicelik belirleme adımlarında zorluğa yol açar. RNA/DNA hedefine optimal erişim ile ilgilenilen dokuya veya hedefe zarar vermeyen ön tedavi koşulları arasında bir denge bulmak çok önemlidir. Her doku tipi, bu ön işlemlerin her birine karşı farklı bir duyarlılık seviyesine sahiptir ve her parametre (enzim konsantrasyonu, zaman, sıcaklık) ampirik olarak test edilmelidir.

Yıkama tamponunun sıkılığı üç ana parametreye dayanır: sıcaklık, tuz ve deterjan konsantrasyonu ve zaman. Yıkama tamponu, bir tuzlu sodyum sitrat tamponudur (SSC) ve tampon içindeki tuz konsantrasyonu, yıkama adımları sırasında sıkılığı kontrol eder. Protokolünde ACD, yıkama tamponunun 0.1x SSC, %0.03 lityum dodesil sülfat nihai konsantrasyonunda kullanılmasını önermektedir. DNAscope ve multipleks optimizasyonu üzerinde çalışırken, yıkama tamponunun 0.05x SSC'lik bir son konsantrasyonda kullanılmasının, DNA sinyalini görselleştirmek için bize daha iyi sonuçlar verdiğini ve duyu probunun gece boyunca inkübasyonundan kaynaklanan spesifik olmayan hedef dışı hibridizasyonun azaltılmasına önemli ölçüde yardımcı olduğunu belirledik.

Tespit yaklaşımı, kromojen (kırmızı veya kahverengi) ve floresan seçimi, teste başlamadan önce doku tipine ve hedefe göre düşünülmelidir. Kırmızı kromojenik yaklaşım hoş bir kontrast verecektir, çünkü kırmızı dokularda doğal olarak bulunmaz. Kahverengi kromojen, kırmızı kromojene benzer sonuçlar verecektir. Bununla birlikte, dokuda bulunan bazı kan bozunma ürünlerinin benzer renge sahip olduğunu ve miktar belirleme sırasında dövme mürekkebinin kahverengi sinyalden ayrılmasının zor olacağını akılda tutmak önemlidir. Bir floresan algılama yaklaşımı, farklı hücresel belirteçlerin net bir şekilde ayırt edilmesine izin verecek ve çoğullama, vRNA ve/veya vDNA'yı barındıran hücreleri fenotiplemek için mükemmel bir test sunacaktır.

Probların özgüllüğünü ve testin kalitesini sağlamak için çoklu kontroller gereklidir. Yeni tasarlanan her prob, bilinen pozitif ve negatif kontrol dokuları veya hücre peletleri üzerinde test edilmelidir. Genellikle hedeflediğimiz diziyi içeren plazmitler üretiriz ve pozitif kontroller oluşturmak için hücre hatlarına transfeksiyon gerçekleştiririz. Her çalışma için bilinen bir negatif doku (HIV veya SIV negatif), sadece prob seyrelticisini içeren bir prob kontrolü ve testin kalitesini ve özgüllüğünü sağlamak için RNaz ile muamele edilmiş bir kontrol ekliyoruz.

Niceleme son derece önemli bir adımdır ve sorulan soruya göre uygun araçlar ve algoritma kullanılarak gerçekleştirilmelidir. Bu yazıda, birden fazla seçeneğin değerlendirilmesinden sonra seçtiğimiz bir görüntü analiz yazılımı (örneğin, Cellprofiler) sunduk. Bu yazılımın ihtiyaçlarımız için en iyi yazılım olduğunu tahmin ettik, ancak kullanılabilecek çok sayıda görüntü analizi yazılım programı var.

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu proje, Sözleşme No'lu kapsamında Ulusal Kanser Enstitüsü, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden gelen Federal fonlarla tamamen finanse edilmiştir. HHSN261200800001E ve Oregon Ulusal Primat Araştırma Merkezi NIH hibe ödülü P51OD011092 (JDE) tarafından. Bu yayının içeriği, Sağlık ve İnsan Hizmetleri Bakanlığı'nın görüşlerini veya politikalarını yansıtmayabilir ve ticari adlardan, ticari ürünlerden veya kuruluşlardan bahsetmek ABD Hükümeti tarafından onaylandığı anlamına gelmez. Dubleks, Advanced Cell Diagnostics'in yardımıyla geliştirilmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
ACD EZ-Batch Kızak sistemi ile ACD HybEZII Hibridizasyon sistemi (110V)ACD321710Hibridizasyon fırını
CAT HematoksilenBiyobakım tıbbiCATHE-GALcolorstain
Şeffaf MontajlıELEKTRON MİKROSKOPİSİ BİLİMLERİ17985-15kırmızı kromojen
Immpact DAB Peroksidaz KitiVektörSK-4105için montaj reaktifiHRP'yi ortaya çıkarmak için kullanılır - ACD kitinde gelen DAB'ın yerini alacak DAB (Kahverengi)
lityum karbonatFisher kimyasalL119-500mavileştirme çözeltisi
paraformaldehitELEKTRON MİKROSKOPİSİ BİLİMLERİ15714-Sdoku fiksasyonu için (%4)
PBSyaşam teknolojisi14190-136
Permount Montaj OrtamıThermoFisher ScientificSP15-100kahverengi kromojen için montaj regaenti
Prolong GoldThermoFisher ScientificP36930floresan
ribonükleazlarDNAscope protokolünde RNAse tedavisi içinThermoFisher Scientific12091039
ribonükleazlarDNAscope protokolünde RNAse tedavisi içinRocheR1003
RNAscope 2.5, 2-plex saptama reaktifiACD322430Kahverengi ve kırmızı kit kromojen tespiti
RNAscope Hedef Alma ReaktifleriACD322000geri alma tamponu
SuperFrost Plus Cam SlaytlarThermoFisher Scientific12-550-17
TBSBOSTON BIOPRODUCTSBM-301-4Lyıkamalar için
TSA Plus Floresan palet kiti (Cy3, Cy5, TMR, Fluorescein)Perkin elmerNEL760001KTHRP Floresan algılama
Tween 20SIGMAP1379-1Lyıkamalar için
XYLENE 20LTThermoFisher ScientificAC422680200
için montaj regaenti bir T1

Kaynaklar

  1. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnosis. 14 (1), 22-29 (2012).
  2. Deleage, C., et al. Defining HIV and SIV Reservoirs in Lymphoid Tissues. Pathogens and Immunity. 1 (1), 68-106 (2016).
  3. Sengupta, S., Siliciano, R. F. Targeting the Latent Reservoir for HIV-1. Immunity. 48 (5), 872-895 (2018).
  4. Churchill, M. J., Deeks, S. G., Margolis, D. M., Siliciano, R. F., Swanstrom, R. HIV reservoirs: what, where and how to target them. Nature Reviews Microbiology. 14 (1), 55-60 (2016).
  5. McQuin, C., et al. CellProfiler 3.0: Next-generation image processing for biology. PLoS Biology. 16 (7), e2005970(2018).
  6. Deleage, C., Chan, C. N., Busman-Sahay, K., Estes, J. D. Next-generation in situ hybridization approaches to define and quantify HIV and SIV reservoirs in tissue microenvironments. Retrovirology. 15 (1), 4(2018).
  7. Deleage, C., Turkbey, B., Estes, J. D. Imaging lymphoid tissues in nonhuman primates to understand SIV pathogenesis and persistence. Current Opinion in Virology. 19, 77-84 (2016).
  8. Estes, J. D., et al. Defining total-body AIDS-virus burden with implications for curative strategies. Nature Medicine. 23 (11), 1271-1276 (2017).
  9. Mavigner, M., et al. Simian Immunodeficiency Virus Persistence in Cellular and Anatomic Reservoirs in Antiretroviral Therapy-Suppressed Infant Rhesus Macaques. Journal of Virology. 92 (18), (2018).
  10. Peterson, C. W., et al. Differential impact of transplantation on peripheral and tissue-associated viral reservoirs: Implications for HIV gene therapy. PLoS Pathogen. 14 (4), e1006956(2018).
  11. Deleage, C., et al. Impact of early cART in the gut during acute HIV infection. Journal of Clinical Investigation Insight. 1 (10), e87065(2016).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Viral RNA TespitiViral DNA TespitiHIV Ara t rmalarSIV Ara t rmalarFFPE DokularYeni Nesil ISHProb Tasar m StratejisiSinyal AmplifikasyonuArka Plan Bask lama
Video yakında
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.