Method Article

Farklı Homojenizasyon Yöntemleri ile Fare Beyin/Omurilikten Alınan Çoklu Hücre Tiplerinin Eşzamanlı Akış Sitometrik Karakterizasyonu

DOI:

10.3791/60335

⸱

November 19th, 2019

 ,  ,  , 
1Dana-Farber/Boston Children's Cancer and Blood Disorders Center, 2Harvard Medical School

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fare beyninden veya omurilikten alınan farklı hücre tiplerini aynı anda belirlemek için bir akış sitometri yöntemi sintometri sitometri sitometri sitometrisi sintometrisi sitometri sintometrisi sintometrisi sintometri Bu yöntem, nörodejeneratif hastalıklarda saf hücre popülasyonlarını izole etmek veya karakterize etmek veya viral vektörlerin veya nano partiküllerin in vivo uygulamasında hücre hedeflemesinin kapsamını ölçmek için kullanılabilir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Viral vektör ve nanomalzeme bilimlerinde son gelişmeler araştırmak veya merkezi sinir sistemi (CNS) işlemek için yeni üstün yaklaşımlar için önünü açmıştır. Ancak, bu teknolojilerin daha fazla optimizasyon cns ve vücutta viral vektörler veya nano tanecikleri uygulanması üzerine hücre özel hedefleme ölçüde hızlı ve aerodinamik belirlenmesine olanak sağlayan yöntemleryararlanacaktır. Burada, fare beyin veya omurilikten izole edilen farklı hücre alt tiplerinin, yani mikroglia/makrofajların, lenfositlerin, astrositlerin, oligodendrositlerin, nöronların ve endotel hücrelerinin basit bir şekilde ölçülmesine olanak sağlamak için akış sitometrisinin yüksek üretim ve çoklama yeteneklerinden yararlanan bir protokol sintometri sitometrisi sitometrisi sitometrisini silyon ile karşılıyoruz. Bu yaklaşımı, hücre verimi, canlılık ve bileşim açısından iki doku homojenizasyon yöntemi arasındaki kritik farklılıkları vurgulamak için uyguluyoruz. Bu, kullanıcıya ilgi çeken hücre türüne ve belirli uygulamaya bağlı olarak en iyi yöntemi seçmesini sağlayabilir. Doku tek hücreli süspansiyon oluşturmak için homojenize olduğundan bu yöntem, anatomik dağılımın analizi için uygun değildir. Ancak, canlı hücrelerle çalışmaya olanak sağlar ve hücre ayrıştırma ile kombine edilebilir, saf hücre popülasyonlarından elde edilen birincil kültürlerin kurulmasından, gen ekspresyonu analizleri ve biyokimyasal veya fonksiyonel analizler nörodejeneratif hastalıklar bağlamında iyi tanımlanmış hücre alt tipleri, üzerine farmakolojik tedavi veya gen tedavisi bağlamında değişen, nörobilimcinin elinde araçların repertuarını genişletebilecek çeşitli uygulamaların önünü açar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gen ve ilaç dağıtım teknolojileri (viral vektörler ve nano tanecikleri gibi) nörodejeneratif hastalıklarda değiştirilmiş belirli moleküler yollar hakkında daha iyi anlayışlar elde etmek ve yenilikçi terapötik yaklaşımların geliştirilmesi için uygulanabilir güçlü bir araç haline gelmiştir1,2,3. Bu araçların optimizasyonu, aşağıdakilerin nicelleştirilmesine dayanır: (1) CNS'deki penetrasyonun farklı yönetim yolları üzerindeki nüfuz derecesi ve (2) belirli hücre popülasyonlarının hedeflenmesi. Histolojik analizler genellikle floresan muhabir genleri veya floresan etiketli nano t....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan tüm yöntemler Dana Farber Kanser Enstitüsü Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır (protokol numarası 16-024).

1. Deney için gerekli çözümlerin hazırlanması

  1. 10x HBSS'yi steril suyla seyrelterek 1x Hank'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) hazırlayın. Çözeltiyi buz üzerinde önceden soğutun. Her numune için en az 25 mL çözelti gereklidir.
  2. 10x steril HBSS 1:10'u yoğunluk gradyan ortamla (yani Percoll) karıştırarak İzotonik Percoll çözeltisini (IPS) hazırlayın. Buzda önceden soğutun.
    NOT: IPS 4 °C'de 30 güne kadar saklanabilir.
  3. Akış sitometrisi (FACS) bloke edici (....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fare beynine ve omuriliğe uygulanan iki farklı homojenizasyon yöntemini (DH karşı PD) karşılaştırdık ve downstream uygulamalarına uygun farklı canlı hücre tiplerinin alınmasında verimliliği test ettik. Bunu yapmak için, aynı örnekte, mikroglia, lenfositler, nöronlar, astrositler, oligodendrositler ve endotel dahil olmak üzere farklı CNS hücre tiplerini karakterize etmek için tasarlanmış 9 renkli akış sitometri panelinden yararlandık.

Beyin ve omurilik dokuları farklı farelerden (n ≥ 6), uzunla.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada fare beyni ve omurilikten en alakalı CNS hücrelerinin eş saflaştırma ve eşzamanlı akış sitometrik analizi için bir protokol açıklıyoruz. Geleneksel olarak, histolojik analizler nano tanecikleri dağılımı veya CNS viral vektörlerin transdüksiyon verimliliği tanımlamak için uygulanmıştır5,13, veya bir patoloji sırasında veya farmakolojik tedavi üzerine belirli hücre tiplerinde meydana gelen morfolojik ve moleküler değişiklikler hakkında anlayışlar sağlamak iç.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Boston Çocuk Hastanesi start-up fonları a.b., ALSA hibe nr tarafından finanse edilmiştir. 17-IIP-343 M.P., ve Ödül No altında Aminotrofik Lateral Skleroz Araştırma Programı ile Sağlık İşleri Savunma Bakan Yardımcısı Ofisi. W81XWH-17-1-0036'dan M.P.'ye. Teknik destek için DFCI Flow Cytometry Core'u kabul ediyoruz.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10X HBSS (Kalsiyum, Magnezyum klorür ve Magnezyum Sülfat içermez)Gibco14185-052
70 mm Hücre SüzgeciCorning431751
ACSA/ACSA2 anti-fare antikoruMiltenyi Biotec130-117-535APC konjuge Sığır
Serumu AlbüminiSigma AldrichA9647-1KG
CD11b sıçan anti-fare antikoruInvitrogen47-0112-82APC-eFluor 780 konjuge
CD31 sıçan anti-fare antikoruBD Bioscience562939BV421 konjuge
CD45 sıçan anti-fare antikoruBiolegend103138Brilliant Violet 510 konjuge
CD90.1 / Thy1.1 sıçan anti-fare antikoruBiolegend202518PE / Cy7 konjuge
CD90.2 / Thy1.2 sıçan anti-fare antikoruBiolegend1005325PE / Cy7 konjuge
Konik Tüpler (15 mL)CellTreat229411
Konik Tüpler (50 mL)CellTreat229422
Dounce Doku Öğütücü seti (Havan ve Havaneli A ve B içerir)Sigma-AldrichD9063-1SET
Fc (CD16 / CD32) Blok sıçan anti-fare antikoruBD Pharmingen 553142
Fetal Sığır SerumuBenchmark100-106
Nöral Doku Ayrışma Kiti (P)Miltenyi Biotec130-092-628
O4 anti fare/sıçan/insan antikoruMiltenyi Biotec130-095-895Biotin konjuge
PercollGE Healthcare10266569steril olmayan reaktif olarak satılmaktadır
PercollSigma65455529steril reaktif (sterilite gerektiren uygulamalar için kullanılmak üzere)
Percoll PLUSSigmaGE17-5445-01çok düşük eser miktarda endotoksin içeren reaktif
StreptavidinInvitrogenS3258Alexa Fluor 680 konjuge

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Deverman, B. E., Ravina, B. M., Bankiewicz, K. S., Paul, S. M., Sah, D. W. Y. Gene therapy for neurological disorders: progress and prospects. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (9), 641-659 (2018).
  2. Teleanu, D., Negut, I., Grumezescu, V., Grumezescu, A., Teleanu, R. Nanomat....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Flow CytometryCell IsolationTissue HomogenizationMouse BrainSpinal CordCell ViabilityCell YieldEnzymatic DigestionAntibody StainingCell Sorting

Related Articles