Method Article

NEMO'nun IKK bağlayıcı alanının üretimi, kristalizasyonu ve Yapı Tayini

DOI:

10.3791/60339

⸱

December 28th, 2019

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Dartmouth College

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NEMO'nun IKK-bağlayıcı alanının x-ışını kristalografisi ile yapı tayinine ilişkin protokolleri açıklıyoruz. Bu yöntemler arasında protein ekspresyonu, saflaştırma ve karakterizasyonunun yanı sıra başarılı kristal optimizasyonu ve proteinin sınırsız formunda yapı tespiti stratejileri yer almaktadır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NEMO, IKK-kompleksini IKKα ve IKKβ ile birleştirerek NF-κB yolunda önemli bir rol oynayan bir iskele proteinidir. Aktivasyon üzerine IKK kompleksi, NF-κB nükleer translokasyonuna ve hedef genlerin aktivasyonuna yol açan IκB moleküllerini fosforilasyona yol açar. NEMO/IKK etkileşiminin inhibisyonu, NF-κB yol aktivitesinin modülasyonu için çekici bir terapötik paradigmaolup, NEMO'yu inhibitörlerin tasarımı ve keşfi için bir hedef haline getirerek. NEMO inhibitörlerinin keşif ve optimizasyon sürecini kolaylaştırmak için, nemo'nun IKK-bağlayıcı etki alanının, apo formunda ve küçük molekül ağırlık inhibitörlerine bağlı olarak proteinin yapı tayinine olanak sağlayacak geliştirilmiş bir yapı tasarladık. Burada, NEMO'nun IKK bağlayıcı alanının tasarımı, ifadesi ve yapısal karakterizasyonu için kullanılan stratejiyi sıyoruz. Protein E. coli hücrelerinde ifade edilir, denatüre koşulları altında çözünür ve üç kromatografik adım ile saflaştırılmış. Yapı belirleme için kristal elde etme protokollerini tartışıyor ve veri toplama ve analiz stratejilerini açıklıyoruz. Protokoller, NEMO ve küçük molekül inhibitörleri komplekslerinin yapı tayininde geniş uygulanabilirlik bulacaksınız.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NF-κB yolu, inflamatuar ve immün yanıt, hücre ölümü veya sağkalım ve çoğalmasından sorumlu hedef genlerin ekspresyonunu düzenlemek için sitokinler, mikrobiyal ürünler ve stres gibi çeşitli uyaranlara yanıt olarak aktive edilir1. Enflamatuar ve otoimmün hastalıklar ve kanser2,3,4,5 gibi patolojiler, NF-κB aktivitesinin modülasyonunu yeni tedavilerin gelişimi için ana hedef haline getiren yolun hiperaktivasyonu ile ilişkili dir6,7.

Özellikle kanonik NF-κB yolu, ikk kompleksinin kinases IKKα ve IKKβ ile montajı için iskele proteini NEMO 'ya (NF-κB temel modülatör8)olan lenforganogenez ve B hücre aktivasyonundan sorumlu kanonik olmayan patikadan ayrılır. IKK kompleksi, bozulmayı hedefleyen IκBα 'nın (κB inhibitörü) fosforilasyonundan sorumludur, nf-κB dimerlerini gen transkripsiyon1 için çekirdeğe çevirmeye serbest düşürür ve bu nedenle NF-κB aktivitesini modüle etmek için inhibitörlerin geliştirilmesi için cazip bir hedeftir.

Araştırmamız, IKK kompleks oluşumunun küçük molekül inhibitörlerinin geliştirilmesi için NEMO'yu hedefleyen NEMO ve IKKβ arasındaki protein-protein etkileşiminin karakterizasyonuna odaklanmaktadır. IKKβ'yı bağlamak için gereken NEMO'nun minimal bağlayıcı etki alanı, 44-111 artıklarını kapsar ve yapısı IKKβ dizisi 701-7459'akarşılık gelen bir peptit ile kompleks olarak belirlenmiştir. NEMO ve IKKβ, NEMO dimer'in ikkβ'nın (701-745) iki sarsıcısını genişletilmiş etkileşim arabirimine sahip uzatılmış açık olukta barındırdığı dört sarnıçlı bir paket oluşturur. IKKβ (734-742), aynı zamanda NEMO bağlayıcı etki alanı (NBD) olarak da bilinir, iki temel triptotreksin (739.741) NEMO cebine derinlemesine gömdükleri bağlama için en önemli sıcak noktayı tanımlar. Karmaşık yapının ayrıntıları, NEMO'yu hedef alan küçük molekül inhibitörlerinin yapı tabanlı tasarımına ve optimizasyonuna yardımcı olabilir. Aynı zamanda, küçük bir molekül veya peptid inbağlanması nemo tam konformasyonel değişim yeniden olacağını zordur (yani, NEMO bobin dimer geniş açılış) uzun IKKβ bağlanması nedeniyle (701-745), kristal gözlenen, ve küçük bir molekül inhibitörü bağlı bağlı NEMO veya NEMO yapısı yapı tabanlı tasarım ve inhibe edici ilaç ve inhibitör için daha iyi bir hedef temsil edebilir.

Ikk bağlayıcı etki alanını kapsayan tam uzunlukta NEMO ve daha küçük kesilme yapıları X-ışını kristalografisi ve nükleer manyetik rezonans (NMR) yöntemleri 10 ile bağlanmamış formda yapı tayini için inatçı kanıtlanmıştır10, hangi bize NEMO IKK bağlayıcı etki geliştirilmiş bir sürümünü tasarlamak için istenir. Nitekim, NEMO (44-111) bağlanmamış formda sadece kısmen katlanmış ve konformasyonel değişim uğrar ve bu nedenle onun dimeric yapısı stabilize etmek için ayarlayın, bobin kıvrım ve istikrar, IKKβ için bağlayıcı yakınlık korurken. Proteinin N-ve C-termini'sinde ideal dimerik bobin dizilerinin11'ini ve dört noktalı mutasyonları üç heptads ekleyerek, tam uzunlukta NEMO12için gözlenen nanomolar aralığına IKK-bağlama afiyeti kurtardı bir yapı tamamen dimeric ve katlanmış nemo-EEAA, bir yapı oluşturduk. Ek bir avantaj olarak, bobin adaptörlerinin (GCN4 dizisine göre) kristalizasyonu kolaylaştıracağını ve sonunda moleküler değiştirme yoluyla X-ışını yapısı nın belirlenmesine yardımcı olacağını umduk. Bobin adaptörleri benzer şekilde hem stabiliteyi artırmak, hem çözüm davranışını iyileştirmek hem de trimerik sarmal bobinler ve antikor parçaları için kristalizasyonu kolaylaştırmak için kullanılmıştır13,14. NEMO-EEAA kolayca ifade edilir ve Escherichia. coli hücrelerinden bir dekolte Histidine etiketi ile saflaştırılmış, çözünür, kararlı bir dimerik bobin katlanmış ve kolayca kristalize, kırınımı ile 1.9 Å. GCN4'ün sıralı sarmal bobin bölgelerinin varlığı, GCN415'inbilinen yapısını kullanarak moleküler değiştirme ile NEMO-EEAA kristallerinden gelen verilerin kademeli olarak ele alınmasına yardımcı olabilir.

Apo-NEMO-EEAA ile elde edilen sonuçlar göz önüne alındığında, burada açıklanan protokollerin, NEMO inhibisyonu ve yüksek afiniteye ilk kurşun inhibitörlerinin yapı tabanlı optimizasyonu için gerekli şartları anlamak amacıyla, küçük peptidler (NBD peptid gibi) veya küçük molekül inhibitörleri varlığında NEMO-AÇAA'nın kristalizasyonuna da uygulanabileceğine inanıyoruz. Birçok sarmal-bobin etki16plastisite ve dinamik doğası göz önüne alındığında, sarmal-bobin adaptörleri kullanımı yapısal belirlenmesine yardımcı daha genel uygulanabilirlik bulabiliriz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Kristalografi için yapı tasarımı

  1. N-terminal heksa-histidin etiketi ve proteaz dekolte sitesi de dahil olmak üzere, T7 promotörü kullanarak E. coli ifade için bir vektör önceki yayın12 olarak NEMO-EEAA dizisini klonlamak.
    NOT: Bu protokolde, n-terminal hekza-histidin etiketi ve Tütün Etch Virüs (TEV) dekolte sitesi10içerecek şekilde değiştirilmiş bir vektör kullandık. Bu vektör protein kristalizasyonu için Onun etiketinin bölünmesini kolaylaştırır ve istenilen protein dizisi başlamadan önce GSW artıklarının sadece kısa uzantısı bırakır. Bunun türetildiği vektör ve alternatif vektörler Malzeme Tablosu'ndalistelenmiştir. Bu protokolde, orijinal NEMO(44-111) dizisinde sonraki değişiklikler, daha önce10'da açıklandığı gibi, yan yönelimli mutagenezi kullanılarak adım adım olarak getirilmiştir. Başlangıçta ideal sarmal bobin adaptörleri (en az üç heptads uzunluğunda) n-terminal veya C-terminal sonuna veya her ikisine de ekleyen NEMO bobindim stabilize etmeye çalıştı. Çift sarmal bobin önceki kristalizasyon denemelerinden en umut verici ve daha sonra daha önce açıklandığı gibi kristalizasyon geliştirmek için mutasyonlar tanıtan modifiye edildi12.

2. Onun6 etiketli NEMO-EEAA büyük ölçekli ifade

  1. Yapıyı BL21(DE3) yetkin hücrelere dönüştürün. -80 °C'de bir hücre gliserol stoku olarak saklayın.
  2. Gün 1 – Bir hücre başlangıç kültürü hazırlayın. 125 mL Erlenmeyer şişesinde 20 mL Müthiş Broth çözeltisi ve 20 0 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 000 00 00 00 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 Hücre gliserol stok (BL21 (DE3) vektör ile dönüştürülmüş yetkili hücrelerin -80 °C depolama) birkaç mikrolitre ekleyin.
  3. 10 mL başlangıç kültürünü bir gecede 37 °C, 220 rpm 'de (yaklaşık 15 saat) çalkalayın.
  4. Gün 2 - Başlangıç itibaren, Bir OD600 = 0.1 250 mL Terrific Broth seyreltmek. 100 μg/mL'lik son konsantrasyona ampisilin ekleyin. OD600 = 0,8-1.0'a büyütün.
    1. Izopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 500 μM ekleyin ve 37 °C'de 4 saat büyüyün.
    2. 4 h. Kültür'den sonra indüklenen kültürün600'ü ölçün.

3. Onun6 etiketli NEMO-AÇAA Arınma

  1. Hücre kültürünü 4 °C'de 20 dk için 3.800 x g'de döndürün.
  2. Hücre pelet kaydedin ve orta atın.
    NOT: Hücre peleti daha sonra arınmak için bu noktada -20 °C'de kaydedilebilir ve saklanabilir.
  3. 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM imidazol, 2 mM MgCl2, 0,5 mM fenilmetilsülsülil florür, 2 mM Dithiothreitol (DTT) içeren 40 mL lysis tamponundaki hücreleri yeniden askıya alın.
    NOT: Kullanılan Nikel immobilize metal iyon afinite kromatografisi (IMAC) kolonu 2 mM DTT ile uyumludur. Alternatif olarak, 0.2 mM tris(2-karboksitil)fosfin (TCEP) kullanılabilir.
  4. Yeniden askıda kalmış hücreleri 20-25 mL'lik iki alana bölün.
  5. Lyse Hücreleri Fransız basını kullanarak (yaklaşık basınç 25.000 psi), her aliquot için 2-3 kez tekrar (soğuk odada).
    NOT: Alternatif olarak, hücreler sonication tarafından lysed olabilir (bu protokolde test edilmemiştir).
  6. 8 M son konsantrasyoniçin hücre lysate üre ekleyin, en az 2 saat veya bir gecede kadar bir sallanan platformda kuluçkaya izin. Bu ve aşağıdaki tüm arıtma adımları, diyaliz hariç, oda sıcaklığında yapılabilir.
  7. 3. Gün – Lysate'yi ultracentrifuge tüplere ve denge ağırlığına aktarın, böylece tüpleri en az 3/4 doluya kadar doldurun. 25 °C'de 45 dk için 125.000 x g lysate spin. Sütuna yüklemek için 100 mL kabıiçine supernatant decant.
    NOT: 4 °C'de santrifüj etmek ürenin düşmesine neden olur.
  8. Hızlı sıvı kromatografi sisteminde, 5 mL/dk'da 25 mL ultra saf H2O ile IMAC 5 mL kolondan etanol çıkarın, 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 500 mM imidazol, 2 mM DTT, pH 8.0, 20 mM Tris içeren 25 mL bağlayıcı tampon, 150 mM NaCl, 10 mM imidazol, 2 mM DTT, 8 M üre, p.8H içeren 25 mL'lik elüsyon tamponu takip eder.
  9. IMAC sütunüzerine 3 mL/dk'da inküre edilmiş süpernatant yükleyin ve akışı toplayın. 3 mL/dk'da bağlayıcı arabellekile 10 sütun hacmi için sütunu yıkayın.
  10. 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM imidazol, 2 mM DTT, pH 8.0 içeren, 3 mL/dk'da 20 sütun hacmi için yeniden kattamponu ile sütun üzerine NEMO-EEAA yapılayın.
  11. NEMO-EEAA'nın 10 ila 500 mM Imidazole'den 12 sütunluk hacim degradesi üzerinden, kesir toplama plakasında (1 mL kesir) tüm eluate'yi toplayarak degrade elüasyonunu gerçekleştirin.
  12. İki sütun hacmi için 500 mM imidazol de elütion devam, toplamaya devam.
  13. Elütion fraksiyonlarında NEMO-EEAA varlığını belirlemek için sodyum dodecyl sülfat (SDS)- poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) kesirleri çalıştırın.
    NOT: Biz% 10 akrilamid, MES tampon kullanılır.
  14. Saf hedef protein içeren havuz fraksiyonları.
  15. Bradford tsay17tarafından protein konsantrasyonu ölçün.
    NOT: Bu etiket dekolte sit miktarını tahmin etmek için gereklidir.

4. Onun6 etiket dekolte ve arıtma

  1. TEV'i 1:10 ağırlık oranına ekleyin:NEMO-EEAA proteini 6 etiketini cleave. TEV proteaz evde arınmış oldu.
    NOT: Tam bölünme için gereken TEV miktarını, zamanı ve sıcaklığı ayrı ayrı optimize edin.
    1. Ekspres TEV protaz, S219V mutant18 BL21(DE3)-RIL hücreleri ve daha önce açıklandığı gibi arındırMak19. Kısaca adım 2 açıklandığı gibi hücreleri büyümek, Fransız basın tarafından lyse ve bir IMAC sütun kullanarak arındırın. Son proteini 25 mM sodyum fosfat tamponu, pH 7.8, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM DTT, %20 v/v gliserol de saklayın.
  2. Dekolte ye izin vermek ve sonraki arınma için numuneden fazla imidazol çıkarmak için numuneyi bir gecede (yaklaşık 15 saat) 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM DTT, pH 8.0'de diyalize sürün.
  3. 4. Gün – Numuneyi diyalizden çıkarın. Dekoltenin tamamlandığından emin olmak için TEV dekoltesinden numunenin Bir SDS-PAGE jelini çalıştırın.
  4. Hızlı sıvı kromatografi sisteminde, 5 mL/dk'da 25 mL ultrasaf H2O ile IMAC 5 mL kolondaki etanolçıkarın, 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 500 mM imidazol, 2 mM DTT, pH 8.0 içeren 25 mL elüsyon tamponu, ardından 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM imidazol, 2 mM DTT, pH 8.0 içeren bağlama tamponu takip eder.
  5. Kolon1 mL/dk'da TEV-cleaved NEMO-EEAA ile yükleyin. Cleaved NEMO-EEAA akış-through elute olacaktır: 96 iyi kesir toplama plaka (1 mL fraksiyonları) toplamak. Kolonu 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 mL/dk'da 10 mM imidazol olmak üzere beş kolon hacmi nde yıkayın ve kesir toplama plakasında toplamaya devam edin.
  6. Elute TEV ve amcaları20mM Tris, 150 mM NaCl, 500 mM imidazol, 2 mM DTT, pH 8.0 olmak üzere 3 sütun hacmine sahip 6-NEMO-EEAA'sını 50 mL'lik bir şişede toplayarak alıç larını topladılar.
  7. Yarık NEMO-EEAA varlığını belirlemek için akış kesirlerinin SDS-PAGE jelini çalıştırın.
  8. Yarık NEMO-EEAA yapısı içeren havuz akışı fraksiyonları ve 5 mL'ye kadar karıştırılmış hücreli konsantratörü kullanarak konsantre olun. Membran molekül ağırlık kesme (MWCO) = 3 kDa.
  9. 3 kDa MWCO membran kullanarak, 2 L 20 mM Tris, 100 mM NaCl, 2 mM DTT, pH 8.0 2 saat. Diyaliz tamponunu gece diyalizi için 2 L taze diyaliz tamponuna (yaklaşık 15 saat) 4 °C'de değiştirin.
  10. 5. Gün – Diyaliz numunesinin 5 mL'ini 1 60 cm'lik bir boyut dışlama kromatografisi (SEC) üzerine 1mL/dk'da 2 mM Tris, 100 mM NaCl, 2 mM DTT, pH 8.0 olarak yükleyin. Örnek hacmine bağlı olarak ek sütunlarla tekrarlayın.
  11. Dimerik NEMO-EEAA'ya karşılık gelen kesirleri birleştirin.
    NOT: NEMO-EEAA 60-65 mL arasında, dimerik sarmal bobinin uzun doğası nedeniyle, daha büyük bir moleküler ağırlık proteinine karşılık gelen elutes.
  12. 113 μM (1,65 mg/mL) son konsantrasyona bir karıştırılan hücre konsantratörü ve MWCO = 3 kDa membran kullanarak konsantre olun.
  13. Aliquot protein ve 4 ° C (1 ay boyunca istikrarlı) de saklamak.

5. Seyrek matris taraması

NOT: Protokol, ticari olarak kullanılabilen ekranlar kullanarak kristalizasyon denemeleri yapar ve bir kristalizasyon robotu kullanarak oturma damlası deneyleri kurar. Kristal görüntüler bir görüntüleyici tarafından otomatik olarak toplanır.

  1. Ticari olarak mevcut seyrek matris ekranlar kullanarak (Malzeme Tablosubakınız), pipet 60 μL seyrek matris çözeltisi her içine 96 kuyular 2 damla oda kristalizasyon plaka oturma damla buhardifüzyon (rezervuar çözeltisi).
  2. Robotik bir damla ayarlayıcı kullanarak, 1.65 mg/mL'de 1.65 mg/mL'de 100 nL protein çözeltisi dağıtın ve rezervuar çözeltisi damla 1'de 200 nL'lik son bir hacim için; sonra 66 nL protein çözeltisi ile 134 nL rezervuar çözeltisi 200 nL'lik son hacim için damla 2 (1:2 oran).
  3. Dağıtımından hemen sonra 3 inç genişliğinde sızdırmazlık bandı kullanarak plakayı kapatın.
    NOT: 2-3 dk'dan daha uzun süre atmosfere maruz bırakılırsa damlalar kurur.
  4. Tepsileri 20 °C'de kristalize görüntüleyici deposunda saklayın ve iki gün sonra başlayan kristal varlığı için otomatik olarak toplanan görüntüleri kontrol edin.
    NOT: Kristalizasyon taraması yapı optimizasyonuna paralel olarak devam etti. Aşağıdaki koşullarda oluşan ilk kristaller (Malzeme Tablosundalistelenen ticari ekranlar): a) 0,1 M Tris, pH 8.0, 30 % v/v polietilen glikol (PEG) MME 550, %5 poli-γ-glutamik asit, 200-400 kDa düşük molekül ağırlıklı polimer (PGA -LM); b) 0,1 M Tris, pH 7.8, %20 w/v PEG MME 2k, %5 PGA-LM; c) 0,1 M Tris, pH 7.8, 20% w/v PEG 3350, %5 PGA-LM. Seyrek matris ekran kristalleri kötü kafes tekdüzelik olacak; bu nedenle, çapraz polarize görüntüleme kullanarak kötü görünecektir. Kristallerin protein içerdiğinden emin olmak için UV görüntülemeyi kullanın. Aşağıdaki tohum stok üretim adımı nihai kırınım kalite kristalleri elde etmek için gereklidir.

6. Tohum stok üretimi

NOT: Tohum üretimi için kristalleri 0,1 M Tris pH 8.0, %5 PGA-LM, %3.6 w/v PEG 20k olarak tekrarlıyoruz. Ancak, kristaller yüksek mozaiklik gösterecektir ve bu aşamada veri toplama için uygun değildir.

  1. Tohum üretimi için bir kit kullanarak, kristal mevcut ile tüm damla borulama tarafından tohum stok hazırlamak ve sağlanan şişe kristalizasyon durum çözümü 50 μL içine yerleştirin.
  2. Girdap 3 dakika için tohum stok, 20 s ve 10 s kapalı nabız.
  3. Seri olarak 1:10'luk artışlarla 1:10.000'e kadar seyreltin. Daha fazla kullanım için tüm seyreltmeleri 4 °C'de saklayın.

7. İnce ekranlar

  1. Tris, PGA-LM ve PEG koşullarını değişen ince ekranlar tasarlayın. Tek tek tepsiler için PEG uzunluğunu değiştirin.
    NOT: NEMO-EEAA'nın yapı tayini için kullanılan kristali üreten ince ekran aşağıdaki koşulları kullanmıştır: 0.1 M Tris pH 8; PGA-LM 1-12 sütunlarında %8 ile %0 arasında değişmektedir. A-H satırları farklı PEG'leri tarayarken, konsantrasyonları 1-12 sütunlarında aşağıdaki gibi değişmektedir. C: PEG 200 (%0-40 v/v); B: PEG 400 (%0-40 v/v); C: PEG MME 500 (%0-40 v/v); D: PEG 1000 (%0-30 w/v); E: PEG 3350 (%0-30 w/v); F: PEG 6k (%0-30 w/v); G: PEG 10k (%0-20 w/v); H: PEG 20k (%0-20 w/v). Kristal iyi H4 (%5.45 w/v PEG 20k, %5.8 w/v PGA-LM) çıktı. Bu protokolde, bir protein kristalografi ekran oluşturucu sıvı işleyici ekranlar oluşturmak için kullanılmıştır.
  2. 1:1.000 tohum seyreltme 1:25 hacim oranı bir protein stok tohum.
    NOT: NEMO-AÇAA konsantrasyonu biraz düşecek, ancak kristaller yine de oluşacaktır.
  3. 1:10.000 tohum seyreltme, aynı 1:25 hacim oranı kullanarak tekrar adım 2.
  4. Damla ayarlayıcıyı kullanarak, 1.65 mg/mL'de 100 nL protein çözeltisi dağıtın, tohum stokunun 1:1.000 seyreltilmesi ile 200 nL'lik son hacim için 1'de damla rezervuar çözeltisi 1.1 oranına. Damla 2 için tekrarlayın, ancak 1:10.000 tohum stok mevcut seyreltme ile.
  5. Dağıtımından hemen sonra 3 inç genişliğinde sızdırmazlık bandı kullanarak plakayı kapatın.
    NOT: 2-3 dk'dan daha uzun süre atmosfere maruz bırakılırsa damlalar kurur.
  6. Tepsileri 20 °C'de görüntüleyici deposunda saklayın ve kristal varlığı için iki gün sonra toplanan görüntüleri kontrol edin.
  7. Kafes tekdüzeliği için çapraz polarize görüntüleyici ile kristalleri kontrol edin, aşağıdaki tepsileri kurmak için tek koşullar için seçin.

8. Veri toplama için kristallerin üretimi

  1. Tris, PGA-LM ve PEG koşulu etrafında tek koşullu ekranlar tasarlayın ve çapraz polarize görüntüler le analiz edildiğinde tek tip kristaller ve mümkün olan en büyük kristaller üretin.
    NOT: Bu koşullardan kristaller şekil düzensiz, çoğunlukla dikdörtgen ince levhalar vardır. Kristalin kenarlarının iyi tanımlandığı ve mümkün olan en yüksek kalınlığa sahip olduğu bir koşul seçmek önemlidir.
  2. Elle kristalizasyon durumu 20 mL olun.
  3. Çok kanallı pipettor kullanarak, 2 damla haznesinde kuyu başına 60 μL, oturma damla sıcağa veyafüzyoniçin 96 iyi kristalizasyon plakası dağıtın.
  4. Adım 6.2'de açıklandığı gibi tohum stoku hazırlayın.
  5. Adım 6.3'te açıklandığı gibi proteini dağıtın.
  6. Dağıtımından hemen sonra 3 inç genişliğinde sızdırmazlık bandı kullanarak plakayı kapatın.
    NOT: 2-3 dk'dan daha uzun süre atmosfere maruz bırakılırsa damlalar kurur.
  7. Tepsileri 20 °C'de görüntüleyicide saklayın ve her gün kristal varlığı için görüntüleri kontrol edin.
  8. Veri toplama için kristalleri seçmek için kafes tekdüzeliği için kristallerin polarize görüntülerini kontrol edin.

9. Kriyo-koruyucu tayini

  1. Kriyo-koruyucuları test etmek için, kristalizasyon koşullarına karşılık gelen ancak her bileşenin %30, %20, %10 ve %5 daha yüksek konsantrasyonunu içeren stok çözümleri oluşturun. Kriyo-koruyucu hacmin eklenmesi, kristalizasyon koşullarıyla aynı olan bileşenlerin nihai konsantrasyonuna neden olur.
    NOT: 0,1 M Tris kristalizasyon koşulu için bir kriyo-koruyucuyu hacim olarak %30 konsantrasyonda test etmek için, kriyo-koruyucuyu eklemeden önce 0,143 M Tris'lik bir stok çözeltisi ile başlayın.
  2. Kriyo-reaktif kitinden, orijinal kristalizasyon koşullarında %30 kriyo-koruyucu nihai konsantrasyon için kristalizasyon durumu stok çözeltisinin %70'inde kriyo-kondisyon hacmine göre %30'unu karıştırarak kriyo-koruyucu test için 10 μL numune oluşturun. Iyice karıştırın.
    1. 10 μL'lik pipet kullanarak, 5 μL test kriyo korumalı çözelti alın ve pipet ucunu sıvı nitrojene daldırın. Buz gözlenirse, atın.
    2. Tüm kriyo-koruyucuları %30 oranında test edin. Başarılı çözümler için işlemi %20, sonra %10 ve kriyo-koruyucunun %5'i olarak tekrarlayın.
    3. Kriyo-koruyucunun en küçük yüzdesi ile başarılı kriyo-koruyucu çözeltiyi kullanarak, mevcut kristallerle bir test damlasına 0,5 μL'lik çözelti ekleyin. Mikroskop altında gözlemleyin, belirsiz değilse, kristalin bu durumda ne kadar süreceğini zamanlama.
      NOT: Bu kristaller sadece test içindir ve atılır. NEMO-EEAA için %12 1,2-propanediol optimal kriyo-koruyucu çözümdür. Kriyo-koruyucu çözeltinin yaklaşık 100 nL'lik kristal damlasına eklendiğinde karşılaşacağı seyreltme %12'dir, yaklaşık %10'luk bir 1,2-propanediol konsantrasyonu için.

10. Kristal döngü

  1. Kristalleri synchrotron'a sevkiyatdan 1-2 gün önce döngü.
    NOT: Kristaller yaklaşık 60-100 μm çapında olacaktır: 0.05 - 0.10 mm döngüler döngü için idealdir.
  2. Kuyunun tepesindeki bandı kes.
  3. %12 1,2-propanediol kriyo-koruyucu içeren 0,5 l kristalizasyon çözeltisini doğrudan kuyuya ekleyin.
    NOT: 1,2-propanediol'ün son konsantrasyonu şu anda yaklaşık %10'dur, 100 nL damla çözeltisi seyreltilmesi (buhar difüzyonuna bağlı olarak ilk 200 nL'den yaklaşık düşme hacmi nin azaltılması).
  4. Kristali kuyudan çıkar.
    NOT: Kristaller genellikle kuyunun dibinde büyürler ancak döngüden hafif bir dürtme ile yerinden çıkarlar. Bir kez yerinden, döngü.
  5. Kriyo-döngüler içeren kristali sıvı N2'yebatırılmış disklerde saklayın.
  6. Bu diskleri, senkrotrondaki X-ışını kırınımı için sevkiyata hazır olana kadar Dewar şişesinde sıvı N2'de saklayın.

11. Veri toplama

  1. X-ışını kırınım verilerini toplayın. Bu protokolde, AMX beamline (ID: 17-ID-1), Ulusal Synchrotron Işık Kaynağı II'yi kullanın.
    NOT: Veriler sitede toplandı, ancak uzaktan toplanabilir. Çapraz polarize görüntülerde kafes tekdüzeliği gösteren kristal bölgesinde veri toplamak. Kristal goniyometrede dönerken veri toplamanın kristalin "zayıf" bölgelerini içermeyecek şekilde kristalleri döngüye yerleştirin. En iyi çözünürlüğü sağlayan veriler, yaklaşık 5 x 5 μm boyutunda bir kristalin uzantısı nın kenarındaki toplamadan elde edilebistir. 20toplamak için kristal üzerinde en iyi alanları belirlemek için rastering kullanın.

12. X-Ray veri işleme

  1. Uzay grubunu, birim hücreyi ve çözücü içeriğini belirlemek için XDS IDXREF programı ile toplanan en yüksek çözünürlüğe (1,8 Å) veri kümesini işle.
  2. XDS INTEGRATED programını kullanarak verileri tümleştirin.
  3. StaranisO Server kullanarak XDS XSCALE programından gelen yoğunlukları, veriler için kırınım sınırı yüzeyi için 1,2 I/σI kesme ortalamasını kullanarak ölçeklendirilir.
    NOT: Veriler gerçek elipsoid de kesilmez. 1.2 kesmenin I/σI üzerindeki tüm verileri saklar. Küresel bütünlük için hesaplanan verilerüzerindeki istatistikler, küresel olmayan kesilme nedeniyle zayıf olacaktır. Eliptik bütünlük% 88 ile en yüksek çözünürlükleri oldu: 1.88 Å, 2.10 Å ve 2.55 Å a * boyunca, b * ve c ekseni, sırasıyla.

13. Yapı çözümü

  1. PHENIX22'deMRage21 kullanarak moleküler değiştirme için bir arama modeli olarak GCN4 (PDB: 4DMD)15'in X-ışını yapısını kullan. 4DMD yapısı MRage'de bir "topluluk" olarak tanımlandı ve MRage çözümü, dimer'deki her iki zincir için de arama modeline homolog olan NEMO-EEAA'nın N-terminal sarmal bobin adaptörüne karşılık gelen yapı kısmını başarıyla inşa etti.
    NOT: PHASER'de aisotropi düzeltmesini kapatın, yoksa veriler daha da küçültülecektir.
  2. Autobuild23 phenix ve manuel bina (2Fo-Fc ve Fo-Fc haritaları kullanarak, Coot24) yapının geri kalanını oluşturmak için art arda tur yararlanın.
  3. Coot24kullanarak 2Fo-Fc ve Fo-Fc haritalarına dayalı olarak modelde hala eksik olan artıkları elle oluşturun.
    NOT: Son aşamada her monomer için 4 N-terminal kalıntısı ve 4 C-terminal kalıntısı inşa edilebildi. Sidechain yerleşimi de gerektiğinde el ile ayarlandı.
  4. PHENIX ve yapının %10 ihmalini kullanarak bileşik bir ihmal haritası hesaplayın.

14. Yapı iyileştirme

  1. PHENIX Rafine ile yapıları hassaslaştırın. İlk iyileştirmeleri toplu çözücü ve stereokimya ağırlıklarına karşı çalıştırın, rmsbond ve RMSangle kısıtlamalarını sırasıyla 0,01 ve 1,0'a kadar gevşetin. Bireysel B faktörleri, TLS parametreleri ve Doluluklar üzerinde iyileştirmeye devam edin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NEMO'nun IKK bağlayıcı alanının klonlanması, ifade lenmesi ve arınması.
Bu çalışmada, kırınım kalitesinde kristaller üreten NEMO-EEAA 'nın(Şekil 1 A)son sekansını elde etmek için, N- ve c-terminus'taki bobin bağlaç adaptörleri, C76A, C95S mutasyonları ve E56A, E57A mutasyonları da dahil olmak üzere tüm ara yapıların ifade ve karakterizasyonu yer almıştır. Şekil 1B, Şekil 1

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NEMO'nun bağlanmamış formda kristalizasyon girişimleri, tam uzunlukta protein ve IKK bağlayıcı etki alanını kapsayan çeşitli kesilme yapıları da dahil olmak üzere başarısız oldu. DAIRESEL dikromizm, NMR spektroskopisi ve floresan anisotropi ile NEMO IKK bağlayıcı etki alanı (kalıntı 44-111) bizim biyofiziksel karakterizasyonu, ikkβ bağlamak mümkün olsa da, konformasyonel değişimbir devlet var olduğunu gösterdi 9,10. Yaklaşımımız, NEMO'nun ikk-bağlayıcı alan adını...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir rakip çıkarları beyan.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prof. Dr. Madden'e bu proje boyunca yaptığı birçok faydalı tartışma için teşekkür ederiz. Prof. Dr. D. Bolon'a optimize edilmiş GCN4 sarmal bobinini içeren plazmidin hediyesi için teşekkür ederiz. Dr. B. Guo'ya NEMO plazmidleri için teşekkür ederiz. Christina R. Arnoldy, Tamar Basiashvili ve Amy E. Kennedy'ye prosedürü gösterdikleri için teşekkür ederiz. BioMT Kristalografi Çekirdek Tesisi ve Dartmouth'taki Biyokimya ve Hücre Biyolojisi bölümlerine kristalografi ekipmanlarının ve BioMT personelinin desteği için teşekkür ederiz. Bu araştırma Ulusal Synchrotron Işık Kaynağı II, bir ABD Enerji Bakanlığı (DOE) Ofis Bilim Kullanıcı Tesisi Brookhaven Ulusal Laboratuvarı tarafından DoE Ofis için sözleşmeli No altında işletilen AMX ışın hattı kullanılır. DE-SC0012704. NSLS II personeline desteklerinden dolayı teşekkür ederiz. Bu çalışma NIH'nin R03AR066130, R01GM133844, R35GM128663 ve P20GM1131332 ve Munck-Pfefferkorn Roman ve İnteraktif hibeleri ile finanse edilmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
%20 w/v γ-PGA (Na+ formu, LM)Moleküler BoyutlarMD2-100-150NEMO-EEAA'nın ince ekran kristalizasyonu için
3.5 kDa MWCO Diyaliz MembranSpektrumları / Por132724İmidazolün diyaliz giderimi için
Amicon Karıştırılmış HücreMillipoz SigmaUFSC 05001Protein konsantrasyonu için
Amonyum KlorürMillipore SigmaG8270Minimum medya etiketlemesi için
BenzonazNükleaz Millipore Sigma9025-65-4Nükleik asidin sindirimi için
BL21-CodonPlus (DE3)-RIL Yetkili HücrelerAgilent TeknolojileriModeli: 230245TEV ifadesi
CryoProHampton ResearchHR2-073Kriyo-koruyucular kiti
D-Glikoz (Dekstroz)Millipore SigmaA9434için Minimum medya etiketleme
Difco Müthiş EtSuyu ThermoFisherDF043817Kültür büyümesi için
Dithiothreitol > %99GoldbioDTT25Disülfidlerin azaltılması için
E. coli: Rosetta 2 (DE3)Novagen71400-3Etiketlenmemiş NEMO-EEAA
FORMULATORFormulatrixSıvı işleyici / elek oluşturucu
HCl & ndash; 1.0 M ÇözümHampton ResearchHR2-581pg'nin ince elek kristalizasyonu için
GE Healthcare28989333Boyut dışlama saflaştırması için
HisTrap HP 5 mL sütunGE Healthcare17524802His etiketli NEMO-EEAA
HT 96 MIDAS'ınMoleküler BoyutlarMD1-59NEMO-EEAA'nın seyrek matris taraması için
HT 96 Morföz MolekülerBoyutlarMD1-46seyrek matris taraması için
His-trap kolonundan elüsyon için
İzopropil-beta-D-tiyogalaktozitGoldbioI2481C5Kültürlerin indüksiyonu için
MRC2 kristalizasyon plakasıHampton ResearchHR3-083Kristalizasyon plakası
NT8 - Damla AyarlayıcıFormulatrixKristalizasyon
pET-16bMillipore Sigma69662NEMO-EEAA'nın klonlanması için
pET-45bMillipore Sigma71327NEMO-EEAA
Fenilmetilsülfonil florürklonlaması için ThermoFisher36978Proteazların inhibisyonu için
Ultrasantrifüj Rotor Tip 45'te kullanım için Polikarbonat Şişe TiBeckmann Coulter339160Ultrasantrifüj şişesi
Polietilen Glikol 20.000Hampton ResearchHR2-609NEMO-EEAA
pRK793'ün (TEV)AddgenePlasmid 8827TEV üretimi için
QuikChange XL IIAgilent Technologies200522Sahaya yönelik mutajenez
Gerekli Kapak Montajı:Beckmann Coulter355623Ultracenttrifuge şişe kapağı
KAYA GÖRÜNTÜLEYICIFormulatrixKristalizasyon Görüntüleyici
Tohum Boncuk KitiHampton ResearchHR2-320Tohum üretimi
Sodyum Klorür > %99Millipore SigmaS9888Saflaştırma çözeltilerinin tamponlanması için
TCEP (Tris (2-Karboksietil) fosfin Hidroklorür)GoldbioTCEP1İndirgeyici ajan
Berkeley EkranRigakuMD15-BerekelyNEMO-EEAA'nın seyrek matris taraması için
PGA EkranMoleküler BoyutlarıMD1-50NEMO-EEAA
Tris &ndash'ın ince ekran kristalizasyonu için 1.0 M ÇözeltisiHampton ResearchHR2-589NEMO-EEAA Ultra saf Tris Tamponunun ince ekran kristalizasyonu için
(toz format)Thermofisher15504020Saflaştırma çözeltilerinin tamponlanması için
ÜreThermoFisher29700NEMO-EEAA'nın denatürasyonu için
NEMO-EEAA HiLoad 16/600 Superdex 75 saflaştırılması için NEMO-EEAA İmidazol ThermoFisher 288-32-4'ün ince elek kristalizasyonu için

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gilmore, T. D. Introduction to NF-kappaB: players, pathways, perspectives. Oncogene. 25 (51), 6680-6684 (2006).
  2. Bassères, D. S., Baldwin, A. S. Nuclear factor-kappaB and inhibitor of kappaB kinase pathways in oncogenic initiation and progression. Oncogene. 25 (51), 6817-6830 (2006).
  3. Hayden, M. S., West, A. P., Ghosh, S. NF-kappaB and the immune response. Oncogene. 25 (51), 6758-6780 (2006).
  4. Lee, T. I., Young, R. A. Transcriptional regulation and its misregulation in disease. Cell. 152 (6), 1237-1251 (2013).
  5. Courtois, G., Gilmore, T. D. Mutations in the NF-kappaB signaling pathway: implications for human disease. Oncogene. 25 (51), 6831-6843 (2006).
  6. Zhao, J., et al. Development of novel NEMO-binding domain mimetics for inhibiting IKK/NF-κB activation. PLoS biology. 16 (6), 2004663(2018).
  7. Zhang, Q., Lenardo, M. J., Baltimore, D. 30 Years of NF-κB: a blossoming of relevance to human pathobiology. Cell. 168 (1-2), 37-57 (2017).
  8. Jin, D. Y., Jeang, K. T. Isolation of full-length cDNA and chromosomal localization of human NF-kappaB modulator NEMO to Xq28. Journal of Biomedical Science. 6 (2), 115-120 (1999).
  9. Rushe, M., et al. Structure of a NEMO/IKK-associating domain reveals architecture of the interaction site. Structure. 16 (5), 798-808 (2008).
  10. Guo, B., Audu, C. O., Cochran, J. C., Mierke, D. F., Pellegrini, M. Protein engineering of the N-terminus of NEMO: structure stabilization and rescue of IKKβ binding. Biochemistry. 53 (43), 6776-6785 (2014).
  11. Havranek, J. J., Harbury, P. B. Automated design of specificity in molecular recognition. Nature Structural Biology. 10 (1), 45-52 (2003).
  12. Barczewski, A. H., Ragusa, M. J., Mierke, D. F., Pellegrini, M. The IKK-binding domain of NEMO is an irregular coiled coil with a dynamic binding interface. Scientific Reports. 9 (1), 2950(2019).
  13. Arimori, T., et al. Fv-clasp: an artificially designed small antibody fragment with improved production compatibility, stability, and crystallizability. Structure. 25 (10), London, England. 1611-1622 (2017).
  14. Hernandez Alvarez, B., Hartmann, M. D., Albrecht, R., Lupas, A. N., Zeth, K., Linke, D. A new expression system for protein crystallization using trimeric coiled-coil adaptors. Protein Engineering, Design and Selection. 21 (1), 11-18 (2008).
  15. Oshaben, K. M., Salari, R., McCaslin, D. R., Chong, L. T., Horne, W. S. The native GCN4 leucine-zipper domain does not uniquely specify a dimeric oligomerization state. Biochemistry. 51 (47), 9581-9591 (2012).
  16. Truebestein, L., Leonard, T. A. Coiled-coils: The long and short of it. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 38 (9), 903-916 (2016).
  17. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  18. Kapust, R. B., et al. Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency. Protein Engineering. 14 (12), 993-1000 (2001).
  19. Miladi, B., et al. A new tagged-TEV protease: construction, optimisation of production, purification and test activity. Protein Expression and Purification. 75 (1), 75-82 (2011).
  20. Miller, M. S., et al. Getting the Most Out of Your Crystals: Data Collection at the New High-Flux, Microfocus MX Beamlines at NSLS-II. Molecules. 24 (3), Basel, Switzerland. (2019).
  21. McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. Phaser crystallographic software. Journal of Applied Crystallography. 40, Pt 4 658-674 (2007).
  22. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66, Pt 2 213-221 (2010).
  23. Terwilliger, T. C., et al. Iterative model building, structure refinement and density modification with the PHENIX AutoBuild wizard. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 64, Pt 1 61-69 (2008).
  24. Emsley, P., Cowtan, K. Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 60, Pt 12 Pt 1 2126-2132 (2004).
  25. Terwilliger, T. C., et al. phenix.mr_rosetta: molecular replacement and model rebuilding with Phenix and Rosetta. Journal of Structural and Functional Genomics. 13 (2), 81-90 (2012).
  26. Strong, M., Sawaya, M. R., Wang, S., Phillips, M., Cascio, D., Eisenberg, D. Toward the structural genomics of complexes: crystal structure of a PE/PPE protein complex from Mycobacterium tuberculosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (21), 8060-8065 (2006).
  27. Tickle, I. J., et al. STARANISO. , (2018).
  28. French, S., Wilson, K. On the treatment of negative intensity observations. Acta Crystallographica Section A: Crystal Physics, Diffraction, Theoretical and General Crystallography. 34 (4), 517-525 (1978).
  29. Goldschmidt, L., Cooper, D. R., Derewenda, Z. S., Eisenberg, D. Toward rational protein crystallization: A Web server for the design of crystallizable protein variants. Protein Science: A Publication of the Protein Society. 16 (8), 1569-1576 (2007).
  30. Zhou, L., et al. Disulfide-mediated stabilization of the IκB kinase binding domain of NF-κB essential modulator (NEMO). Biochemistry. 53 (50), 7929-7944 (2014).
  31. D'Arcy, A., Bergfors, T., Cowan-Jacob, S. W., Marsh, M. Microseed matrix screening for optimization in protein crystallization: what have we learned. Acta Crystallographica. Section F, Structural Biology Communications. 70, Pt 9 1117-1126 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

IKK binding DomainNEMO ProteinProtein ExpressionChromatographic PurificationSize ExclusionCrystallization ScreeningX ray DiffractionMolecular ReplacementCoiled coil AdapterTEV Protease

Related Articles