Detrusor içermeyen mesane modeli, idrarın depolanması ve boşaltılmasını sırasında suburothelium/lamina propria'da biyolojik olarak aktif mediatör bulunabilirliğinin düzenlenmesi için yerel mekanizmaları incelemek için suburothelium'a doğrudan erişim sağlar. Hazırlık, bozulmamış bir mesanenin doldurulmasını çok benzer şekilde andırır ve basınç hacmi çalışmalarının sistemik etkiler olmadan yapılmasını sağlar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Mesane Dolgusu Sırasında Suburothelium Doğrudan Erişim için Kaldırılan Detrusor Kas ile Ademi Merkeziyet (Ex Vivo) Murine Mesane Modeli
Bu makalede
Özet
Özet
Daha önceki çalışmalar, Ussing odalarına yapıştırılmış ve hidrostatik basınç veya mekanik streç teki değişikliklere maruz kalan düz mesane mukozalarından ve hidrostatik basınç değişiklikleri, esneme, hücre şişmesi veya sürükleme kuvvetleri üzerine kültürlü ürotelyal hücrelerden ve dolgu sonunda mesane lümeninde kimyasal maddelerin salınımını ortaya çıkarmış. Bu bulgular, bu mediatörlerin mesane dolgusu sırasında suburothelium (SubU)/lamina propria (LP) olarak da salındıkları ve mesane duvarının derinliklerindeki hücreleri etkileyip mesane uyarılabilirliğini düzenleyeceği varsayımına yol açmıştır. Bu tür çalışmalarda en az iki belirgin sınırlama vardır: 1) Bu yaklaşımların hiçbiri SubU/LP'de arabulucuların varlığı hakkında doğrudan bilgi sağlamaz ve 2) kullanılan uyaranlar fizyolojik değildir ve mesanenin otantik dolgusunu tekrarlamaz. Burada, mesane dolgusu seyrinde mesane mukozasının suburothelial yüzeyine doğrudan erişim sağlayan bir prosedürü tartışıyoruz. Oluşturduğumuz mürin detrusorsuz preparat, bozulmamış mesanenin doldurulmasını çok benzer şekilde andırır ve omurilik refleksleri ve detrusor düz kaslardan gelen kafa karıştırıcı sinyal yokluğunda mesane üzerinde basınç-hacim çalışmalarıyapılmasını sağlar. Yeni detrusor içermeyen mesane modelini kullanarak, yakın zamanda arabulucuların intravesical ölçümlerinin mesane dolgusu sırasında SubU/LP'de salınan veya mevcut olan alabilen lere vekil olarak kullanılamayacağını gösterdik. Model, mesane dolumu sırasında metabolizma tarafından üretilen ve/veya SubU/LP'ye taşınan ürotelyum kaynaklı sinyal moleküllerinin incelenmesini sağlayarak mesanenin nöronlarına ve düz kaslarına bilgi aktarımı sağlar ve kontinent ve mikturition sırasında uyarılabilirliğini düzenler.
Giriş
Bu modelin amacı mesane dolgu farklı aşamalarında mesane mukozasının submukozal tarafına doğrudan erişim sağlamaktır.
Kritik hacim ve basınca ulaşıldığında mesane dolum sırasında erken kasılma ve boşalmaktan kaçınmalıdır. Anormal kontinans veya idrar voiding sık sık mesane dolgu seyrinde detrusor düz kas (DSM) anormal uyarılabilirlik ile ilişkilidir. DSM'nin uyarılabilirliği, düz kas hücrelerine özgü faktörler ve mesane duvarı içindeki farklı hücre tiplerinin ürettiği etkiler le belirlenir. Üriner mesanenin duvarı ürotelium (mukoza), suburothelium (SubU)/lamina propria (LP), detrusor düz kas (DSM) ve serosa 'dan(Şekil 1A)oluşur. Ürotelyum şemsiye hücrelerden (yani, ürotelyumun en dış tabakası), ara hücrelerden ve bazal hücrelerden (yani ürotelin en iç tabakasından) oluşur. Interstisyel hücreler, fibroblastlar, afferent sinir terminalleri, küçük kan damarları ve bağışıklık hücreleri de dahil olmak üzere çeşitli hücre türleri SubU/LP'de bulunur. Bu yaygın mesane ürotelyyum SubU / LP ve DSM hücreleri etkileyen submukoza içine arabulucu bırakarak refleks micturition ve kontinansbaşlatan bir duyu organı olduğu varsayılır1 ,2,3. Çoğunlukla, bu tür varsayımlar arabulucuların salınımını göstermiştir çalışmalara dayanmaktadır: hidrostatik basınçdeğişiklikleremaruz mukoza parçalarından 4,5; streç maruz kültürlü ürotellial hücrelerden6,7, hipotonisite kaynaklı hücreşişme7 veya sürükleme kuvvetleri8; reseptör veya sinir aktivasyonu üzerineizole mesane duvar şeritleri 9,10,11,12,13,14; ve mesane lümeni sonunda mesane dolgusularında 15,16,17,18,19. Bu tür çalışmalar mesane duvarı segmentleri veya kültürlü ürotelyal hücrelerin mekanik stimülasyon üzerine arabulucuların salınımını göstermek için etkili iken, onlar mesane dolgu üretmek fizyolojik uyaranlarla ortaya çıkan submukoza da arabulucuların serbest bırakılması için doğrudan kanıt tarafından desteklenmesi gerekir. Bu SubU / LP mesane duvarının derin mesane dolgu sırasında SubU / LP çevresine doğrudan erişim engel bulunan verilen zor bir görevdir.
Burada, mesane ürotelyumu, DSM ve mesane duvarındaki diğer hücre tipleri arasındaki sinyalizasyona katılan mechanotransdüksiyonun lokal mekanizmaları üzerinde çalışmaları kolaylaştırmak için geliştirilen detrusor kası13 ile ademi merkeziyetçi (ex vivo) murine mesane modelini gösteriyoruz. Bu yaklaşım düz mesane duvar tabakaları, mesane duvar şeritleri veya kültürlü ürotelyal hücreler kullanmaktan daha üstündür, çünkü mesanedeki fizyolojik basınç ve hacimlere yanıt olarak serbest bırakılan veya oluşan ürotenyum kaynaklı mediatörlerin SubU/LP çevresinde doğrudan ölçümlere izin verir ve hücre kültüründeki potansiyel henotypik değişimleri önler. SubU/LP'deki arabulucuların mesane dolgusu farklı aşamalarında kullanılabilirliğini, salınımını, metabolizmasını ve transurothelial naklini ölçmek için kullanılabilirliği, salınımını, metabolizmasını ve transurothelial naklini ölçmek için kullanılabilir(Şekil 1B). Hazırlık ayrıca aşırı aktif ve az aktif mesane sendromları modellerinde ürotelyal sinyalizasyon ve mekanotransdüksiyon uzerinde nisrarl incelemede de kullanılabilir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu yazıda tanımlanan hayvanlarla ilgili tüm işlemler, Ulusal Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Için Sağlık Enstitüleri Rehberi ve Nevada Üniversitesi Kurumsal Hayvan Kullanımı ve Bakımı Komitesi'ne göre yürütülmüştür.
NOT: Burada sunulan model, detrusor kasının çıkarılmasından oluşurken, ürotelyum ve SubU/LP sağlam kalarak(Şekil 1B)araştırmacıların mesane dolgusu sırasında SubU/LP'ye doğrudan erişimini sağlar.
1. Detrusor içermeyen Mesane Hazırlığıdise
- İzole mesanesoğuk (10 °C) dolu ve %5 CO2/95 % O2 Krebs bikarbonat çözeltisi (KBS) ile oksijenli bir kesişen tabağa aşağıdaki bileşimle (mM) yerleştirin: 118,5 NaCl, 4.2 KCl, 1.2 MgCl2, 23.8 NaHCO3, 1.2 KH2PO4, 11.0 dekstroz, 1.8 CaCl2 (pH 7.4)13.
- İzole mesanenin kubbesinin küçük bir kısmını KBS ile dolu Sylgard kaplı bir kesme kabına sabitleyin. Pimin SubU/LP'ye bakan kasın en iç kenarından serosa'nın bir parçasından veya en dıştaki kenarından geçtiğinden emin olun.
- Bir mikroskop kullanarak, üretra ve üreterleri tanımlayın ve her birini diseksiyon kabının altına sabitleyin.
- Mesane, üretra ve her iki üreterin tüm ana gövdesi görüntülenir, böylece aşırı yağ ve bağ dokuları çıkarın.
- Üreterleri 6-0 naylon dikişlerle bağlayın. Daha sonra, hazırlama güvenliğini sağlamak için kesitlerin açık uçlarını diseksiyon kabının altına doğru sabitleyin.
- İnce uçlu forceps kullanarak, yavaşça üreter ve mesane gövdesi arasındaki köşesinde serosa bir parça çekin.
- Saydamlığı artırmak ve detrusor kasının altındaki submukozanın kenarboşluğunu ayırt etmek için mikroskopun ışığını ayarlayın.
- Kesmeye başlayın(soyma değil!) mesane duvarını detrusor kas tabakasının iç yüzeyi boyunca ince uçlu makaslarla keserken, kesme segmentini hazırlıktan hafifçe çekin. Her zaman, mukozanın lateral kenarı görülebilir ve dokunmaktan kaçının emin olun.
- Preparat ın pozisyonu detrusor kas dışarı diseksiyon devam etmek için rahat böylece diseksiyon çanak etrafında çevirerek tamamen detrusör kas çıkarın.
- Protokolün kalan adımları sırasında hazırlık immobilize yeteneği sağlamak için mesane kubbesinin üstüne detrusor kas küçük bir parça bırakın.
- 6-0 naylon iplik bir çift döngü olun, mesane hazırlık boyun etrafına yerleştirin ve döngü gevşek bırakın.
- 6-0 ipek iplik ikinci bir çift döngü ekleyin, mesane hazırlık boyun etrafına yerleştirin ve döngü kaybetmek bırakın. İki dikiş olması dikişlerin etrafındaki sızıntıları önler.
- 20 PE boru (kateter) yaklaşık 2 cm kesin, bir alev yakın ucu yavaş yavaş hareket ettirerek ucu alevlendirin.
- Kateteri sıcak (37 °C) oksijenli KBS ile doldurun.
- Kateteri mesane üretrasının deifine yerleştirin ve kateter ucu mesanenin yaklaşık ortasına ulaşana kadar kateteri yavaşça itin.
- Kateter ve mesane boynunun çevresindeki doku etrafında dikiş kravat.
- Mesaneyi yavaşça yaklaşık 50-100°L ılık (37 °C) oksijenli KBS ile doldurun, KBS yüzeyinden kısa bir süre (<10 s) kaldırın ve dikişlerde ve mesane gövdesindeki sızıntıları izleyin.
- Sızıntı gözlenmezse, deney için hazırlık hazırdır. Dikiş etrafında bir sızıntı görülürse, dikiş çıkarın ve değiştirin. Mesane gövdesinde bir delikten bir sızıntı fark edilirse, hazırlık atın.
2. Denuded Mesane Preparatının Doldurulması
- Perfuse KBS (37 °C) bir su 3 mL oda içine (37 °C) bir Sylgard alt ile ceketli organ çanak.
- Oksijen ve emme hatlarını ayarlayın.
- Denuded mesane hazırlık odasına yerleştirin.
- Preparatın perfüzyon çözeltisinin yüzeyinin üzerinde süzülmemesi için kateteri haznenin kenarına sabitle.
- Mesane kateterini aynı boyutta montaj kullanarak üç yönlü stopcock'a bağlı daha uzun bir PE20 boruya (infüzyon hattı) bağlayın.
- İnfüzyon pompası, basınç transdüser ve mesane arasındaki çizgilerin açık olduğundan emin olun.
- Infüzyon şırıngını taze, sıcak (37 °C) ve oksijenli KBS ile doldurun.
- Pompa parametrelerini ayarlayın: şırınganın türü/hacmi (yani, 1 mL), çalışma (yani aşılama), akış (yani, sabit) ve akış hızı (örn. 15 μL/dk).
- Mesane doldurmak için şırınga pompası üzerinde Başlat düğmesine basın.
- Mesane dolgusu sırasında dolum hacmini ve damar basıncını izleyin.
3. Denuded Mesane HazırlığısubU / LP Yönü Arabulucuların Tespiti
- Buz gibi mikrosantrifüj tüpler veya yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC) ekler içine banyo çözeltisi aliquots toplayın.
- Numuneleri uygun algılama uygulamasına göre hazırlayın ve işleyin. Pürin kullanılabilirliğinin saptanması durumunda, numuneleri HPLC ile floresan tespiti13,18ile işleyin.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Murine detrusor içermeyen mesane hazırlığı duvarı sağlamdır ve DSM ve serosa hariç tüm katmanları içerir. Prensip kanıtı çalışmaları DSM içermeyen mesane duvarında ürotelyum ve SubU/LP içerirken, tunica kaslı ve serosa nın bulunmadığını göstermiştir (Şekil 2)13.
Detrusor içermeyen mesanenin doldurulması normal mesane dolgusuna yaklaşık olarak dabur.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Mesanenin iki işlevi vardır: idrarın depolanması ve boşaltılsa. Bu fonksiyonların normal çalışması, detrusor kas uyarılabilirliğini düzenlemek için intraluminal hacim ve basıncın ve sinyallerin mesane duvarındaki hücreler den aktarılmasını uygun mekanik algılamayı gerektirir. Mesane mukozasının (ürotelyum) SubU/LP'de mesane duvarındaki çok sayıda hücre tipini etkileyen çeşitli sinyal molekülleri salarak mesane uyarılabilirliğini düzenlediğine inanılmaktadır. Şu anda, ürotelyum kaynaklı mediatörlerin karakterizasyonu giri...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Bu çalışmanın bazı bölümleri daha önce Journal of Physiology dergisinde (PMCID: PMC6418748; DOI:10.1113/JP27692413). Wiley and Sons, Inc. tarafından bu yayındaki materyallerin kullanımı için izin verilmiştir. Yazarların ifşa etmesi gereken herhangi bir mali veya başka çakışma yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma Ulusal Diyabet Enstitüsü ve Sindirim ve Böbrek Hastalıkları Hibe DK41315 tarafından desteklenmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| CaCl2 | Fisher | C79 | Kaynak esnek |
| Dekstroz | Fisher | D16 | Kaynak esnek |
| Diseksiyon pimleri | Güzel Bilim Araçları | 26002-20 | Kaynak esnek |
| İnfüzyon Pompası | Kent Scientific | GenieTouch | Kaynak esnek |
| KCl | Fisher | P217 | Kaynak esnek |
| KH2PO4 | Fisher | P284 | Kaynak esnek |
| Işık kaynağı | SCHOTT ACEI | Kaynak esnek | |
| Mikroskop | Olympus SZX7 | Herhangi bir kapsamı kullanmak için esnek | |
| MgCl2 | Fisher | M33 | Kaynak esnek |
| NaCl | Fisher | S671 | Kaynak esnek |
| NaHCO3 | Fisher | S233 | Kaynak esnek |
| İğneler 25G | Becton Dickinson | 305122 | Kaynak esnek |
| Organ banyosu | Özel yapım | Esnek kaynak; Radnoti diseksiyon çanağı | |
| PE-20 borudan | Intramedic | 427405 | Kaynak esnek |
| Basınç dönüştürücü | AD cihazı | Kaynak esnek | |
| S & T Forseps | Güzel Bilim Araçları | 00632-11 | Kaynak esnek |
| Yazılım basınç-hacim | AD Aletleri | Güç laboratuvarı | |
| Sütür Naylon, 6-0 | AD cerrahi | S-N618R13 | Kaynak esnek |
| Sütür İpek, 6-0 | Deknatel via Braintree Scientific, Inc. | 07J1500190 | Kaynak esnek |
| Şırıngalar 1 mL | Becton Dickinson | 309602 | Kaynak esnek |
| Vannas Bahar | Makas Güzel Bilim Araçları | 15000-08 | Kaynak esnek |
| Su sirkülatörü | Baxter | K-MOD 100 | Kaynak esnek |
Kaynaklar
- Apodaca, G., Balestreire, E., Birder, L. A. The uroepithelial-associated sensory web. Kidney International. 72, 1057-1064 (2007).
- Fry, C. H., Vahabi, B. The Role of the Mucosa in Normal and Abnormal Bladder Function. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. , 57-62 (2016).
- Merrill, L., Gonzalez, E. J., Girard, B. M., Vizzard, M. A. Receptors, channels, and signalling in the urothelial sensory system in the bladder. Nature Reviewes Urology. 13, 193-204 (2016).
- Ferguson, D. R., Kennedy, I., Burton, T. J. ATP is released from rabbit urinary bladder epithelial cells by hydrostatic pressure changes--a possible sensory mechanism? Journal of Physiology. 505, 503-511 (1997).
- Wang, E. C., et al. ATP and purinergic receptor-dependent membrane traffic in bladder umbrella cells. Journal of Clinical Investigation. 115, 2412-2422 (2005).
- Miyamoto, T., et al. Functional role for Piezo1 in stretch-evoked Ca(2)(+) influx and ATP release in urothelial cell cultures. Journal of Biological Chemistry. 289, 16565-16575 (2014).
- Mochizuki, T., et al. The TRPV4 cation channel mediates stretch-evoked Ca2+ influx and ATP release in primary urothelial cell cultures. Journal of Biological Chemistry. 284, 21257-21264 (2009).
- McLatchie, L. M., Fry, C. H. ATP release from freshly isolated guinea-pig bladder urothelial cells: a quantification and study of the mechanisms involved. BJU International. 115, 987-993 (2015).
- Birder, L. A., Apodaca, G., de Groat, W. C., Kanai, A. J. Adrenergic- and capsaicin-evoked nitric oxide release from urothelium and afferent nerves in urinary bladder. American Journal of Physiology Renal Physiology. 275, F226-F229 (1998).
- Birder, L. A., Kanai, A. J., de Groat, W. C. DMSO: effect on bladder afferent neurons and nitric oxide release. Journal of Urology. 158, 1989-1995 (1997).
- Birder, L. A., et al. Vanilloid receptor expression suggests a sensory role for urinary bladder epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 98, 13396-13401 (2001).
- Birder, L. A., et al. Beta-adrenoceptor agonists stimulate endothelial nitric oxide synthase in rat urinary bladder urothelial cells. Journal of Neuroscience. 22, 8063-8070 (2002).
- Durnin, L., et al. An ex vivo bladder model with detrusor smooth muscle removed to analyse biologically active mediators released from the suburothelium. Journal of Physiology. 597, 1467-1485 (2019).
- Yoshida, M., et al. Non-neuronal cholinergic system in human bladder urothelium. Urology. 67, 425-430 (2006).
- Beckel, J. M., et al. Pannexin 1 channels mediate the release of ATP into the lumen of the rat urinary bladder. Journal of Physiology. 593, 1857-1871 (2015).
- Collins, V. M., et al. OnabotulinumtoxinA significantly attenuates bladder afferent nerve firing and inhibits ATP release from the urothelium. BJU International. 112, 1018-1026 (2013).
- Daly, D. M., Nocchi, L., Liaskos, M., McKay, N. G., Chapple, C., Grundy, D. Age-related changes in afferent pathways and urothelial function in the male mouse bladder. Journal of Physiology. 592, 537-549 (2014).
- Durnin, L., Hayoz, S., Corrigan, R. D., Yanez, A., Koh, S. D., Mutafova-Yambolieva, V. N. Urothelial purine release during filling of murine and primate bladders. American Journal of Physiology Renal Physiology. 311, F708-F716 (2016).
- Gonzalez, E. J., Heppner, T. J., Nelson, M. T., Vizzard, M. A. Purinergic signalling underlies transforming growth factor-beta-mediated bladder afferent nerve hyperexcitability. Journal of Physiology. 594, 3575-3588 (2016).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
