Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Derin Tek Hücreli RNA Sıralamaiçin Bir Yetişkin Fare Beyin Yarımküre'den Bölgeye Özgü MikrogliaNın İzolasyon

10.5K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/60347

⸱

3 Aralık 2019

 , 
1Department of Neurobiology, Stanford University School of Medicine

Bu makalede

Özet

Biz yetişkin bir fare beyin yarımkürenin farklı parçalanmış bölgelerinden mikroglia izolasyoniçin bir protokol sağlamak, tam uzunlukta transkripsiyon derin tek hücreli RNA sıralama için yarı otomatik kütüphane hazırlık izledi. Bu yöntem, sağlık ve hastalık mikroglia fonksiyonel heterojenite açıklığa kavuşturmak için yardımcı olacaktır.

Özet

Merkezi sinir sisteminde yerleşik makrofajlar olarak, mikroglia aktif beyin gelişimi ve homeostaz kontrol, ve onların işlev bozuklukları insan hastalıkları sürücü olabilir. Homeostatik mikroglianın moleküler imzalarının yanı sıra çevresel uyaranlara yanıt olarak gen ekspresyonunda yapılan değişiklikleri ortaya çıkarmak için önemli ilerlemeler kaydedilmiştir. Tek hücreli genomik metodolojilerin gelişi ve olgunlaşmasıyla, heterojen mikroglianın farklı gelişimsel ve patolojik koşullarda oynadıkları çeşitli rollerin altında yattığı giderek daha fazla kabul edilmektedir. Bu tür heterojenliğin daha fazla diseksiyonu, mikroglianın belirli bir ilgi bölgesinden etkin bir şekilde izole edilmesi ve ardından tek tek hücrelerin hassas profilinin alınması yla elde edilebilir. Burada, tek bir yetişkin fare beyin yarımkürede farklı beyin bölgelerinden mikroglia hızlı izolasyon için ayrıntılı bir protokol sağlar. Ayrıca bu sıralanmış mikroglianın plaka bazlı derin tek hücreli RNA dizilimi için nasıl kullanılacağını da gösteriyoruz. Bu yöntemin diğer senaryolara uyarlanabilirliğini tartışır ve büyük ölçekli çalışmalara uyum sağlayacak şekilde sistemin iyileştirilmesi için yönergeler sağlarız.

Giriş

Tüm sinir hücrelerinin %5−%10'unu temsil eden mikroglia, merkezi sinir sistemi (CNS)1'edağılmış yerleşik makrofajlardır. Kan-beyin bariyerinin arkasında korunan, sağlıklı bir yetişkin beyin tipik mikroglia hızla genişletmek ve parankim nöronlar ve diğer glial hücreleri ile etkileşime geri birçok ince süreçler içerir. Mikroglia da belirli gelişimaşamalarında veya yaralanma ve hastalık1bağışıklık sorunları üzerine artan fagositik fonksiyon ile ilişkili amipoid morfolojisi benimseyebilir 1,2,3,4. Son heyecan verici keşifler açıkça mikroglia beyin kaynaklı veya patolojik sinyaller için pasif seyirci olduğunu göstermiştir, ama beyin gelişimi ve homeostaz kontrolünde önemli roller oynamak, örneğin, nöronal sağkalım destekleyerek, budama olgunlaşmamış sinapslar, oligodendrocyte soy hücrelerinin farklılaşması teşvik yanı sıra anjiyogenez1. Mikroglia daha fonksiyonları açıklığa kavuştururken, heyecan daha fazla insan genetik çalışmaları ile körüklenir, hangi birçok nörodejeneratif hastalık risk genleri gösterdi, TREM2 gibi, ağırlıklı olarak veya sadece microglia tarafından ifade5,6,7. Geliştirme ve makul hastalık sürüş rolleri onların önemi göz önüne alındığında, muazzam çaba son zamanlarda nörodejeneratif hastalıklar için yeni terapötik hedefler bulma umuduyla mikroglial gen regülasyonu ve fonksiyonu anlayışımıza doğru konulmuştur1,8.

RNA dizilemesi (RNA-seq) hücre tipine özgü gen ekspresyonunun tarafsız karakterizasyonuna izin verir, bu da bilim adamlarına yoğun hücresel ağlardaki gen fonksiyonlarını araştırmaya rehberlik eder7. RNA-seq çoğunlukla toplu örnekler üzerinde yapılmış, diğer nöral ve bağışıklık hücrelerinden ayıran bir homeostatik mikroglial gen imzası keşfiyol açan9. Ancak, böyle bir yaklaşım mikroglia arasındaki moleküler ve fonksiyonel farklılıkları göz ardı edebilir, özellikle de geçici olarak geliştirme mevcut, ya da yaşlanma ve hastalık ile ilişkili. Nitekim, tek hücreli RNA-seq (scRNA-seq) çeşitli bağlamlarda mikroglia daha önce az takdir heterojenlik ortaya çıkararak alanında devrim var duyarlılık ve çözünürlük sunuyor2,3,10. Buna ek olarak, CNS-dolaşım arayüzüdiğer benzer bağışıklık hücrelerinin varlığı nedeniyle, scRNA-seq çok az ön bilgi ile bu ilgili hücreleri ayırmak ve işlevsel olarak bu ilgili hücrelerin diseksiyon yeni araçların tasarımına yardımcı bilgi sağlar2,11.

ScRNA-seq platformları çeşitli bir dizi icat edilmiştir, her belirli uygulamalar için uygun12. Genel olarak, 10x Genomik gibi damlacık tabanlı yöntemler, her çalıştırmada dizili (on) binlerce hücre ile elde etme açısından daha yüksektir ve geniş kategorizasyon gerektiren karışık hücre popülasyonları içerebilecek girdi için daha az seçicidir. Plaka tabanlı yöntemler daha yüksek duyarlılık sağlamak ve derinliği13okumak,14, genellikle ince farklılıklar veya nadir transkript ortaya çıkarmak için hücre sıralama belirli popülasyonları hedefleme. Mikroglial hücrelerin küçük yüzdesi göz önüne alındığında, özellikle bu gelişme- veya hastalık la ilişkili alt popülasyonlar, tüm CNS hücre tipleri arasında, genellikle ilgi belirli bir bölgeden mikroglia izole etmek ve onların heterojenlik anlamak için derin ve tam uzunlukta transkripsiyonik bilgi elde etmek için arzu edilir.

Burada, yarı otomatik plaka tabanlı kütüphane hazırlama prosedürü nden sonra tek hücreli (veya toplu) RNA-seq için kullanılan tek bir yarımküreden parçalanmış farklı fare beyin bölgelerinden mikroglia izole etmek için nasıl ayrıntıları sağlar. Diğer yarımküre daha sonra histolojik doğrulama için kullanılabilir. Daha önce yayınlanmış bir yöntem9aerodinamik, Bu izolasyon protokolü başlangıç malzemelerin in verimi maksimize etmeyi amaçlamaktadır, ve bu arada endojen mikroglial gen ekspresyonu profilleri korumak. Mikrogliayı (veya diğer ilgili bağışıklık hücrelerini) 96 kuyuplakaya dönüştürmek ve üretim hacmini artırmak için kitaplık hazırlama için reaktif lerin hacimlerini minyatürleştirmek için floresan tarafından aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) kullanıyoruz. Diğer plaka tabanlı stratejiler uygulansa da bu hassas scRNA-seq platformuna vurgu yapıyoruz. Bu yöntem, mikroglia'yı yaralanma veya hastalık odakları gibi diğer diseksiyon lu dokulardan izole etmek için kolayca uyarlanabilir ve farenin yaşı hemen hemen her doğum sonrası evreye kadar değişebilir. Tek hücreli transkripsiyon çalışmaları için bölgesel mikrogliaverimli izolasyon sağlık ve hastalık fonksiyonlarının daha iyi anlaşılmasını kolaylaştıracaktır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Kemirgenlerle ilgili tüm prosedürler, ulusal ve eyalet yasalarına ve politikalarına uygun olan Stanford Üniversitesi yönergelerine uygundur. Tüm hayvan prosedürleri Stanford Üniversitesi'nin Laboratuvar Hayvan Bakımı İdari Paneli tarafından onaylandı.

NOT: Tüm çözelti ve tampon kompozisyonları Malzeme Tablosu'ndaverilmiştir.

1. Hücre İzolasyon Günü'ne Hazırlık

  1. Aşağıdaki reaktifleri hazırlayın ve buz üzerinde soğutun: orta A (50 mL), manyetik aktif hücre sıralama (MCS) tampon (30 mL), FACS tampon (25 mL), fosfat tamponlu salin (PBS; 30 mL), DNase (320 μL) ve RNase inhibitörü (30 μL).
    NOT: Burada sağlanan hacimler tek bir fare beyin yarımkürenin 4 beyin bölgesinden (örn. korteks, beyincik, hipokampus ve striatum) mikrogliayı izole etmek için yeterlidir. Daha fazla doku kullanılırsa ölçeklendirin.
  2. Buz üzerine dört temiz 2 mL Damlahomogenizer yerleştirin ve her Dounce homogenizer içine 80 μL DNase (12.500 birim/mL) ve 5 μL RNase inhibitörü ile orta A'dan 2 mL ekleyin. 15 mL tüplerde pistonları soğutun.
  3. Doku toplama için beyin bölgeleri ile etiket dört 6 cm Petri yemekleri ve buz üzerinde her çanağı içine soğuk orta A 200 μL ekleyin. Diseksiyon için 6 cm Petri kabına yaklaşık 5 mL orta A ekleyin.
    NOT: Kullanmadan önce, tüm reaktiflerin steril ve RNA uygulamaları için uygun olduğundan emin olun. Tezgah ve diseksiyon aletlerinin temizlenmesi ve RNase dekontaminasyon çözeltisi(Tablo Malzemeler)ile püskürtülmesi gerekmektedir.

2. Beyin Bölgesi Diseksiyonu

NOT: Bu adım ~ 30 dk almalıdır.

  1. 400−500 μL ketamin/ksilazin (24 mg/mL ketamin ve 2.4 mg/mL xylazine) bir çocuk tan yetişkin evre fareye (>1 aylık) periton enjekte edin.
    NOT: Bir erkek fare burada illüstrasyon için kullanılır, ancak her iki cinsiyet uygundur.
  2. 5 dakika bekleyin ve geri çekme eksikliği sağlamak için bir arka pençe çimdik.
  3. Tampon görünür kan olmadan bitene kadar 20−30 mL buz gibi PBS ile transkardiyal perfüzyon yapmak için hemen 26 G x 3/8 iğne kullanın.
  4. Farenin kafasını bir çift cerrahi makasla ayırın. Kafatasının altında ortaya çıkarmak için deri açık kesmek için küçük makas kullanın, ve sonra sagittal sütür ile kesilmiş, lambdoidal sütür ve koronal sütür. Dokuya zarar vermeden parietal kemik ve interparietal kemiğin her iki tarafını da çıkarmak için forseps kullanın ve beyni orta A ile diseksiyon Petri kabına dikkatlice hareket ettirin.
  5. Beyni orta hattan iki yarımküreye kesmek için önceden soğutulmuş bir bıçak kullanın.
    NOT: Burada tek bir yarımküreden tanımlanan dört beyin bölgesi, tek hücreli veya toplu RNA-seq uygulamaları için yeterli sayıda mikroglia verir. Diğer hemisfer immünohistokimya veya RNA in situ doğrulama için kullanılabilir.
  6. Serebellum kortikal lob ve beyin sapı #55 forceps ile ayırın ve bir koleksiyon Petri çanak içine doku transferi.
  7. Dikkatle hipokampus ve korteksten striatum incelemek ve bir koleksiyon Petri çanak içine her doku transferi için #55 forceps kullanın.

3. Mekanik Doku Dissociasyonu

NOT: Boyama adımları dışında hücreleri ve reaktifleri her zaman serin tutun. Bu adım ~ 30 dk almalıdır.

  1. Her beyin dokusunu bir jiletle doğrayın <1 mm3 ince parçalar halinde.
  2. Doku parçalarını önceden soğutulmuş Dounce homogenizers'e aktarmak için 1 mL pipet (uçları kesilmiş) kullanın, her biri DNase ve RNase inhibitörüile 2 mL orta A içeren.
  3. Görünür parçalar bulununcaya kadar, pistonu Dounce homogenizer'ine yavaşça 6−10 tam vuruş için bükerek dokuyu homojenize edin.
    NOT: Douncing nöronlar ve diğer birçok glial hücreleri öldürür ama mikroglial hücreleri oldukça bozulmamış bırakın. Hem yetersiz hem de aşırı douncing hücrelerin düşük verim yol açabilir.
  4. Ayrık dokuları 70 m süzgeç aracılığıyla 50 mL tüplere aktarın.
  5. Her bir Homogenizer ve pistontoplam 6 mL soğuk orta A ile durulayın ve ilgili tüp içine aynı süzgeç ile durulama çözeltisi filtre.
  6. Tek hücreli süspansiyonları (her biri yaklaşık 8 mL) 15 mL konik tüplere ve santrifüjü 400 x g'de 4 °C'de fren = 5 ile aktarın.

4. Myelin Kaldırma

NOT: Bu adım ~ 60 dk almalıdır.

  1. 1 büyük tükenme (LD) sütun (korteks için) ve 3 büyük seçim (LS) sütun (diğer 3 bölge için) bir manyetik ayırıcı(Malzeme Tablosu)hazırlayın. Her sütunu 3 mL MCS arabelleğiyle durulayın.
  2. Santrifüj bittikten sonra, pipet dışarı ve pelet rahatsız etmeden supernatant atın. Korteks ve serebellum dokuları için, 850 μL MCS tamponundaki hücreleri 1.8 μL RNase inhibitörü ile yeniden askıya alın. Hipokampus ve striatum dokuları için, 0.9 μL RNase inhibitörü ile 400 μL MCS tampon hücreleri resuspend.
    NOT: Sütunlar (LD vs LS) ve resuspension için kullanılan hacim dokuda bulunan miyelin miktarına göre optimize edilmiştir. Diğer beyin bölgeleri taranırsa, bu koşulların dokunun büyüklüğüne ve miyelinin ne kadar var olabileceğine bağlı olarak ayarlanması gerekebilir. Miyelin giderme etkinliği adım 4.9 olarak tahmin edilebilir.
  3. Korteks ve beyincik hücrelerine her 100 μL miyelin kaldırma boncukekleyin ve hipokampus ve striatum hücrelere her 50 μL miyelin kaldırma boncuk ekleyin.
  4. Hücreleri boncuklarla hafifçe karıştırın ve tüpleri 10 dakika boyunca buzüzerinde kuluçkaya yatırın.
  5. McS tamponu ile kortikal hücrelere sahip tüpün hacmini 2 mL'ye, diğer tüm lerini 1 mL'ye getirin (kortikal hücreler için 1 mL ekleyin; hipokampal ve striatal hücreler için 500 μL; serebel hücrelerine tampon eklemenize gerek yok).
  6. Sütunlar durulama arabelleği boş aldıktan sonra, her sütunun altına 15 mL'lik bir tüp yerleştirin. Kortikal hücreleri (2 mL) LD sütununa ve diğer tüm hücreleri (her biri 1 mL) LS sütunlarına yükleyin. Orijinal tüpleri yıkamak ve çözümü ilgili kolonlarüzerine yüklemek için hemen 1 mL MCS tampon kullanın.
  7. LD sütunu 1 mL MCS tamponuyla bir kez yıkayın ve her LS sütunu her yıkamada 1 mL MCS tamponile iki kez yıkayın. Yıkama sırasında akış yoluyla çözelti toplamaya devam edin.
  8. Hücreleri 35 μm süzgeç kapağı ile yuvarlak alt FACS tüpleri halinde filtreleyin.
    NOT: Her tüp miyelin tükenmiş tek hücreli süspansiyon yaklaşık 4 mL toplamak gerekir.
  9. İsteğe bağlı olarak, hücre süspansiyonunun 10 μL'sini alın ve 10 μL %0,4 trypan mavi çözeltisi ile karıştırın. Verim, sağkalım oranı ve kalıntı miyelin düzeyini tahmin etmek için 10x parlak alan mikroskobu altındaki hücreleri inceleyin.
    NOT: Başarılı bir hazırlık üzerinde% 90 canlı hücreler (yuvarlak şeklinde ve mavi boya hariç) çok az ile hiçbir miyelin enkaz ile üretmelidir.
  10. FACS tüplerinde 400 x g'de 4 °C'de 5 dk, fren = 5 ile pelet hücreleri. Yavaş yavaş supernatant dökün ve doku kağıt üzerinde tüp kenarına dab. 300 μL FACS tamponu ile her tüpteki hücreleri yeniden askıya alın.
    NOT: MCS sıralama tercih edilirse, CD11b boncuk lar miyelin çıkarılmasından sonra mikroglia ve diğer miyeloid hücreleri seçmek için kullanılabilir. Bu hücreler daha sonra plaka tabanlı olmayan scRNA-seq yanı sıra toplu RNA-seq için kullanılabilir. Bu alternatif yaklaşımın uyarı CD11b boncuklar da bu antijen için olumlu diğer ilgili bağışıklık hücrelerinden microglia ayrı değildir.

5. Floresan aktive Hücre Sıralama için Boyama

NOT: Bu adım ~ 40 dk almalıdır.

  1. Her tüpe 5 μL fare Fc reseptörleri blok reaktifi(Malzeme Tablosu)ekleyin. Buz üzerinde 5 dakika kuluçka.
  2. Her tüpe 1 μL CD45-PE-Cy7 ve 1 μL CD11b-BV421 ekleyin.
    NOT: Diğer konjuge floropores ile antikorlar kullanılabilir. TMEM119 karşı antikorlar, homeostatik mikroglia için özel bir belirteç9, ayrıca dahil edilebilir, ancak CD45 ve CD11b ile birlikte kullanılması tavsiye edilir, Bazı mikroglia alt popülasyonları TMEM119 yüzey ekspresyonu kaybedebilir çünkü.
  3. Tüpleri oda sıcaklığında (RT) 10 dakika çalkalayıcı üzerine tüplerle inkübedin.
  4. Yıkamak için 2 mL FACS arabelleği ekleyin.
  5. 4 °C' de pelet hücreleri, 5 dk. 5 dk. 1 μL RNase inhibitörü ve 0.5 μL propidium iyodür (PI, 1:1.000 seyreltme) ile 400 μL FACS tamponu kullanarak her tüpteki hücreleri yeniden askıya alın.

6. Dizin FACS Sıralama

NOT: Bu adım ~ 1 saat almalıdır.

  1. Standart FACS prosedüründen sonra, dağılıma (enkaz hariç), tek hücrelere, canlı hücrelere (PI negatif), mikroglia ve miyeloid hücrelere (CD45+, CD11b+ )dayalı kapılar çizin.
    NOT: Tipik mikroglial hücreler, perivasküler ve meningeal makrofajlar gibi diğer sınırilişkili makrofajlar ile karşılaştırıldığında düşük seviyelerde CD45 ifade, ve bu nedenle CD45 düşük CD11b gating+ araştırmanın odak bu klasik mikroglia gen ekspresyon profilleri ise yeterli olmalıdır1,2. Ancak, mikroglia bazı alt kümeleri yüksek CD45 ekspresyonu olabilir ve bu özellikle geliştirme sırasında veya hastalık koşullarında doğrudur. Mikroglial gen ekspresyonunun tarafsız analizini sağlamak için, CD45 yüksek ve CD45 düşük immünfenotipleri indeks sıralama ayarı ve sıralama ve aşağı akım analizi için toplanan her iki popülasyon ile kaydedilebilir. Buna ek olarak, TMEM119 yüzey ekspresyonu homeostatik mikroglial popülasyonu hedeflemek için kullanılabilir (bkz. adım 5.2) ve CD45 düzeyleri ve sıralama sonuçları ile birlikte analiz edilir.
  2. Tek mikrogliayı (100 μm nozullu) 96 kuyulu polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) plakalarına sıralayın, her kuyuda 4 μL lysis tamponu içeren (ayrıntılar için yayınlanan protokol14'e bakın).
    NOT: Harici RNA Kontrol Konsorsiyumu (ERCC) RNA çivili karışım(Malzeme Tablosu)kalite kontrol ve normalizasyon amacıyla lysis tamponuna 1:2.4 x 107 olarak eklenebilir2.
  3. Kısaca plakaları girdap ve bir tezgah üstü santrifüj kullanarak aşağı spin.
  4. Örnekleri hemen kuru buz üzerinde dondurun. Plakaları kütüphane hazırlığına kadar -80 °C'de saklayın.
    NOT: Alternatif olarak, daha fazla hücre toplu RNA-seq için RNA ekstraksiyon tampon ile 1,5 mL tüpler içine toplanabilir. Yazarların deneyimlerine göre, 3.000 hücreleri yayınlanan protokol2,14aşağıdaki kaliteli kütüphaneler oluşturmak için yeterlidir.

7. Tek hücreli RNA-sıralama Kütüphane Hazırlama

NOT: Burada, yayınlanan protokol14 sıvı işleme robotik ve birkaç değişiklik yardımı ile scRNA-seq kütüphaneleri oluşturmak için takip edilir. Bu makalede, yordam yalnızca kısa bir süre açıklanmıştır ve farklar vurgulanır. 4 plakanın aynı anda işlenmesi yaklaşık 2,5 gün sürer.

  1. Buz üzerinde plakaları eritin ve Oligo-dT30VN astar (lysis tampon) ile ters transkripsiyon gerçekleştirmek termal döngücüler ile cDNA oluşturmak için (Tablo 1): 42 °C 90 dk; 70 °C 5 dk; 4 °C tutun. Daha sonra pcr ana karışımını ve yerinde PCR (ISPCR) astarlarınıkullanarakcDNA'yı başında ek bir ekoneksikle sindirimi adımı(Tablo 2) ve aşağıdaki PCR durumu ile yükseltin: 37 °C 30 dk; 95 °C 3 dk; 98 °C 20 s, 67 °C 15 s, 72 °C 4 dk 23 devir; 72 °C 5 dk.
  2. CDNA'yı kuyu başına 18 μL manyetik boncuk kullanarak arındırın (0.7:1 oranı). Plakayı manyetik bir standüzerinde 5 dakika boyunca kuluçkaya yatırın ve numuneleri her seferinde %80 etanol, 80°L'lik taze olarak yapılan iki kez yıkayın. Plaka15-20 dk kuruduktan sonra, kuyu başına 20 μL elüsyon tamponu ile cDNA'yı elüsi ile elüt.
    NOT: Kalite kontrol için, boyut dağılımlarını ve cDNA konsantrasyonlarını kontrol etmek için bir parça çözümleyici (yüksek duyarlılık yeni nesil [NGS] parça analizi, 1−6.000 bp) kullanın ve sadece 500−5.000 bp arasında ve 0.05 ng/μL'den daha yüksek yayma içeren daha ileri proses örnekleri kullanın.
  3. Kütüphaneoluşturmak için, her cDNA numunesinin 0,4 μL'sini kütüphane hazırlama kitinden(Malzeme Tablosu)1,2 μL Tn5 tagmentation reaktifleriyle 55 °C 10 dk.'lık bir nanolitre borulama makinesi yardımıyla 384 kuyuluk bir plakaya karıştırın.
    NOT: Burada, maliyeti azaltmak ve bu arada üretim hacmini artırmak için önerilen reaksiyon hacminin 1/12.5'i (5 μL numune ve 15 μL tagmentasyon reaktifleri) eklenir. Bir nanoliter pipetleme makinesi(Tablo Malzemeler)reaktifleri transfer etmek için kullanılır (bu ve aşağıdaki adımlar) ve 384-iyi plakalar.
  4. 5 dakika boyunca RT'deki etiketleme reaksiyonunu durdurmak için 0,4 μL nötralizasyon tamponu ekleyin.
  5. 384 indeks(Malzeme Tablosu, 0,4 l ileri ve 0,4 μL ters), 1,2 μL PCR karışımını numunelere ekleyin (her biri 2 μL) ve kütüphaneleri aşağıdaki koşulla yükseltin: 72 °C 3 dk; 95 °C 30 s; 95 °C 10 s, 55 °C 30 s, 72 °C 1 dk 10 devir; 72 °C 5 dk.
  6. Havuz tüm bireysel kütüphaneler (1 μL her almak) aynı 384-iyi plaka birlikte, ve manyetik boncuklar kullanın(Tablo Malzemeler, 0.7:1 oranı) son havuzlu kütüphaneleri arındırmak için.
  7. Sıralamadan önce havuzlu kütüphanelerin boyut dağılımlarını incelemek için konsantrasyonları ve bir biyoanalizör(Malzeme Tablosu)ölçmek için bir florometre(Malzeme Tablosu)kullanın. Hücre başına 1 milyon ham okuma da sıralama derinliği hedefleyin.
  8. Sıralama okumalarını filtrelemek ve süslemek için standart biyoinformatik prosedürleri izleyin ve hizalama2'yigerçekleştirin. Seurat paketi15ile kümeleme analizi yapmak için giriş olarak sayım tablosu nu ve meta verileri kullanın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu protokol, bir yetişkin perfüzyon beyin yarımkürede farklı beyin bölgelerinden mikroglia izole etmek ve sıralamak için bir yöntem açıklar, scRNA-seq takip. Biz tek hücreli süspansiyon oluşturmak için douncing kullanın ve aynı zamanda mikroglia zenginleştirmek için ilk adım olarak. Yetersiz veya aşırı douncing verimi azaltır. Buna ek olarak, yetişkin fare beyinleri miyelin yüksek düzeyde içerir, aynı zamanda düzgün kaldırılmazsa sıralama verimliliği ve verimazaltabilir. Bu nedenle, antikor boyama yapmadan önce miyelin ç...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Mikroglia aktif CNS diğer hücre tipleri ile etkileşim, ve çevresel uyaranlara çok duyarlıdır. İzolasyon işlemi sırasında gen ekspresyonundaki inflamatuar yanıtları ve anormal değişiklikleri en aza indirmek için, bu protokol daha önce yayınlanmış bir yöntem9'dandüzene sokulmuştur ve artık mikroglia'yı tek bir fare beyninin birçok bölgesinden paralel olarak izole etmek uygundur. Dokular ve reaktifler soğuk sıcaklıkta tutulur ve sınırlı doku boyutlarına göre daha az yıkama ve daha az reaktif ile zama...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Mariko L. Bennett, Liana Nicole Bonanno ve Spyros Darmanis'e bu protokolün geliştirilmesi sırasında ki yardımları için teşekkür ederiz. Ayrıca Stanford Paylaşılan FACS Tesisi, özellikle Meredith Weglarz ve Lisa Nichols teşekkür ederiz; Yen Tran, Michael Eckart Stanford Protein ve Nükleik Asit Tesisi (PAN) filme için büyük destek için. Bu çalışma JPB Vakfı ve Vincent J. Coates Vakfı tarafından finanse edilmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
5 M BetainSigma-AldrichKedisi# B0300-5VL
10 mM dNTP karışımıThermo Fisher Bilimsel Kedi# R0192
0.5 M EDTA, pH 8.0Thermo Fisher Bilimsel Kedi# 15575020
10X Hanks' Dengeli TuzÇözeltisi Thermo Fisher ScientificCat # 14185-052
1 M HEPESThermo Fisher BilimselKedi # 15630080
1X KAPA HIFI Hotstart Master MixKapa BiosciencesCat# KK2602
5 mL Yuvarlak Tabanlı Polistiren Tüp, Hücre Süzgeç KapaklıCorningCat# 352235
AATI, Yüksek Hassasiyetli NGS Parça Analiz Kiti (1 bp – 6.000 bp)Gelişmiş Analitik Kedi# DNF-474-1000
Sığır Serumu AlbüminSigma AldrichKedi # A8806
DNase IWorthingtonKedi # LS002007Çalışma çözümü: 12500 birim / ml
DTT, Moleküler SınıfPromegaKedi # P1171
ERCC RNA Spike-In KarışımıTermo Fisher BilimselKedi # 4456740
Fetal Sığır SerumuThermo Fisher ScientificCat # 10437-028
Illumina XT Dizin Kiti v2 Set A (96 indeks)IlluminaCat # FC-131-2001
Illumina XT Dizin Kiti v2 Set B (96 indeks)IlluminaCat # FC-131-2002
Illumina XT Dizin Kiti v2 Set C (96 indeks)IlluminaCat # FC-131-2003
Illumina XT Dizin Kiti v2 Set D (96 indeks)IlluminaKedi # FC-131-2004
Lambda Eksonükleaz (5 U/μ l)New England BioLabsCat # M0262S
Fare Fc bloğuBD PharmingenCat # 553142
Miyelin çıkarma boncuklarıMiltenyl BiotecCat # 130-096-433
Nextera XT DNA Örnek Hazırlama KitiIlluminaCat # FC-131-1096
NextSeq 500/550 Yüksek Çıkış Kiti v2.5 (150 Döngü)IlluminaCat # 20024907
PBS ( 10X), pH 7.4Thermo Fisher Bilimsel Kedi# 70011044
PCRClean DX boncuklarAline BiosciencesKedi # C-1003-50
Propidyum İyodürTermo Fisher Bilimsel Kedi# P3566Boyama: 1:1000
Kübit dsDNA HS Test KitiTermal Fisher Bilimsel Kedi# Q32851
Sıçan monoklonal anti fare / insan CD11b, Parlak Menekşe 421 (klon M1 / 70)BioLegendKedi# 101236; RRID: AB_11203704Boyama: 1:300
Sıçan monoklonal anti fare CD45, PE/Cy7 (klon 30-F11)Thermo Fisher ScientificCat # 25-0451-82; RRID: AB_469625Boyama: 1:300
Rekombinant RNaz İnhibitörüTakara BioCat # 2313B
SMARTScribe Ters Transkriptaz (100 U/μ l)ClontechCat # 6395385x İlk iplikçik tamponu
içeren Oligonükleotidler< / güçlü>
0.1 μ M ISPCR Oligo: 5' - AAGCAGTGGTATCAA
CGCAGAGT-3'		(Picelli ve diğerleri, 2014)
Oligo-dT30VN astar: 5' - AAGCAGTGGTATCAACGCA
GAGTACT 30 VN-3'		(Picelli ve diğerleri, 2014)
TSO 5' - AAGCAGTGGTATCAACGCAGA
GTACATrGrG+G-3' ("r" forribobazlar ve "+" bir LNA bazı içindir)		(Picelli ve diğerleri, 2014)
Çözeltiler< / güçlü >
FACS tamponuTarif: steril filtreli %1 FBS, 2 mM EDTA, 1X PBS MCS tamponunda
Tarif: steril filtreli %0,5 BSA, 1X PBS Medium'da
A Tarifi: 15 mM HEPES, fenol içermeyen 1X HBSS'de %0.5 glikoz
Plakalar
384 kuyulu Rigi-Plate PCR Mikroplakaları, Axygen ScientificVWR89005-556
Sert kabuklu 96 kuyulu PCR plakalarıBio-RadHSP9631
Others
Dumont #55 forsepsGüzel Bilim Araçları11295-51
Dounce homojenizatör, 2 mlWheaton
Büyük tükenme sütunuMiltenyi Biotec130-042-901
Büyük seçim sütunuMiltenyi Biotec130-042-401
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
QuadroMACS AyırıcıMiltenyi Biotec130-090-976
RNAzapThermo Fisher ScientificAM9780
Süzgeç (70 μ m)Falcon352350
Ekipman
BD FACSAria IIBD Bioscienceshttp://www.bdbiosciences.com/
BiyoanalizörAgilent2100
Fragment AnalyzerAgilent5300
Sivrisinek HTS nanolitre pipetleme robotuTTP Labtechhttps://www.ttplabtech.com/
Qubit 4 FlorometreThermo Fisher ScientificQ33226
25 mM HEPES 2 mM EDTA 357422

Kaynaklar

  1. Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
  2. Li, Q., et al. Developmental Heterogeneity of Microglia and Brain Myeloid Cells Revealed by Deep Single-Cell RNA Sequencing. Neuron. 101 (2), 207-223 (2019).
  3. Keren-Shaul, H., et al. A Unique Microglia Type Associated with Restricting Development of Alzheimer's Disease. Cell. 169 (7), 1276-1290 (2017).
  4. Bohlen, C. J., et al. Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures. Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).
  5. Guerreiro, R., et al. TREM2 variants in Alzheimer's disease. New England Journal of Medicine. 368 (2), 117-127 (2013).
  6. Jonsson, T., et al. Variant of TREM2 associated with the risk of Alzheimer's disease. New England Journal of Medicine. 368 (2), 107-116 (2013).
  7. Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).
  8. Colonna, M., Butovsky, O. Microglia Function in the Central Nervous System During Health and Neurodegeneration. Annual Review of Immunology. 35, 441-468 (2017).
  9. Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
  10. Hammond, T. R., et al. Single-Cell RNA Sequencing of Microglia throughout the Mouse Lifespan and in the Injured Brain Reveals Complex Cell-State Changes. Immunity. 50 (1), 253-271 (2019).
  11. Van Hove, H., et al. A single-cell atlas of mouse brain macrophages reveals unique transcriptional identities shaped by ontogeny and tissue environment. Nature Neuroscience. 22 (6), 1021-1035 (2019).
  12. Chen, G., Ning, B., Shi, T. Single-Cell RNA-Seq Technologies and Related Computational Data Analysis. Frontiers in Genetics. 10, 317(2019).
  13. Svensson, V., et al. Power analysis of single-cell RNA-sequencing experiments. Nature Methods. 14 (4), 381-387 (2017).
  14. Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
  15. Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  16. Ziegenhain, C., et al. Comparative Analysis of Single-Cell RNA Sequencing Methods. Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).
  17. Tabula Muris, C., et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).
  18. Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. Isolation and Culture of Microglia. Current Protocols in Immunology. 125 (1), 70(2018).
  19. Haimon, Z., et al. Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies. Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).
  20. Collins, H. Y., Bohlen, C. J. Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium. Journal of Visualized Experiments. (133), e57122(2018).
  21. Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9, 147(2012).
  22. Swartzlander, D. B., et al. Concurrent cell type-specific isolation and profiling of mouse brains in inflammation and Alzheimer's disease. Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (13), 121109(2018).
  23. Hennig, B. P., et al. Large-Scale Low-Cost NGS Library Preparation Using a Robust Tn5 Purification and Tagmentation Protocol. G3. 8 (1), Bethesda. 79-89 (2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Mikroglia zolasyonuBeyin B lgesi DiseksiyonuAk Sitometrisi ile Ay rmaMiyelin Giderme BoncuklarFACS Tamponu Haz rlamaCD45 CD11B BoyamaH cre Canl l De erlendirmesiK t phane Haz rlama ProtokolDerin Sekanslama Analizi
Derin Tek Hücreli RNA Sıralamaiçin Bir Yetişkin Fare Beyin Yarımküre'den Bölgeye Özgü MikrogliaNın İzolasyon
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.