Bu protokol, referanssız, çekiş kuvveti mikroskobu olarak kullanılmak üzere poli (etilen glikol) bazlı hidrojellere gömülü üç boyutlu floresan fidüyal belirteçdizilerini imal etmek için multifoton litografinin uygulanması için talimatlar sağlar. Platform. Bu talimatlar kullanılarak, 3B malzeme gerinimölçümü ve hücresel çekişlerin hesaplanması, yüksek iş gücü kuvveti ölçümlerini teşvik etmek için basitleştirilmiştir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Referanssız Çekiş Kuvveti Mikroskopi Platformunun İmalatı ve Uygulanması
Bu makalede
Özet
Özet
Hücre kaynaklı malzeme deformasyonunun ölçülmesi, hücrelerin mikro çevrelerinin fiziksel özelliklerini nasıl algılayıp tepki verdikleri hakkında yararlı bilgiler sağlar. Hücre kaynaklı malzeme gerilmelerini ölçmek için birçok yaklaşım mevcut olmakla birlikte, burada sub-mikron çözünürlüğü ile gerinimin referanssız bir şekilde izlenmesi için bir metodoloji salıyoruz. İki fotonlu aktif fotolitografik desenleme işlemini kullanarak, üç boyutlu () üç boyutlu olarak kolayca ölçmek için, floresan fiducial belirteçlerin gömülü dizilerini içeren mekanik ve biyo-aktif olarak tunable sentetik yüzeylerin nasıl üretilebildiğini gösteriyoruz. Yüzey çekişlerine yanıt olarak 3D) malzeme deformasyon profilleri. Bu yüzeyler kullanılarak, hücre gerilimi profilleri ilgi bir hücrenin tek bir 3B görüntü yığını kullanılarak eşlenebilir. Bu metodoloji ile amacımız, özellikle alana yeni gelen hücresel mekanotransdüksiyon süreçlerini inceleyen araştırmacılar için çekiş kuvvetini mikroskobu daha erişilebilir ve uygulaması daha kolay hale getirmektir.
Giriş
Çekiş kuvveti mikroskobu (TFM), yapışık ve kontraktil hücre tarafından oluşturulan fiduyal belirteçlerin enterpolasyonlu yer değiştirme alanlarını kullanarak hücresel çekişlere yaklaşma işlemidir. TFM kullanılarak, hücre dışı ortamdaki mekanik ipuçlarının çoğalma, farklılaşma ve göç gibi önemli hücresel süreçler üzerindeki etkisi1,2,3,4 ,5,6,7,8,9,
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. BIR PEGDA baz hidrojel fotopolimerizasyonu
-
Toplama Reaktifleri
- Collect lityum fenil-2,4,6-trimethylbenzoillphosphinate (LAP), 3.4 kDa poli (etilen) glikol diacryat (PEGDA), n-vinil pyrrolidone (NVP), AlexaFluor 488 PEGDA (PEG-488), AlexaFluor 633 etiketli PEGDA (PEG-633) ve PEGYlated RGİD peptid ( PEG-RGDS) kendi dondurucularından ve her biri oda sıcaklığına getirmek.
- Ayrı kehribar mikrosantrifüj tüplerinde 3 mg LAP, 10 mg PEGDA, 5 mg PEG-488, 20 mg PEG-633 ve 6 mg RGDS peptid ölçün.
-
Ön Polimer Çözeltisinin Hazırlanması
- LAP'i 1 mL fosfat tamponlu salin (PBS, pH 7.4) ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Protokol boyunca, desenleme yordamının kalitesini değerlendirmek için geribildirim sağlayan bir dizi denetim noktası vardır. Bu denetim noktalarının her birinde ilerlemenin nasıl değerlendirilene ne kadar iyi değerlendirildiği hakkında bazı bilgiler sağlamak için, gerçek bir deneyin temsili sonuçlarını sağlarız. Sonuçlar, insan göbek ven endotel hücrelerinin (HUVECs) TFM analizi için hazırlanan fotopatlanmış hidrojel üzerinde yapılan bu protokolün uygulanmasını vurgulamaktadır. Sonuçlar, her kritik adımda ham görüntü ver.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu protokolün amacı, TFM verilerinin üretimi ve analizi ile ilgili zorlukların çoğunu hafifleten bir iş akışı sağlamaktır. Bir kez hazırlanan, fotodesenli hidrojeller kullanımı basit, standart doku kültürü uygulamaları ve floresan mikroskopi sadece bilgi gerektiren. Referanssız yönü hücre yüklü hidrojeller üzerinde kaygısız navigasyon sağlar ve referans ve deforme görüntüler arasında görüntü kaydı gibi hantal görüntü işleme adımları ortadan kaldırır. Elde edilen analiz neredeyse tamamen otomatiktir ve tek tek COI'lerden .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
O. A. Banda, NSF IGERT SBE2 bursu (1144726), Delaware Üniversitesi tarafından sağlanan başlangıç fonları ve Ulusal Sağlık Enstitüleri/Ulusal Kanser Enstitüsü IMAT Programı (R21CA214299) tarafından finanse edilerek desteklenmiştir. JHS, Ulusal Sağlık Enstitüleri/Ulusal Kanser Enstitüsü IMAT Programı (R21CA214299) ve National Science Foundation CAREER Award Program (1751797) tarafından desteklenmiştir. Mikroskopi erişimi NIH-NIGMS (P20 GM103446), NSF (IIA-1301765) ve Delaware Eyaleti'nden gelen hibelerle desteklenmiştir. Yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu, Delaware Eyaleti Federal Araştırma ve Geliştirme Hibe Programı'ndan (16A00471) gelen fonlarla satın alınmıştır. ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Akrodisk Şırınga Filtresi, 0.2 & mu; m Supor Membran, Düşük Protein Bağlayıcı | Pall | PN 4602 | Baz jel sentezi ve sonraki litografi adımlarından önce makromer çözeltilerinin filtrelenmesine izin verir. |
| Akrilat-Silan İşlevselleştirilmiş # 1.5 Lameller | ev içi< / em > < | > ev içi< / em> | Akrilatlar, hidrojelleri hareketsiz hale getirmek için baz hidrojelin cam yüzeye bağlanmasına izin verir. Referansa bakın: 21-24 |
| Axio-Observer Z1, Apotome | Zeiss | Broadfield mikroskobu ile TFM için görüntü yakalamak için kullanılan yapılandırılmış aydınlatma modülüne sahip. | |
| Bukalemun Vizyon ii | Tutarlı A.Ş. | Çoklu foton litografi için kullanılan lazer tarama mikroskobu ile donatılmıştır. | |
| Çift Taraflı Bant, 9500PC, 6.0 mil | 3M | akrilat-silan işlevselleştirilmiş lamelleri Petri kaplarına bağlar. | |
| Flexmark90 PFW Liner | FLEXcon | FLX000620 | Bandın plotter'a beslenmesini sağlayan çift taraflı bandın astarlanmasını sağlar. |
| LSM-880 | Zeiss | Lazer Tarama mikroskobu, Çoklu Foton Litografi için kullanılır. | |
| MATLAB | Mathworks | R2018a | Mikroskop için litografi talimatları oluşturmak ve TFM verilerinin analizi için özel komut dosyaları çalıştırır. |
| Model SC Plotter | USCutter | SC631E | Lamelleri petri kaplarına bağlamak için çift taraflı bandı halkalar halinde keser. |
| Objektif C-Apochromat 40x/1.20 W Corr M27 | Zeiss | Hem litografi hem de TFM için kullanılmak üzere hem geniş alan mikroskobu hem de lazer tarama mikroskobu ile donatılmıştır. | |
| PEG-AF633 | in-house | in-house | Referans belirteçleri oluşturmak için florofor etiketli akrilat PEG varyantı. Referansa bakın: 21 |
| PEG-DA | in-house | in-house | Hidrojeller için temel malzeme. Referansa bakın: 21 |
| PEG-RGDS | in-house | em<>in-house | RGDS hücre yapışmasını teşvik etmek için peptit etiketli mono-akrilat PEG varyantı. Referansa bakın: 21 |
| Petri Kabı | CELLTREAT | 229638 | Baz hidrojellere uyacak şekilde bir karot ucu kullanılarak her bir kabın ortasına 8 mm'lik delikler açılır. |
| Sylgard 184 Silikon Elastomer Kiti | Dow Corning | 3097358-1004 | Baz hidrojel kalınlığını (diğer adıyla PDMS) kontrol etmek için ara parçalar oluşturmak için. |
| Şırınga, Leur-Lok, 1 mL | BD | 309628 | Baz jel sentezi ve sonraki litografi adımlarından önce makromer çözeltilerinin filtrelenmesine izin verir. |
| UV Lambası | UVP | Blak-Ray® B-100AP | Baz hidrojeli polimerize eder. |
| 1-vinil-2-pirolidinon (NVP) | Sigma-Aldrich | V3409-5G | Radikal hızlandırıcı ve ko-monomer. Litografi sırasında pegile florofor katılımını iyileştirir. |
Kaynaklar
- Rauskolb, C., Sun, S., Sun, G., Pan, Y., Irvine, K. D. Cytoskeletal tension inhibits Hippo signaling through an Ajuba-Warts complex. Cell. 158 (1), 143-156 (2014).
- Huang, S., Chen, C. S., Ingber, D. E.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
