Method Article

Çok Hücreli Üç Boyutlu Spheroidler Üretmek için Lab-on-a-CD Platformu

DOI:

10.3791/60399

⸱

November 7th, 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Mechanical Engineering, Graduate School, Chung-Ang University, 2Department of Biomedical Engineering, College of Medicine, Seoul National University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz hücre küresel leri yetiştirmek için bir motor destekli santrifüj mikroakışkan cihaz satıyoruz. Bu cihazı kullanarak, tek veya birden fazla hücre tiplerinin küresel leri yüksek yerçekimi koşullarında kolayca cokültüre edilebilir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Üç boyutlu küresel hücre kültürü hücre deneylerinde daha yararlı sonuçlar elde edebilir çünkü canlı vücudun hücre mikro ortamlarını iki boyutlu hücre kültüründen daha iyi simüle edebilir. Bu çalışmada, yüksek santrifüj kuvvet uygulayan üç boyutlu (3D) hücre küreselleri oluşturmak için santrifüj mikroakışkan tabanlı küresel (CMS) kültür sistemi adı verilen, motorlu laboratuvar-on-a-CD (kompakt disk) platformu imal ettik. Bu cihaz 1 x g ile 521 x garasında yerçekimi koşulları oluşturmak için dönüş hızlarını değiştirebilirsiniz. CMS sistemi 6 cm çapında, yüz 400 μm mikrowells vardır ve bir bilgisayar sayısal kontrol makinesi tarafından önceden yapılmış bir polikarbonat kalıp polidimethylsiloxane ile kalıplama tarafından yapılır. CMS sisteminin kanal girişindeki bir bariyer duvarı, çipin içindeki hücreleri eşit olarak yaymak için santrifüj kuvveti kullanır. Kanalın sonunda, hücrelerin mikrokuyulara girmesini sağlayan bir slayt bölgesi vardır. Bir gösteri olarak, küresel ler sistemi kullanarak yüksek yerçekimi koşulları altında insan yağ kaynaklı kök hücre ve insan akciğer fibroblastlarının monokültür ve coculture tarafından üretildi. CMS sistemi, konsantrik, Janus ve sandviçin çeşitli yapılarının ortak kültür spheroidlerini üretmek için basit bir operasyon şeması kullansın. CMS sistemi, tek veya birden fazla hücre tipinin küresel ve organoid kültürünü gerektiren hücre biyolojisi ve doku mühendisliği çalışmalarında yararlı olacaktır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biyolojik in vivo mikroortamları üç boyutlu (3D) küresel hücre kültürüne sahip simüle etmek, fizyolojik olarak daha gerçekçi deneysel üretmek için iki boyutlu (2D) hücre kültürüne (örn. geleneksel Petri kabı hücre kültürü) göre daha kolaydır. sonuçlar1. Şu anda mevcut küresel oluşum yöntemleri asma damla tekniği2dahil , sıvı-bindirme tekniği3, karboksimetil selüloz tekniği4, manyetik kuvvet tabanlı mikroakışkan tekniği5, ve kullanımı biyoreaktörler6. Her yöntemin kendine has yararları olmasına rağmen, tekrarlanabilirlik, üretkenlik ve kokültür spheroidlerinin üretilmesinde daha fazla iyileşme gereklidir. Örneğin, manyetik kuvvet tabanlı mikroakışkan teknik5 nispeten ucuz olmakla birlikte, güçlü manyetik alanların canlı hücreler üzerindeki etkileri dikkatle düşünülmelidir. Mezenkimal kök hücre farklılaşması ve çoğalması çalışmalarında özellikle sferoid kültürün yararları, çeşitli çalışmalarda bildirilmiştir7,8,9.

Santrifüj mikroakışkan sistem, aynı zamanda lab-on-a-CD (kompakt disk) olarak bilinen, kolayca içinde sıvı kontrol etmek ve substrat rotasyon istismar için yararlıdır ve böylece immünoassays10gibi biyomedikal uygulamalarda kullanılmıştır , biyokimyasal belirteçleri tespit etmek için kolorimetrik tahliller11, nükleik asit amplifikasyon (PCR) tahlilleri, otomatik kan analiz sistemleri12, ve all-in-one santrifüj mikroakışkan cihazlar13. Sıvıyı kontrol eden itici güç, rotasyontarafından oluşturulan merkezcil kuvvettir. Ayrıca, karıştırma, değerleme ve örnek bölme birden fazla işlevleri sadece bu tek CD platformu yapılabilir. Ancak, yukarıda bahsedilen biyokimyasal analiz yöntemleri ile karşılaştırıldığında, kültür hücrelerine CD platformları uygulayarak daha az çalışma olmuştur, özellikle küresel ler14.

Bu çalışmada santrifüj mikroakışkan esaslı küresel (CMS) sisteminin insan yağkaynaklı kök hücrelerin (hASC) ve insan akciğer fibroblastlarının monokültür veya kokültür ile performansını gösterdik (MRC-5). Bu yazı, grubumuzun araştırma metodolojisi15'iayrıntılı olarak açıklamaktadır. Böylece, küresel kültür lab-on-a-CD platformu kolayca çoğaltılabilir. CMS kültür çipi, yonga tutucu, DC motor, motor montaj ve dönen bir platformdan oluşan bir CMS üretim sistemi sunulmaktadır. Motor montaj akrilonitril bütadien stiren (ABS) ile basılmış 3D. Talaş tutucu ve dönen platform PC (polikarbonat) ile işlenmiş CNC (bilgisayar sayısal kontrol) vardır. Motorun dönüş hızı, darbe genişliği modülasyonuna dayalı bir PID (orantılı-integral-türevi) algoritması kodlayarak 200 ile 4.500 rpm arasında kontrol edilir. Boyutları 100 mm x 100 mm x 150 mm olup 860 g ağırlığındadır ve kullanımı kolaydır. CMS sistemi kullanılarak, küresel ler çeşitli yerçekimi koşulları altında oluşturulabilir 1 x g 521 x g,böylece yüksek yerçekimi altında hücre farklılaşma promosyon çalışma 2D hücrelerden uzatılabilir16,17 için 3D küresel. Çeşitli hücre türlerinin coculture da etkili in vivo ortamda taklit etmek için önemli birteknolojidir 18. CMS sistemi kolayca monokültür spheroids üretebilir, yanı sıra çeşitli yapı türlerinin coculture sheroids (örneğin, konsantrik, Janus, ve sandviç). CMS sistemi sadece basit küresel çalışmalarda değil, aynı zamanda 3Boyutlu organoid çalışmalarda, insan organ yapılarını göz önünde bulundurmak için kullanılabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Santrifüj mikroakışkan esaslı küresel (CMS) kültür çipi imalatı

  1. CNC işleme ile CMS kültür yongasının üst ve alt katmanları için PC kalıpları yapın. Çipin ayrıntılı boyutları Şekil 1'deverilmiştir.
  2. 5 dakika için 10:1 (w/w) oranında PDMS tabanını ve PDMS kür leme maddesini karıştırın ve hava kabarcıklarını temizlemek için 1 saat boyunca kurutucuya yerleştirin.
  3. CMS kültür çipkalıpiçine PDMS karışımı döktükten sonra, 1 saat daha fazla hava kabarcıkları kaldırmak ve 2 saat için 80 °C'de bir ısı odasında tedavi.
  4. Yüzeylere bakacak şekilde vakumlanmış plazma temizleyicisine yerleştirin ve 30 s için 18 W güçte hava destekli plazmaya maruz bırakın.
  5. CMS kültür çipinin iki tabakasını bağlayıp yapışma gücünü artırmak için 80 °C'de 30 dk ısı haznesine yerleştirin.
  6. CMS kültür çipini 121 °C ve 15 psi'de otoklav sterilizatörde sterilize edin.

2. Hücre hazırlama

  1. 5 × 105–1 × 106 hASCveya MRC-5s hücrelerini içeren şişenin 1 mL'ini 36,5 °C'de 2 dk su banyosunda eritin.
  2. Bir şişeye 1 mL Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortası (DMEM) ekleyin ve 1.000 μL'lik pipetle hafifçe karıştırın.
  3. DMEM'in 15 mL'ini 36,5 °C'ye kadar önceden ısıtılmış bir pipet kullanarak 150 mm çapındaki Petri kabına koyun ve şişedeki hücreleri ekleyin.
  4. 1 gün sonra DMEM'i aspire edin ve 15 mL taze DMEM ile değiştirin. Daha sonra, her 2 veya 3 günde bir ortamı değiştirin.
  5. Hücreleri Petri kabından ayırmak için Petri tabaklarına 4 mL tripsin ekleyin ve 4 dakika boyunca 36,5 °C'de bir kuvöze ve %5 CO2'ye yerleştirin.

3. Monokültür küresel formasyonu

  1. 2,5 mL% 4 (w / v) pluronic F-127 çözeltisi CMS kültür çipi(Şekil 2A)giriş deliğine 500-1.000 rpm yonga dönerken ve daha sonra CMS sistemi(Şekil 2B)kullanarak 3 dakika için 4.000 rpm fiş döndürün .
    NOT: Pluronik kaplama, talaş dönerken giriş portuna hücre bağlanmasını önler. Havanın mikrokuyularda sıkışmadığından emin olun.
  2. CmS kültür çipi pluronik çözelti ile bir gecede 36,5 ° C 5% CO2dolu kuluçka .
  3. Pluronik çözeltiyi çıkarın, kalan pluronik solüsyonu DMEM ile yıkayın ve talaş temiz bir tezgahta 12 saat kurulayın.
  4. CMS kültür çipine 2,5 mL DMEM ekleyin ve çipin içini ıslatmak için 3 dakika boyunca ~4.000 rpm'de çipi döndürün.
  5. Hücre süspansiyonuna yer açmak için dönüşü durdurun ve 100 μL DMEM çekin.
  6. 5 × 105 hASC veya 8× 105 MRC-5s içeren hücre süspansiyonları 100 μL ekleyin düzgün bir şekilde yeniden süspansiyon için 3-5x pipetleme ederek hücreleri dağıtın.
  7. 3 dakika boyunca 3000 rpm'de çipi döndürerek her mikrokuyudaki hücreleri santrifüj kuvvetle tuzağa düşürün.
    NOT: Aşırı dönme hızı çözelti fırlatma deliklerinden hücre kaçışına neden olabilir.
  8. Kültür 36.5 °C, >95% nem ve% 5 CO2,1.000-2.000 rpm dönen kuvözde 3 gün boyunca hücreleri. Kültür ortamını her gün değiştirin.

4. Eşkültür küresel oluşumu

  1. Eşmerkezli küresel ler oluşumu
    1. İlk hücreleri ekleyin, 2.5 × 105 hASCs, ve 3.000 rpm de çip döndürün. 3 dakika sonra, ikinci hücreleri ekleyin, 4 × 105 MRC-5s, ve 3 dk için 3.000 rpm de çip döndürün. Hücreler enjekte edildiğinde, dönme hızını 500-1.000 rpm'ye kaydırın.
    2. Kültür kuvöz hücreleri 36.5 °C, >95% nem% ve 5% CO2 1.000-2.000 rpm döner ekinde. Eşmerkezli küreseller 24 saat içinde oluşturulur. Uzun vadeli kültür için, kültür ortamını her gün değiştirin.
  2. Janus küresel formasyonu
    1. Çip 500-1.000 rpm'de dönerken pipetleme yaparak ilk hücreleri içeren 100 μL hücre süspansiyonları ekleyin, 2,5 × 105 hASC. Daha sonra, 3 dakika için 3.000 rpm de çip döndürün.
    2. Çipi 36,5 °C, >%95 nem ve %5 CO2'de 1.000-2.000 rpm'de 3 saat boyunca döndürerek kuluçkaya yatırın.
    3. Talaş 500-1.000 rpm'de dönerken pipetleme yaparak ikinci hücre kümesi olan 4 × 105 MRC-5s içeren hücre süspansiyonlarının 100 μL'sini ekleyin. Daha sonra, 3 dakika için 3.000 rpm de çip döndürün.
    4. Kültür kuvöz hücreleri 36.5 °C, >95% nem, ve 5% CO2 1.000-2.000 rpm dönerek. Janus küresel leri 24 saat içinde oluşturulur. Uzun vadeli kültür için, kültür ortamını her gün değiştirin.
  3. Sandviç küresel formasyonu
    1. Çip 500-1.000 rpm'de dönerken pipetleme yaparak ilk hücreleri içeren 100 μL hücre süspansiyonları ekleyin. Daha sonra, 3 dakika için 3.000 rpm de çip döndürün.
    2. Çipi 36,5 °C, >%95 nem ve %5 CO2'de 1.000-2.000 rpm'de 3 saat boyunca döndürerek kuluçkaya yatırın.
    3. İkinci hücreleri içeren hücre süspansiyonları 100 μL ekleyin, 3 × 105 MRC-5s, çip 500-1.000 rpm dönerken pipetleme tarafından. Daha sonra, 3 dakika için 3.000 rpm de çip döndürün.
    4. Çipi 36,5 °C, >%95 nem oranı ve %5 CO2'de 1.000-2.000 rpm'de 3 saat boyunca döndürerek kuluçkaya yatırın.
    5. Üçüncü hücreleri içeren hücre süspansiyonları 100 μL ekleyin, 1.5 × 105 hASCs, çip 500-1.000 rpm dönerken pipetleme tarafından. Daha sonra, 3 dakika için 3.000 rpm de çip döndürün.
    6. Kültür kuvöz hücreleri 36.5 °C, >95% nem% ve 5% CO2 1.000-2.000 rpm döner ekinde. Sandviç küreselleri 12 saat içinde oluşturulur. Uzun vadeli kültür için, kültür ortamını her gün değiştirin.

5. Hücre boyama

  1. Hücre floresan boyasını oda sıcaklığına (20 °C) ısıtın.
  2. 1 mM çözeltisi yapmak için şişe başına 20 μL susuz dimetilsülfoksit (DMSO) ekleyin.
  3. DMEM kullanarak floresan'ı 1 μM'lik son çalışma konsantrasyonuna seyreltin.
  4. Hücre süspansiyonuna floresan ekleyin ve pipet kullanarak yavaşça askıya alın.
  5. 36,5 °C'de 20 dk inkübün, nem >%95 ve %5 CO2.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yukarıdaki protokole göre 6 cm çapında CMS kültür çipi(Şekil 2)başarıyla yapılmıştır. İlk olarak, çip bir üst tabaka ve bir alt tabakadan ayrı olarak yapılmış ve daha sonra plazma yapıştırma ile birbirine bağlanmış. Elde edilen küreseloidler çipi ayırarak kolayca toplanabilir. CMS kültür yongasının kanalı bir giriş portu ve merkezi, slayt ve microwell bölgelerinden oluşur(Şekil 3). Hücre, orta ve pluronik çözeltiler 5 mm çapında bir giriş deliğinden enjekte edil...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CMS, enjekte edilen tüm hücrelerin atık olmadan mikrokuyu girdiği kapalı bir sistemdir ve bu da onu geleneksel mikrowell bazlı küresel üretim yöntemlerinden daha verimli ve ekonomik hale getirir. CMS sisteminde, ortam her 12-24 saatte bir çipteki ortamı çıkarmak için tasarlanmış bir emme deliğinden değiştirilir(Şekil 3A). Ortam emme işlemi sırasında, ortam ve mikrokuyu duvarı arasındaki yüzey gerilimi nedeniyle mikrokuyunun içinden neredeyse hiç ortam kaçamaz. PDMS'den yapılmış çip elastik v...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma, NMG'nin Temel Bilim Araştırma Programı (2016R1D1A1B03934418) ve NMG'nin Bio & Medical Technology Development Program (2018M3A9H1023141) tarafından desteklenmiş ve Kore hükümeti MSIT tarafından finanse edilmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
3D yazıcıCubicon3DP-210F
Yağ kaynaklı mezenkimal kök hücreler (hASC)ATCCPCS-500-011
Antibiyotik-AntimikotikGibco15240-062Tamamlanmış ortamın ve tamponun %1'ini içeriyordu
CellTracker Yeşil CMFDAThermo Fisher ScientificC292510 mM
CellTracker Kırmızı CMTPXThermo Fisher BilimselC3455210 mM
Bilgisayar sayısal kontrol (CNC) döner oyma makinesiRoland DGAEGX-350
DC motorNurielectricity Inc.MB-4385E
Dimetilsülfoksit (DMSO)Sigma AldrichD2650
Dulbecco'nun modifiye edilmiş eaggle'ın ortamı (DMEM)ATCC30-2002
Dulbecco'nun fosfat tamponlu salin (D-PBS)ATCC30-2200
Fetal sığır serumuATCC30-2020Tamamlanmış orta insan akciğer fibroblastlarının% 10'unu
içeriyordu (MRC-5)ATCCCCL-171
Inventor 2019Autodesk3D bilgisayar destekli tasarım programı
Petri kabı ve Phi; 150 mmJetBiofillCAD010150Yüzey İşlem Görmüş
Plazma temizleyiciHarrick PlasmaPDC-32G
Pluronic F-127Sigma Aldrich11/6/9003Fosfat tamponlu tuzlu su ile %4 (a/h) çözeltiye
Polikarbonat (PC)AcrylmallAC15PC200 x 200 x 15 mm
Polidimetilsiloksan (PDMS)DowcorningSylgard 184
TripsinGibco12604021
seyreltin

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Paul Solomon, F. D. 3D cell culture systems: Advantages and applications. Journal of Cellular Physiology. 230 (1), 16-26 (2015).
  2. Tung, Y. C., et al. High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array. Analyst. 136 (3), 473-478 (2011).
  3. Sutherland, R., Carlsson, J., Durand, R., Yuhas, J. Spheroids in Cancer Research. Cancer Research. 41 (7), 2980-2984 (1981).
  4. Korff, T., Krauss, T., Augustin, H. G. Three-dimensional spheroidal culture of cytotrophoblast cells mimics the phenotype and differentiation of cytotrophoblasts from normal and preeclamptic pregnancies. Experimental Cell Research. 297 (2), 415-423 (2004).
  5. Yaman, S., Anil-Inevi, M., Ozcivici, E., Tekin, H. C. Magnetic force-based microfluidic techniques for cellular and tissue bioengineering. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, (2018).
  6. Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
  7. Cesarz, Z., Tamama, K. Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells International. 2016, (2016).
  8. Li, Y., et al. Three-dimensional spheroid culture of human umbilical cord mesenchymal stem cells promotes cell yield and stemness maintenance. Cell and Tissue Research. 360, 297-307 (2015).
  9. Yamaguchi, Y., Ohno, J., Sato, A., Kido, H., Fukushima, T. Mesenchymal stem cell spheroids exhibit enhanced in-vitro and in-vivo osteoregenerative potential. Bmc Biotechnology. 14 (1), 105(2014).
  10. Koh, C. Y., et al. Centrifugal microfluidic platform for ultrasensitive detection of botulinum toxin. Analytical Chemistry. 87 (2), 922-928 (2015).
  11. Steigert, J., et al. Direct hemoglobin measurement on a centrifugal microfluidic platform for point-of-care diagnostics. Sensors and Actuators, A: Physical. 130-131, 228-233 (2006).
  12. Park, Y. -S., et al. Fully automated centrifugal microfluidic device for ultrasensitive protein detection from whole blood. Journal of Visualized Experiments. (110), e1(2016).
  13. Lee, A., et al. All-in-one centrifugal microfluidic device for size-selective circulating tumor cell isolation with high purity. Analytical Chemistry. 86 (22), 11349-11356 (2014).
  14. Gorkin, R., et al. Centrifugal microfluidics for biomedical applications. Lab on a Chip. 10 (14), 1758-1773 (2010).
  15. Park, J., Lee, G. H., Yull Park, J., Lee, J. C., Kim, H. C. Hypergravity-induced multicellular spheroid generation with different morphological patterns precisely controlled on a centrifugal microfluidic platform. Biofabrication. 9 (4), (2017).
  16. Rocca, A., et al. Barium titanate nanoparticles and hypergravity stimulation improve differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblasts. International Journal of Nanomedicine. 10, 433-445 (2015).
  17. Genchi, G. G., et al. Hypergravity stimulation enhances PC12 neuron-like cell differentiation. BioMed Research International. 2015, (2015).
  18. Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Lab on a CD PlatformCentrifugal Microfluidic System3D Cell SpheroidsHuman Adipose Stem CellsHuman Lung FibroblastsPDMS MoldingCNC MachiningPlasma BondingCentrifugal Force DepositionMicrowell Array Culture

Related Articles