Burada, silikon yağı intrakalik enjeksiyonu ve ön hazneden silikon yağı kaldırma prosedürü ile fare gözlerinde oküler hipertansiyon ve glokom nörodejenerasyon indüklemek için bir protokol sunmak yüksek göz içi basıncı dönmek için Normal.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Farelerde Geri Dönüşümlü Silikon YağA Bağlı Oküler Hipertansiyon Modeli
Bu makalede
Özet
Özet
Yüksek göz içi basıncı (IOP) glokom için iyi belgelenmiş bir risk faktörüdür. Burada, insan vitreoretinal cerrahisinde tamponad ajanı olarak silikon yağı (SO) kullanımının postoperatif komplikasyonu taklit eden farelerde sürekli olarak istikrarlı IOP yükselmesini indükleyen yeni ve etkili bir yöntemi açıklıyoruz. Bu protokolde SO, göz bebeğini engellemek ve sulu mizah girişini önlemek için fare gözünün ön odasına enjekte edilir. Arka oda sulu mizah birikir ve bu da arka segmentin IOP artırır. Tek bir SO enjeksiyonu güvenilir üretir, yeterli, ve istikrarlı IOP yükseklik, hangi önemli glokom nörodejenerasyon indükler. Bu model göz kliniğinde ikincil glokom gerçek bir kopya. Daha fazla klinik ayarı taklit etmek için, SO drenaj yolunu yeniden açmak ve ön oda açısında trabeküler meshwork (TM) ile boşaltılır sulu mizah, girişine izin ön odasından kaldırılabilir. IOP hızlı bir şekilde normale döndüğünden, model glokom retinaganglion hücreleri üzerinde IOP düşürücü etkisini test etmek için kullanılabilir. Bu yöntem basittir, özel ekipman veya tekrar prosedürleri gerektirmez, klinik durumları yakından simüle eder ve çeşitli hayvan türleri için uygulanabilir. Ancak, küçük değişiklikler gerekebilir.
Giriş
Retina ganglion hücrelerinin ilerleyici kaybı (RGCs) ve aksonlar glokom, retinada yaygın bir nörodejeneratif hastalık özelliğidir1. 2040 yılına kadar 40−80 yaş ları arasında 100 milyondan fazla kişiyietkileyecektir. IOP glokom gelişimi ve ilerlemesinde tek değiştirilebilir risk faktörü olmaya devam etmektedir. Glokomun patogenezini, progresyonunu ve potansiyel tedavilerini araştırmak için, insan hastalarının temel özelliklerini kopyalayan güvenilir, tekrarlanabilir ve indükedilemez deneysel oküler hipertansiyon/glokom modeli zorunludur.
IOP, arka haznedeki siliyer gövdeden ön odaya sulu mizah girişine ve ön odanın açısında trabeküler meshwork (TM) ile çıkışa bağlıdır. Sabit bir duruma ulaştıktan sonra, IOP korunur. Giriş, çıkış sınırını aştığında veya daha az olduğunda, IOP sırasıyla yükselir veya düşer. Ön odanın açısını tıkararak veya TM'ye zarar vererek sulu çıkışazalarak3,4,5,6,7,8,9,10olmak üzere çeşitli glokom modelleri oluşturulmuştur. Bu modeller normalde geri dönüşümsüz göz dokusu hasarı ile ilişkilidir, ve ön odada yüksek IOP da kornea ödemi ve göz içi iltihabı gibi istenmeyen komplikasyonlara neden olur, hangi retinagörüntüleme ve görsel fonksiyon tahlilleri yapmak ve yorumlamak zor olun.
Bu eksikliklerin üstesinden gelen bir model geliştirmek için, insan vitreoretinal cerrahi nin ameliyat sonrası komplikasyonu olarak ortaya çıkan silikon yağının (SO) neden olduğu iyi belgelenmiş sekonder glokoma odaklandık11,12. SO, yüksek yüzey gerilimi nedeniyle retinal ameliyatlarda tamponad olarak kullanılır. Ancak, SO fiziksel olarak ön odaya sulu akışını önler sulu ve vitreus sıvıları, daha hafif olduğu için gözbebeği tıkayabilirsiniz. Tıkanıklık sulu mizah birikimi nedeniyle arka odada IOP yükselmesine neden olur. Bu geliştirmek ve intracameral SO enjeksiyonu ve pupillary blok13dayalı yeni bir oküler hipertansiyon fare modeli karakterize bizi motive , ikincil glokom temel özellikleri ile: etkili pupillary blok, SO kaldırma sonra normale dönebilirsiniz önemli IOP yüksekliği, ve glokom nörodejenerasyon.
Burada fare gözüne SO enjeksiyonu, çıkarılması ve IOP ölçümü dahil olmak üzere SO'ya bağlı oküler hipertansiyon için ayrıntılı bir protokol sokulduk.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm prosedürler Stanford Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. So intracameral enjeksiyon ile oküler hipertansiyon indüksiyonu
- Bir mikropipet oluşturmak için bir pipet puller ile bir cam kılcal çekerek intracameral SO enjeksiyon için bir cam mikropipet hazırlayın. Mikropipetin ucundaki bir açıklığı kesin ve 35°−40° açı yapmak için mikrodeğirmenci-beveling makinesiyle ucu daha da keskinleştirin.
- Cila lı yontucun kenarlarını temizleyin ve suyla yıkayarak tüm enkazları çıkarın. Kullanmadan önce mikropipetok.
- Kornea girişi için paracentesis iğne hazırlayın. Bunu yapmak için, luer kilidindeki 5 mL'lik şırıngaya 32 G iğne takın ve bantla daha da sabitleyin. İğne ucu nu 30°'de yukarı doğru bükün.
- So enjektörü önce 10 mL'lik bir şırıngaya 18 G iğne takarak ve emniyete alarak hazırlayın. Sonra bir ucunda 18 G iğne ile plastik bir tüp takın ve diğer ucundan gerektiği gibi SO ile doldurun.
- Sterilize edilmiş mikropipeti plastik boruya takın ve şırınga pistonluyu itin ve tüm mikro pipeti SO ile doldurun.
2. Bir göz için intracameral SO enjeksiyonu
- 9−10 haftalık erkek C57B6/J fareyi %3 izofluran oksijenle karıştırılmış bir indüksiyon odasına yerleştirin ve 3 dk boyunca 2 L/dk'da oksijenle karıştırın.
- İntraperitoneally enjekte 2,2,2-tribromoetanol 0.3 mg/g vücut ağırlığı.
NOT: Ketamin/ksilazin aksine, 2,2,2-tribromoetanol belirgin göz bebeği genişlemesine neden olmaz. - Bir parmak sıkışması yanıt eksikliği ve anestetik gücünü belirlemek için bıyık veya kuyruk hareket eksikliği olup olmadığını kontrol edin.
- Fareyi cerrahi platformda yanal bir konuma yerleştirin. İşlem sırasında hassasiyetini azaltmak için enjeksiyondan önce korneaya %0.5 proparacaine hidroklorür uygulayın.
- Limbustan yaklaşık 0,5 mm uzaklıktaki süperotemporal kadranda 32 G paracentesis iğnesi ile giriş kesisi yapın.
- Ön odaya piercing önce yaklaşık 0,3 mm için kornea katmanları ile Tünel. Lens veya iris dokunmamaya dikkat edin.
- Tünelden (paracentesis) ön odadan bazı sulu mizah (yaklaşık 1−2 μL) serbest bırakmak için iğneyi yavaşça geri çekin.
- IOP'yi daha da azaltmak için ~8 dk bekleyin. Bu kontralateral, kontrol gözü ölçülerek belirlenebilir.
- Kornea tünelinden SO ile önceden yüklenmiş cam mikropipeti ön odaya yerleştirin ve yontman iris yüzeyine bakacak şekilde.
- SO damlacık iris yüzeyinin en, ~ 2.3−2.4 mm çapında kaplayana kadar so ön hazneiçine SO enjekte etmek için şırınga piston yavaş yavaş itin.
- Mikropipeti yavaş yavaş çekmeden önce 10 s daha fazla ön haznede bırakın.
- SO sızıntısını en aza indirmek için üst göz kapağını kornea kesisini kapatmak için yavaşça itin.
- Göz yüzeyine antibiyotik merhem (bacitracin-neomisin-polimisin) uygulayın.
- İşlem boyunca, sık sık yapay gözyaşları ile kornea nemlendirin.
- Anestezi tamamen iyileşene kadar fareyi ısıtma yastığında tutun.
3. SO kaldırma
- Sulama sistemini hazırlayın.
- Sulama çözeltisini üreticinin talimatlarına göre hazırlayın ve sulama şişesine yerleştirin. Sulama çözeltisi şişesini ameliyat platformunun üzerinde 110−120 cm'ye (81−88 mmHg) yükseltin.
- Sulama çözeltisi şişesine bir IV uygulama seti takın. IV tüp hava kabarcıkları çıkarın. IV boruya kadar 20° yüze bükülmüş 33 G'lik bir iğne bağlayın.
- Drenaj sistemini hazırlamak için, 1 mL şırıngadan pistonu çıkarın. Şırıngaya 33 G iğne takın ve iğneyi 20°'ye kadar bükün.
- SO'yu ön odadan çıkarın.
- İntraperitoneally enjekte 2,2,2-tribromoetanol (0.3 mg/g vücut ağırlığı). Anestezik mukavemet ve bıyık veya kuyruk hareket eksikliği belirlemek için parmak çimdik yanıt eksikliği olup olmadığını kontrol edin.
- Fareyi bir ameliyat platformuna yerleştirin ve bantla yanal pozisyonda sabitleyin. Hassasiyetini azaltmak için korneaya %0.5 proparacaine hidroklorür damlatın.
- Önceden yapılmış 32 Gacentesi paracentesis iğnekullanarak SO damlacık kenarında ~ 2 ve 5 arasında korneanın temporal kadranda iki kesi ler olun.
- Bir kornea kesisi, maksimum hız ile sulama çözeltisi bağlı bir 33 G sulama iğnesi takın.
- So damlacık sulama çözeltisi ile sulama sırasında ön oda çıkmak için izin vermek için diğer kornea kesi ile bir piston olmadan şırınga bağlı başka bir 33 G drenaj iğnesi yerleştirin.
- Drenaj iğnesini, sonra da sulama iğnesini geri çek.
- Normal derinliğini korumak için ön odaya bir hava kabarcığı enjekte edin ve kornea kesisini kapatmak için basın.
- Her iki göze de antibiyotik merhem uygulayın.
- Anestezi tamamen iyileşene kadar fareyi ısıtma geri kazanım yastığında tutun.
4. Haftada bir Kez IOP ölçümü
- Fareyi 2L/dk'da oksijenle karıştırılmış %3 izofluran ile perdelik bir indüksiyon odasına yerleştirin.
- İntraperitoneally ksilazin ve ketamin enjekte (0.01 mg xylazine/g, 0.08 mg ketamin/g).
- İşlem boyunca yapay gözyaşı uygulayarak korneanemli tutun.
- Göz bebeğinin tam olarak dilate izin vermek için yaklaşık 15 dk bekleyin.
- Ürün talimatlarına göre bir tonometre kullanarak her iki gözün IOP'sini ölçün. Tonometreyi fare gözünün yanına getirin. Sondanın ucundan fare korneasına olan mesafeyi yaklaşık 3−4 mm. Tek bir okuma oluşturmak için ölçüm düğmesine 6x basın. Ortalama IOP'yi elde etmek için her gözden üç makine tarafından oluşturulan okuma elde edilir.
- SO enjeksiyonundan 8 hafta sonra hayvanları kurban edin ve tam montaj retina, RGC sayma, optik sinir (ON) yarı ince kesitlerin immünohistokimyasını ve13'tenönce tanımlanan aksonların niceliğini gerçekleştirin.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Enjeksiyondan kısa bir süre sonra, SO damlacıklarının çok küçük olması nedeniyle stabil oküler hipertansiyon üretmeyen fareleri kolayca tanımlayabiliriz (≤1.5 mm)13.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada SO intracameral enjeksiyon ile fare gözü sürekli IOP yükseklik indükleyen basit ama etkili bir prosedür göstermektedir. Bu işlem mikroskop altında mikrodiseksiyon deneyimi olan herkes tarafından hızlı bir şekilde öğrenilebilir. Birincil başarısızlık riski kornea kesisinden SO sızıntısıdır. Ancak, SO kullanmanın avantajlarından biri yağ damlacık görünür ve ölçülebilir olduğu için, biz kolayca enjeksiyondan kısa bir süre sonra istikrarlı oküler hipertansiyon neden ve sonraki deneyler onları dışlamak için çok küçük d...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
Bu çalışma NIH'nin YH'ye EY024932, EY023295 ve EY028106 hibeleri ile desteklenmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| % 0.5 proparakain hidroklorür | Akorn, Somerset | ||
| 10mL syinge | BD | Luer-Lok Ucu | |
| 18G iğne | BD | Düzenli Konik ile, İğne Uzunluğu: 25.4 mm | |
| 2,2,2-Tribromoetanol (Avertin) | Fisher Scientific | CAS # 75-80-9 | 50g |
| 32G nano | BD | 320122 | BD Nano Ultra İnce Kalem İğnesi-32G 4mm |
| 33G oftalmoloji iğnesi | TSK/ VWR | TSK3313/ 10147-200 | |
| 5 mL syinge | BD | Luer-Lok Ucu | |
| AnaSed Enjeksiyonu (ksilazin) | Butler Schein | 100 mg/ml, 50 ml | |
| suni gözyaşı | Alcon Laboratuvarları | 300651431414 | Systane Ultra Kayganlaştırıcı Göz |
| Damlası BSS PLUS Sulama solüsyonu | Alcon Laboratuvarları | ||
| Çift Kademeli Cam Mikropipet Çektirme | NARISHIGE | PC-10 | |
| EZ-7000 Klasik Sistem | EZ sistemi | ||
| İzofluran | VetOne | 502017 | izofluran, USP, 250ml/şişe |
| IV Yönetim setleri | EXELint / Fisher | 29081 | |
| KETAMIN HIDROKLORÜR ENJEKSIYONU | VEDCO | 50989-996-06 | KETAVED 100mg / ml * 10ml |
| microgrind kaynak ağzı açma makinesi | NARISHIGE | EG-401 | |
| Minyatür EVA Boru | McMaster-Carr | 1883T4 | 0,05" ID, 0,09" OD, 10 ft. Uzunluk |
| silikon yağı (SILIKON) | Alcon Laboratories | 8065601185 | 1.000 mPa.s |
| Standart Cam Kılcal Damarlar | WPI/ Fisher | 1B150-4 | 4 inç. (100mm) OD 1.5mm ID 0.84mm |
| TonoLab tonometre | Colonial Medical Supply, Finlandiya | ||
| veteriner antibiyotik merhem | Dechra Veteriner | 1223RX | BNP oftalmik merhem, Vetropolisin |
Kaynaklar
- Chang, E. E., Goldberg, J. L. Glaucoma 2.0: neuroprotection, neuroregeneration, neuroenhancement. Ophthalmology. 119 (5), 979-986 (2012).
- Tham, Y. C., et al. Global prevalence of glaucoma and projections of glaucoma burden through 2040: a systematic review and meta-analysis. Ophthalmology. 121 (11), 2081-2090 (2014).
- Pang, I. H., Clark, A. F. Rodent models for glaucoma retinopathy and optic neuropathy. Journal of Glaucoma. 16 (5), 483-505 (2007).
- Morrison, J. C., Johnson, E., Cepurna, W. O. Rat models for glaucoma research. Progress in Brain Research. 173, 285-301 (2008).
- McKinnon, S. J., Schlamp, C. L., Nickells, R. W. Mouse models of retinal ganglion cell death and glaucoma. Experimental Eye Research. 88 (4), 816-824 (2009).
- Chen, S., Zhang, X. The Rodent Model of Glaucoma and Its Implications. Asia Pacific Journal of Ophthalmology (Philadelphia). 4 (4), 236-241 (2015).
- Sappington, R. M., Carlson, B. J., Crish, S. D., Calkins, D. J. The microbead occlusion model: a paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 51 (1), 207-216 (2010).
- Chen, H., et al. Optic neuropathy due to microbead-induced elevated intraocular pressure in the mouse. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (1), 36-44 (2011).
- Cone, F. E., Gelman, S. E., Son, J. L., Pease, M. E., Quigley, H. A. Differential susceptibility to experimental glaucoma among 3 mouse strains using bead and viscoelastic injection. Experimental Eye Research. 91 (3), 415-424 (2010).
- Samsel, P. A., Kisiswa, L., Erichsen, J. T., Cross, S. D., Morgan, J. E. A novel method for the induction of experimental glaucoma using magnetic microspheres. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (3), 1671-1675 (2011).
- Ichhpujani, P., Jindal, A., Jay Katz, L. Silicone oil induced glaucoma: a review. Graefes Archieves for Clinical and Experimental Ophthalmology. 247 (12), 1585-1593 (2009).
- Kornmann, H. L., Gedde, S. J. Glaucoma management after vitreoretinal surgeries. Current Opinion in Ophthalmology. 27 (2), 125-131 (2016).
- Zhang, J., et al. Silicone oil-induced ocular hypertension and glaucomatous neurodegeneration in mouse. Elife. 8, (2019).
- Kwong, J. M., Caprioli, J., Piri, N. RNA binding protein with multiple splicing: a new marker for retinal ganglion cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 51 (2), 1052-1058 (2010).
- Rodriguez, A. R., de Sevilla Muller, L. P., Brecha, N. C. The RNA binding protein RBPMS is a selective marker of ganglion cells in the mammalian retina. Journal of Comparative Neurology. 522 (6), 1411-1443 (2014).
- Smith, R. S. Systematic evaluation of the mouse eye : anatomy, pathology, and biomethods. , CRC Press. (2002).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
