Yöntem makalesi

Ködal Ven Glukoz Enjeksiyonu ile Parabiyotik Farelerde Ortak Kan Akımının Saptanmasına Neden

8.3K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/60411

⸱

6 Şubat 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, The State-Province Key Laboratories of Biomedicine-Pharmaceutics of China, Key Laboratory of Cardiovascular Research, Ministry of Education, College of Pharmacy, Harbin Medical University, 2Institute of Metabolic Disease, Heilongjiang Academy of Medical Science, 3Department of Pharmacology and Therapeutics, Melbourne School of Biomedical Sciences, Faculty of Medicine, Dentistry and Health Sciences University of Melbourne

Bu makalede

Özet

Burada, en az hasara neden olan ve parabiontlar için ölümcül olmayan bir kaudal ven enjeksiyonu ile iki parabiontun ortak kan dolaşımının başarılı bir şekilde kurulmasını saptamak için yeni bir yöntem açıklıyoruz.

Özet

Parabiyoz, vücudun boylamsal ekseni boyunca iki paralel hayvanı cerrahi olarak birleştirmek için deneysel bir yöntemdir. Parabionlarda kan kimeraizminin başarılı bir şekilde kurulmasını, kaudal ven enjeksiyonu ile tespit etmek için bir protokol sayılmak üzere bir protokol sayılmiyoruz. Parabiyotik fareler inşa edildi. Glikoz donör fareye kuyruk damarı ile enjekte edildi ve kan şekeri seviyesinin dalgalanması her iki farede de farklı zaman noktalarında kan gdolüter kullanılarak ölçüldü. Sonuçlarımız, glukoz enjeksiyonundan sonra donör farelerdeki kan şekeri seviyesinin 1 dk sonra keskin bir şekilde arttığını ve sonrasında yavaş yavaş azaldığını göstermiştir. Bu arada, alıcı farelerin kan şekeri seviyesi enjeksiyondan sonra 15 dk zirveye ulaştı. Benzer sonuçlar, glikoz için pozitif kontrol olarak kullanılan Evans mavisi ile elde edildi. Kan şekeri düzeylerindeki senkron dalgalanma, iki fare arasındaki kan akışının başarılı bir şekilde belirlendiğini gösterir.

Giriş

Parabiyoz, iki canlı organizmanın cerrahi olarak biraraya gelerek ortak dolaşım sistemi1ile tek bir fizyolojik sistem olarak geliştiği bir modelleme yöntemidir. Bu modeller, tek bir bireyin ürettiği maddelerin ortak dolaşım sistemi aracılığıyla her iki hayvan üzerinde aynı anda hareket edebildiği avantajı sayesinde fizyolojiyi incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Parabiyotik deneyler Paul Bert2tarafından öncülük edildi 1800'lerin ortalarından bu yana, parabiyotik modeller oluşturmak için yöntemler standart hale gelmiştir. Ancak, kan kimerizminin başarılı kurulmasını doğrulamak için basit ve uygun bir yöntem eksik olmuştur. Bu çapraz dolaşım başarıyla bir mikroplaka okuyucu ile her iki parabionts kanevans mavi emiciliği ölçümü takip parabionts birinde% 0.5 Evans mavi boya enjekte intraperitoneally enjekte tarafından değerlendirilebilir bildirilmiştir3. Başka bir yöntem cd45.1+içeren belirli bir fare cinsi gerektirir - ve CD45.2+etiketli monositler her parabiont. Hücre sitometrisi daha sonra dalak veya kan dan monositler iki belirteçlerin sıklığını ölçerek kan kimerizm belirlemek için kullanılır4. Ancak, bu yöntemler genellikle hayvanlar için öldürücü veya hantal, ve parabiyotik modellerin hızlı ve güvenilir doğrulama için güvenli ve basit bir yöntem son derece arzu edilir. Bu çalışmada, parabiyozun fare modelinde doğrulanan yeni bir yöntem oluşturduk. Kuyruk damarından alınan kan örneklerindeki glikoz konsantrasyonu bir glucometer kullanılarak ölçülür ve donör ve alıcı farelerdeki glikoz seviyesinin değişim şekli dolaşım kimerizminin bir göstergesi olarak kabul edilir. Bu yönteme "glikoz dalgalanma yöntemi" adını verdik. Bu doğrulama yönteminin uygulanması farelerle sınırlı değildir, ancak glikoz metabolizmasının ciddi disregülasyonu olanlar dışında çeşitli patolojik modellere genişletilebilir. Prosedür basit, zaman kazandırır ve güvenlidir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Hayvanlar la ilgili tüm prosedürler ve bakımı Harbin Tıp Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır.

NOT: Yöntem için gerekli araç ve gereçler Malzeme Tablosu'ndalistelenmiştir.

1. Malzeme ve hayvanların hazırlanması

  1. Standart bir laboratuvar hayvan tedarikçisinden 20 g-25 g arasında ağırlıkla C57BL/6 erkek fareler sipariş imredin.
  2. Fareleri 12 saat ışıklık bir döngü içinde barındırın: 24−26 °C'de 12 saat karanlık, su ve gıdaya reklam libitum erişimi ile.

2. Parabiyoz

  1. 0.1 mL/10 g. konsantrasyonunda 20 g/L 2,2,2-tribromoetanol intraperitoneal enjeksiyon ile fareler anestezi kin gevşemesi, yavaş ve istikrarlı nefes alma, cilt stimülasyon refleks kaybı ve kornea refleks ortadan kalkması ile belirtildiği gibi uygun anestezi doğrulayın.
  2. Kuru gözleri önlemek için bir Q-ucu ile oftalmik merhem uygulayın.
  3. Daha önce açıklandığı gibi parabiyoz prosedürügerçekleştirin 5.
    1. Fareleri supine pozisyonuna getirin. Bir farenin sol tarafını ve diğer farenin sağ tarafını dirsekten yaklaşık 1 cm yukarıdan başlayarak diz den 1 cm aşağıya elektrikli tıraş ile iyice tıraş edin. Tıraşlı ciltteki kürkü tamamen temizlemek için tüy dökücü krem kullanın.
    2. Traş edilen alanları iyodophor ile silin. Fareleri steril bir pedle kaplı ısıtmalı bir pedüzerine yerleştirin.
    3. Her hayvanın traşlı tarafında keskin bir makas kullanarak dirseğin 0,5 cm yukarısından diz ekleminin 0,5 cm altına kadar uzunlamasına deri kesileri oluşturun.
    4. Kesiği hafifçe takiben deriyi deriden deriden subkutan fasyadan ayırın.
    5. Parabiontun olecranon ve diz bağlantısını 3-0'lık bir dikişle bağlayın.
    6. Sürekli 5-0 dikiş ile tıraş lı cildi dikin.
  4. Dehidratasyonu önlemek için her fareye 0,5 mL %0,9 NaCl deri altı enjekte edin.
  5. Ağrıyı dindirmek için her fareye tramadol (10 mg/25 g/gün) enjekte edin.

3. Dolaşım kimerizminin doğrulanması

  1. Glikoz dalgalanma yöntemi
    NOT: Parabiyoz cerrahisinden sonraki 10.
    1. 0.1 mL/10 g konsantrasyonu ile her fareye 20 g/L 2,2,2-tribromoetanol intraperitoneal enjeksiyon ile parabiontize.
    2. Venöz görsel fare kuyruk fiksatöründeki donör fareleri düzeltin.
    3. Kaudal damarları parabiontun kuyruğundan birinin kan kanadında, kuyruğunu temizlemek ve kan damarlarını temizlemek için %70−75 alkolle ıslatılmış bir pamuk topuyla ovun.
    4. Sağ elde glikoz içeren 1,0 mL'lik bir şırınga tutun ve iğneyi damara paralel tutun (15°'den az).
    5. İğneyi kuyruk ucundan yaklaşık 2−4 cm uzaklıkta bir pozisyona yerleştirin.
    6. 10 s içinde donöre 100 μL (1,2 g/kg) glikoz enjekte edin.
      NOT: Donör terimi, kuyruk damarından glikoz enjeksiyonu alan parabiont anlamına gelir. Alıcı doğrudan glikoz almaz diğer parabiont olduğunu.
    7. Iodophor ile ttemiz. Bir makas ile donör ve alıcı farelerin tonlarını kesin ve glikoz enjeksiyonu sonra farklı zaman noktalarında kan bir damla toplamak (1 dk, 5 dk, 10 dk, 15 dk, 20 dk, 30 dk, 40 dk, 50 dk, ve 60 dk). Daha fazla zarar görmesini önlemek için her toplama zaman noktasında kan pıhtısı çıkarın.
      NOT: Toplanan kanın hacmi bir test için 10-25 ul, toplamda 90-225 ul idi.
    8. Glikoz düzeyi tespiti için kanı glucometer test şeritlerinin ortasına damlatın.
  2. Olumlu bir kontrol3olarak Evan mavi Counterstain kullanın.
    1. Donör fareye %0,5 Evan'ın mavi Counterstain intraperitoneally enjekte edin.
    2. 2 saat sonra, 0.2 mL/10 g konsantrasyonu ile her fareye 20 g/L 2,2,2-tribromoetanol intraperitoneal enjeksiyon ile parabiontlar ötenazi ve kardiyak delinme ile her iki parabionttan kan toplamak.
    3. 15 dakika boyunca 916 x g kan örneklerini santrifüj edin.
    4. Supernatant serum toplayın.
    5. Serumu 1:50'de %0.9 NaCl ile seyreltin.
    6. Seyreltilmiş serum örneklerinin emiciliğini 620 nm'de spektrofotometre ile ölçün.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Altı donör farede, kan şekeri seviyesi kuyruk damarından 100 μL (1,2 g/kg) glukoz enjeksiyonundan sonra ortalama 1 dakika 26,5 mol/L'ye (3 artış) yükseldi ve daha sonra kademeli olarak 60 dk'da 13,3 μmol/L'ye düştü. Alıcı farelerde, enjeksiyon dan sonra kan şekeri yavaş yavaş artmış ve 15 dk ile ilk tepe seviyeye ulaşmıştır (G artış, 12.2 μmol/L). Yukarıdaki sonuçlara göre, dolaşım kimerizmi standardı şu şekilde belirlenmiştir: 1) glukoz enjeksiyonundan sonra 1 dakika içinde donör fareler...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Parabiyoz deneysel yollarla ortak bir vasküler sistem kurmak için iki canlı hayvan bağlayan cerrahi tekniği ifade eder6,7,8. Bu modelin avantajı, tek bir birey tarafından üretilen maddelerin her iki hayvanüzerinde aynı anda hareket edebiliyor olmasıdır. Böylece, parabiyoz modeli birçok anlamlı ve yenilikçi sonuçlar üreten, ilgili bir hastalık bir madde veya faktör rolünü keşfetmek için kullanılabilir. Onun büyük uygulama değeri ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81570399 ve 81773735), Çin Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı - Geleneksel Çin Tıbbı Modernizasyon Araştırma projesi (2017YFC1702003) ve Hei Long Jiang tarafından desteklenmiştir. Üstün Gençlik Bilim Fonu (JC2017020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
kavisli forsepsJZ cerrahi aletler, ÇinJ31340
ince makasJZ cerrahi aletler, ÇinWA1030
iğne forsepJZ cerrahi aletler, Çin60017961
2.5 mL şırıngalarAgilent, ABD5182-9642
TribromoethanoSigma-Aldrich, ABDT48402-5G
penisilinSolarbio, ÇinIP0150
tramadolYijishiye, ÇinYJT712520
glukometreRoche Diyabet Bakımı, IndianaAccu-Chek Aktif test şeritleri
Evan'ın mavi CounterstainSolarbio, ÇinG1810
tüy dökücü kremNair, ABDLL9161
Isınma Battaniyesi ( Isıtma yastığı)Kent Scientific Corp, ABDTP-22G
Elektrikli tıraş makinesiCodos, ÇinCP-5000
3-0,5-0
cerrahi sütür		Şangay Tıbbi Sütür İğnesi Fabrikası, ÇinSYZ 3-0 #, SYZ 5-0 #

Kaynaklar

  1. Baruch, K., et al. Aging-induced type I interferon response at the choroid plexus negatively affects brain function. Science. 346 (6205), 89-93 (2014).
  2. Zhang, Y., et al. Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue. Nature. 372 (6505), 425-432 (1994).
  3. Torres, M., et al. Parabiotic model for differentiating local and systemic effects of continuous and intermittent hypoxia. Journal of Applied Physiology (1985). 118 (1), 42-47 (2015).
  4. Loffredo, F. S., et al. Growth differentiation factor 11 is a circulating factor that reverses age-related cardiac hypertrophy. Cell. 153 (4), 828-839 (2013).
  5. Kamran, P., et al. Parabiosis in mice: a detailed protocol. Journal of Visualized Experiments. (80), e50556(2013).
  6. Conboy, M. J., Conboy, I. M., Rando, T. A. Heterochronic parabiosis: historical perspective and methodological considerations for studies of aging and longevity. Aging Cell. 12 (3), 525-530 (2013).
  7. Eggel, A., Wyss-Coray, T. A revival of parabiosis in biomedical research. Swiss Medical Weekly. 144, w13914(2014).
  8. Brack, A. S. Ageing of the heart reversed by youthful systemic factors! EMBO Journal. 32 (16), 2189-2190 (2013).
  9. Wu, J. M., et al. Circulating cells contribute to cardiomyocyte regeneration after injury. Circulation Research. 116 (4), 633-641 (2015).
  10. Kaiser, J. 'Rejuvenation factor' in blood turns back the clock in old mice. Science. 344 (6184), 570-571 (2014).
  11. Rando, T. A., Finkel, T. Cardiac aging and rejuvenation--a sense of humors? New England Journal of Medicine. 369 (6), 575-576 (2013).
  12. Heidt, T., et al. Differential contribution of monocytes to heart macrophages in steady-state and after myocardial infarction. Circulation Research. 115 (2), 284-295 (2014).
  13. McPherron, A. C. Through thick and thin: a circulating growth factor inhibits age-related cardiac hypertrophy. Circulation Research. 113 (5), 487-491 (2013).
  14. Villeda, S. A., et al. Young blood reverses age-related impairments in cognitive function and synaptic plasticity in mice. Nature Medicine. 20 (6), 659-663 (2014).
  15. Katsimpardi, L., et al. Vascular and neurogenic rejuvenation of the aging mouse brain by young systemic factors. Science. 344 (6184), 630-634 (2014).
  16. Starzl, T. E., et al. The lost chord: microchimerism and allograft survival. Immunology Today. 17 (12), 577-584 (1996).
  17. Coleman, D. L. A historical perspective on leptin. Nature Medicine. 16 (10), 1097-1099 (2010).
  18. Salpeter, S. J., et al. Systemic regulation of the age-related decline of pancreatic beta-cell replication. Diabetes. 62 (8), 2843-2848 (2013).
  19. Sheldon, R. D., et al. Gestational exercise protects adult male offspring from high-fat diet-induced hepatic steatosis. Journal of Hepatology. 64 (1), 171-178 (2016).
  20. Martineau, M. G., et al. The metabolic profile of intrahepatic cholestasis of pregnancy is associated with impaired glucose tolerance, dyslipidemia, and increased fetal growth. Diabetes Care. 38 (2), 243-248 (2015).
  21. Wang, F., Liu, Y., Yuan, J., Yang, W., Mo, Z. Compound C Protects Mice from HFD-Induced Obesity and Nonalcoholic Fatty Liver Disease. International Journal of Endocrinology. 2019, 3206587(2019).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Parabiyoz ModeliKan Kimerizminin TespitiKaudal Ven EnjeksiyonuGlukoz Fluktuasyon AnaliziEvans Blue DeneyiKuyruk Ven Kan lasyonuSirk lasyon Do rulamasGlukometre l mSpektrofotometre Absorbans

İlgili makaleler