Yöntem makalesi

Tomurcuklanan Maya SNX-BAR Heterodimers İfade, Arınma ve Lipozom Bağlayıcı

DOI:

10.3791/60413

⸱

6 Aralık 2019

 ,  ,  , 
1Department of Cell Biology, Yale School of Medicine, 2Department of Biological Sciences, University of North Carolina at Charlotte

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, mayada SNX-BAR heterodimerlerinin ifade, saflaştırma ve lipozom bağlanması için bir iş akışı salıyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SNX-BAR proteinleri, endositon sırasında protein ve lipidlerin ayıklanmasında, endozomal sistem içinde ayrıştırma ve otofajide önemli rol oynayan, evrimsel olarak korunmuş membran remodeling proteinleri sınıfıdır. SNX-BAR protein fonksiyonunun merkezinde, yüksek oranda korunmuş foks-homoloji (PX) ve BAR (Bin/Amphiphysin/Rvs) etki alanlarını kullanarak membranları bağlayan homodimer veya heterodimer ler oluşturabilme yeteneği dir. Buna ek olarak, membranlar üzerinde SNX-BAR dimerlerin oliomerizasyonu membran tübülve veziküloluşumunu ortaya çıkarır ve bu aktivitenin endozom kaynaklı taşıyıcılar için kat proteinleri olarak işlevlerini yansıttığı düşünülmektedir. Araştırmacılar uzun sentetik lipozomlar veya dev unilamellar veziküller üzerinde rekombinant SNX-BAR proteinleri kullanarak in vitro bağlama çalışmaları yararlanarak (GUVs) membran remodeling sürücü için gerekli lipidlerin hassas makyaj ortaya çıkarmak için, böylece eylem mekanizması ortaya. Ancak, çift ifade sistemleri ile teknik zorluklar nedeniyle, bakterilerde SNX-BAR protein ekspresyonu toksisitesi, ve bireysel SNX-BAR proteinlerin kötü çözünürlük, bugüne kadar çoğu çalışma snx-BAR homodimers inceledik, bakterilerde ifade sırasında form fizyolojik olmayan dimers dahil. Son zamanlarda, tipik bir bakteriyel ekspresyon sisteminin büyük eksikliklerini aşmak için bir protokol optimize ettik. Bu iş akışını kullanarak, büyük miktarda SNX-BAR heterodimerinin nasıl başarılı bir şekilde ifade edilip arındırılacağı ve bağlama ve tükentme tahlilleri için sentetik lipozomlarda nasıl yeniden oluşturulabileceğimizi gösteriyoruz.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Plazma zarı, endoplazmik retikulum, Golgi aparatı, lizom (maya vakuol) ve endoskopi gibi membrana bağlı organeller ökaryotik hücrenin endomembran sistemini oluşturur. Çoğu organel vezikül taşıyıcıları aracılığıyla diğer organeller ile iletişim ve malzeme alışverişi yeteneğine sahiptir. Hücrenin endoskopi sistemi içinde vezikül taşıyıcılarının ambalajını ve oluşumunu nasıl koordine ettiginin tam olarak anlaşılamamıştır. Ancak, endoskopi sisteminin büyük bir kısmını oluşturan protein ve lipidlerin plazma zarından (PM) endositik veziküllerin içselleştirilmesinden kaynaklandığı bilinmektedir. Endozos bu veziküller için birincil kabul organıdır ve birden fazla birbiriyle b....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Maya Zorlanma İnşaat

  1. TVY614 ile başlayın (pep4Δ::LEU2 prb1Δ::hisG prc1Δ::HIS3)11 ebeveyn zorlanma olarak. Bu suş, hücre lisisi sonrası protein yıkımının çoğunluğuna katkıda bulunan ve bu nedenle daha temiz ve daha verimli bir arınma sağlayan vakuolar proteazlar için eksiktir.
  2. Homolog rekombinasyon kullanarak Atg20 'nin (SNX-BAR ORF 1) C terminusuna tandem afinite saflaştırma (TAP) etiketini tasarlave entegre edin. Entegrasyonları onaylamak için polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) kullanın(Şekil 2).
  3. Uygun tümleştirmeyi onaylamak için T....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, alt akım membran remodeling tahlilleri için kullanılabilecek endojen maya SNX-BAR komplekslerinin tekrarlanabilir ve sağlam üretimi için bir yöntem tanımlamaktadır (Şekil 1). Arınma için kullanılan maya suşunun yapımı, tomurcuklanan mayada homolog rekombinasyon verimliliğinden yararlanarak hedeflenen SNX-BAR'ların genomik locisinde değişiklikleryapılmasını sağlar(Şekil 2). Bu tasarımın iki avantajı vardır, (i) değişi.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, mayada SNX-BAR dimerlerini arındırmak için optimize edilmiş bir iş akışı ve sentetik lipozomlar üzerindeki biyofiziksel özelliklerini değerlendirmek için iki deneme gösteriyoruz. Escherichia coli veya diğer sistemlerde tipik rekombinant protein ekspresyonuna göre en büyük avantaj, SNX-BAR proteinlerini yerli bir konakta eşit olarak ifade edebilme, böylece diğer sistemlerde SNX-BAR'ların arındırılmasında bulunan toksisite ve çözünmezlik sorunlarından kaçınabilme yeteneğidir. Ayrıca sistemimizin moleküler .......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yayında bildirilen araştırma, GM060221 ödül numarası altında Ulusal Sağlık Enstitüleri Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü ve kısmen Ulusal Enstitüler Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü tarafından desteklenmiştir. t32GM007223 ödül numarası altında Sağlık. R.C. kısmen UNC-Charlotte Fakültesi Araştırma Hibe Programı tarafından desteklendi.

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.2 ve mu; m PC MembranlarıAvanti610006
10 mL Poly-Prep Kromatografi kolonu (Bio-Rad)Bio-Rad731-1550
27 G iğneBD Biosciences301629
10K kesmeli Amicon Ultra Santrifüj FiltreAmiconUFC501024
Avestin EmulsiFlex-C3 HomojenizatörAvestinEF-C3
BCA testiPierce23225
Beckman Optima MAX-XP UltrasantrifüjBeckman Coulter393315
Komple Proteaz İnhibitörü KokteylRoche4693116001
DOPCAvanti850375
DOPSAvanti840035
Ergosterol (Sigma)Sigma47130-U Ekstruder
Seti ile Blok 0.2 μ L/1 mLAvanti610000
FEI Tecnai F20 transmisyon elektron mikroskobu (200 kV)
Cam kültür tüpleriVWR47729-570
IgG sefaroz boncuklar (GE Healthcare)GE Healthcare17-0969-01
Mikrolter cam şırıngalarHamilton7637-01
New Brunswick Excella E25EppendorfM1353-0000veya eşdeğeri sallama 30 & derece; C
Ni-NTA Manyetik Agaroz BoncukPierce78605
Optima XE-90 UltrasantrifüjBeckman CoulterA94516
Parafilm MVWR52858-076
PI3PEchelonP-3016veya Echelon eşdeğeri
Polikarbonat şişe montajıBeckman Coulter355622
TLA-100 Sabit Açılı RotorBeckman Coulter343840
Tip 45 Ti RotorBeckman Coulter
Vakum Kurutucu, Soket Valfli Alt ve KapakVWR75871-436
Vakum Pompası Alcatel (Pascal 2005 C1)A& J Köpüktutuculu vakum PN07050
VorteksVWR10153-838
VWR KİTİ MİKROTÜPVWR12620-880

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Teasdale, R. D., Collins, B. M. Insights into the PX (phox-homology) domain and SNX (sorting nexin) protein families: structures, functions and roles in disease. The Biochemical Journal. 441 (1), 39-59 (2012).
  2. Zhang, H., et al.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

SNX BAR HeterodimersYeast ExpressionProtein PurificationLiposome BindingMembrane RemodelingTransmission Electron MicroscopyUltracentrifugationLipid SpecificityProtein QuantificationExtruder Assembly

İlgili makaleler